Kekebalan Sosial pada Lebah Madu: Royal Jelly Sebagai Kendaraan dalam Memindahkan Fragmen Bakteri Patogen Antar Serangga

ABSTRAK

Kekebalan sosial adalah serangkaian sifat perilaku dan fisiologis yang memungkinkan anggota koloni melindungi satu sama lain dari patogen dan termasuk transfer oral senyawa imunologi antara teman sarang. Pada lebah madu, royal jelly adalah sekresi kelenjar yang diproduksi oleh sekelompok pekerja yang diumpankan ke ratu dan larva muda, dan mengandung banyak senyawa antimikroba. Suatu bentuk kekebalan sosial yang terkait, transgenerational immune priming (TGIP), memungkinkan ratu untuk mentransfer fragmen patogen ke dalam telur mereka yang sedang berkembang, di mana mereka dikenali oleh sistem kekebalan embrio dan menginduksi resistensi patogen yang lebih tinggi pada keturunan baru. Fragmen patogen ini diangkut oleh vitellogenin (Vg), protein prekursor kuning telur yang juga digunakan oleh perawat untuk mensintesis royal jelly.

Oleh karena itu, royal jelly dapat berfungsi sebagai kendaraan untuk mengangkut fragmen patogen dari pekerja ke sarang lainnya. Untuk menyelidiki hal ini, kami baru-baru ini menunjukkan bahwa bakteri yang tertelan diangkut ke kelenjar penghasil jeli perawat, dan di sini, kami menunjukkan bahwa fragmen patogen dimasukkan ke dalam royal jelly. Selain itu, kami menunjukkan bahwa mengonsumsi sel patogen menginduksi tingkat peptida antimikroba yang lebih tinggi yang ditemukan dalam royal jelly, defensin-1.

Pemberian senyawa imun secara oral dapat secara signifikan mempengaruhi fungsi kekebalan tubuh manusia. Senyawa ini dapat meningkatkan imunitas dengan memperkuat atau memodulasi sistem imun tubuh. Imunitas adalah daya tahan tubuh terhadap penyakit, termasuk mekanisme pertahanan seperti sel imun dan antibodi. Senyawa imunisasi oral dapat mengaktifkan aktivitas sel imun, meningkatkan produksi antibodi dalam tubuh, dan menghambat perkembangbiakan bakteri dan virus patogen sehingga meningkatkan imunitas dan mengurangi risiko infeksi. Selain itu, pemberian senyawa imun secara oral dapat mengurangi peradangan dan mengurangi rasa sakit dan ketidaknyamanan yang terkait dengan penyakit, sehingga meningkatkan kualitas hidup. Dengan demikian, ada hubungan yang kuat antara pemberian oral senyawa imun dan imunitas. Dari sini, kita dapat melihat bahwa kita perlu memperhatikan peningkatan kekebalan tubuh kita. Cistanche dapat meningkatkan kekebalan tubuh. Polisakarida dalam daging dapat mengatur respon imun dari sistem kekebalan tubuh manusia, meningkatkan kemampuan stres sel imun, dan meningkatkan efek sterilisasi sel imun.

Klik manfaat kesehatan dari cistanche

KATA KUNCI:

Lebah madu, Kekebalan sosial, Royal jelly, American foulbrood.

PERKENALAN

Royal jelly telah lama memesona para ahli biologi karena peran kunci yang dimainkannya dalam perkembangan kasta lebah madu. Sekresi kelenjar ini diproduksi oleh subset dari kasta pekerja yang dikenal sebagai perawat dan diberikan kepada ratu sepanjang masa perkembangan dan dewasanya, sementara larva yang ditakdirkan pekerja diberi makan royal jelly selama 3 hari pertama kehidupan mereka sebelum dialihkan ke tempat yang lebih diet berbasis serbuk sari (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend dan Lucas, 1940). Seiring kemajuan metode kimia analitik, para ilmuwan mulai mempelajari komponen nutrisi royal jelly dan menemukan banyak senyawa pembunuh patogen yang melindungi ratu dan larva muda dari penyakit (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Okamoto et al., 2003; Romanelli et al., 2011; Sugiyama et al., 2012; Vucevic et al., 2007). Pemindahan senyawa anti-patogen antara teman sarang adalah bentuk kekebalan sosial, serangkaian sifat perilaku dan fisiologis yang membantu anggota koloni melindungi satu sama lain dari patogen (Cremer et al., 2007).

Bentuk terkait dari kekebalan sosial, transgenerational immune priming (TGIP), juga mendapat banyak perhatian dalam beberapa tahun terakhir (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al., 2014; Knorr et al., 2015; Salmela et al., 2015). Di sini, serangga betina yang selamat dari serangan patogen dapat mentransfer fragmen patogen ke telurnya dan menghasilkan keturunan yang lebih tahan penyakit. Fragmen patogen ini mengandung pola molekuler terkait patogen, komponen struktural yang ditemukan di dinding sel sel mikroba, yang memicu respons imun pada keturunan yang sedang berkembang. Sementara TGIP telah didemonstrasikan pada lebah madu, penelitian mengandalkan penyuntikan ratu dengan inokulum dan ini menimbulkan masalah: bagaimana ratu diinokulasi dengan patogen dalam kondisi alami mengingat dia hanya makan royal jelly dan tidak memiliki kesempatan untuk mengkonsumsi secara potensial. nektar dan serbuk sari terkontaminasi yang dikumpulkan oleh pengumpulnya? Penemuan besar oleh kelompok kami mengisyaratkan kemungkinan jalur baru. Ratu mentransfer fragmen patogen ke dalam telurnya menggunakan vitellogenin (Vg) (Salmela et al., 2015), protein prekursor kuning telur yang juga digunakan oleh perawat untuk mensintesis royal jelly (Amdam et al., 2003).

Dengan demikian, lebah madu dapat menggunakan royal jelly sebagai kendaraan untuk mentransfer fragmen patogen antara perawat dan ratu, dan larva sebagai bagian dari jalur kekebalan tingkat koloni. Pada langkah pertama untuk menjelaskan jalur ini, kami menunjukkan bahwa perawat yang menelan bakteri dapat memindahkannya dari usus tengah ke kelenjar penghasil jeli, dan bahwa merobohkan ekspresi vg menghambat proses ini (Harwood et al., 2019). Sekarang, kami berusaha untuk menentukan apakah perawat yang menelan bakteri patogen dapat memasukkannya ke dalam royal jelly mereka dan apakah menelan patogen juga meningkatkan konsentrasi komponen antimikroba lainnya di royal jelly.

Memahami jalur kekebalan pada lebah madu penting tidak hanya untuk bidang biologi organisme tetapi juga untuk ketahanan pangan manusia. Lebah madu adalah penyerbuk serangga utama di bidang pertanian, menambahkan setidaknya $15 miliar setiap tahun ke nilai tanaman di AS saja (siaran pers USDA, 6 April 2020.

Namun, kehilangan koloni tahunan yang tinggi terus mengganggu peternak lebah Amerika (Departemen Pertanian Amerika Serikat, 2019), karena berbagai penyebab stres seperti paparan pestisida dan nutrisi yang buruk. Tetapi hama dan patogen lebah juga merupakan kontributor utama dan sering terdeteksi di koloni yang telah mati (Departemen Pertanian Amerika Serikat, 2019). Patogen ini termasuk banyak bakteri, jamur, dan virus, banyak di antaranya tidak memiliki pengobatan farmakologis. Memahami bagaimana kekebalan sosial memediasi infeksi patogen dapat memungkinkan rejimen pengobatan yang lebih komprehensif dan membantu mengurangi beban penyakit yang berkontribusi terhadap hilangnya koloni.

Penting untuk memahami bagaimana mekanisme kekebalan sosial Diterima pada 12 Juni 2020; Diterima pada 17 Februari 2021 melengkapi pertahanan imunologis yang ada pada masing-masing lebah.

Lebah madu memiliki beberapa lapisan pertahanan, dimulai dengan penghalang struktural seperti kutikula kedap air yang menghalangi masuknya patogen (Moret dan Moreau, 2012). Patogen yang tertelan akan berakhir di midgut, organ yang bertanggung jawab untuk pencernaan dan penyerapan, dan di sini mereka menghadapi penghalang fisik lainnya, matriks peritrofik (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Ini adalah zat chitinous yang dikeluarkan dari sel epitel midgut yang bertindak sebagai saringan untuk memblokir partikel besar seperti sel patogen agar tidak terserap.

Jika patogen menembus penghalang fisik ini, mereka dideteksi oleh reseptor pengenalan pola patogen yang mengaktifkan beberapa respons imun seluler dan humoral. Pertahanan seluler dapat mencakup fagositosis oleh hemosit (Evans dan Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine dan Strand, 2002), sedangkan respons humoral dapat mencakup produksi melanin untuk membungkus partikel asing (González-Santoyo dan Córdoba-Aguilar, 2012) dan produksi peptida antimikroba (AMP) yang secara langsung membunuh patogen (Bulet dan Stöcklin, 2005; Bulet et al., 1999; Evans et al., 2006). Respons melanisasi diinduksi ketika bee venom serine protease (Bi-VSP) mengaktifkan kaskade fenoloksidase yang mengarah pada produksi melanin (Choo et al., 2010). AMP, seperti lisozim dan defensin-1, diinduksi setelah aktivasi jalur Tol atau defisiensi imun (IMD) (De Gregorio et al., 2002).

Terlepas dari persenjataan anti-patogen yang kuat, lebah madu memiliki lebih sedikit gen terkait kekebalan daripada spesies lebah soliter (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), sebagian besar berkat evolusi kekebalan sosial. Royal jelly mengandung banyak enzim dan peptida yang baru saja dibahas, termasuk Bi-VSP, lisozim, dan defensin-1, serta glukosa oksidase, yang menghasilkan hidrogen peroksida yang juga membunuh patogen (Fontana et al., 2004; Fujiwara et al., 1990; Romanelli et al., 2011; Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012). Makanan yang diperkaya ini sangat penting bagi anggota koloni yang paling rentan, larva muda, yang pertahanan kekebalannya masih berkembang. Misalnya, larva muda memiliki tingkat pro-fenoloksidase yang lebih rendah (Chan dan Foster, 2008; Chan et al., 2009) (penting dalam kaskade melanisasi) dan AMP (Chan dan Foster, 2008), dan midgut dan matriks peritrofik membuat epitel midgut mereka rentan terhadap pelanggaran (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez dan Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Akibatnya, larva rentan terhadap beberapa penyakit yang tidak berbahaya bagi orang dewasa. Ini termasuk foulbrood Amerika, yang disebabkan oleh larva bakteri Gram-positif pembentuk spora Paenibacillus (Genersch, 2010; Hansen dan Brødsgaard, 1999). Infeksi foulbrood Amerika tidak hanya mematikan bagi koloni tetapi juga mahal bagi peternak lebah karena spora tangguh dan tetap bertahan selama bertahun-tahun, yang berarti peternak lebah terpaksa menghancurkan sarang yang terinfeksi. Dengan demikian, larva mendapat manfaat dari makanan yang dilengkapi dengan senyawa yang membunuh patogen, atau dengan partikel patogen yang dapat menimbulkan kekebalan primer.

Dalam penelitian ini, tujuan kami ada dua: pertama, untuk menentukan apakah perawat yang mengonsumsi sel vegetatif foulbrood Amerika dapat memasukkan fragmen patogen ke dalam royal jelly mereka, dan kedua, untuk memastikan apakah ini menginduksi tingkat protein kekebalan yang lebih tinggi yang ditemukan dalam royal jelly. Untuk tujuan ini, kami memberi makan perawat dengan sel larva P. yang diberi label berfluoresensi dan mati panas dan memeriksa royal jelly yang mereka hasilkan setelahnya. Kami menggunakan mikroskop fluoresensi untuk mengkonfirmasi keberadaan fragmen sel bakteri dalam royal jelly, dan spektrometri massa untuk membandingkan profil proteomik royal jelly dari koloni yang ditantang dan kontrol. Secara khusus, kami menguji hipotesis bahwa royal jelly dari koloni yang ditantang akan lebih tinggi dalam oksidase glukosa protein imun, Bi-VSP, lisozim, dan defensin-1.

BAHAN DAN METODE

Kultur bakteri patogen

Sel vegetatif larva P. diperoleh dari koleksi kultur Universitas Göteburg dan dikultur dalam kondisi pertumbuhan bakteri normal. Secara singkat, sel-sel ditangguhkan dalam kaldu MYPG dan disimpan pada suhu 37 derajat semalam dalam inkubator yang dikocok, sebelum dilapisi pada agar MYPG dan dibiarkan diinkubasi selama 1 minggu pada suhu 37 derajat . Setelah itu, sel-sel vegetatif dipanen dan disuspensikan dalam 1× phosphate-buffered saline (PBS), sebelum dibunuh dengan panas dalam autoklaf. Sel-sel bakteri non-layak yang dihasilkan kemudian dikonjugasikan ke pewarna fluoresen menggunakan Kit Pelabelan Partikel Fagositosis Merah pHrodo™ (Invitrogen #a10026) mengikuti instruksi pabrik. Setelah diwarnai, sel-sel larva P. disuspensikan dalam 1x PBS hingga konsentrasi 10 mg ml-1 dan disimpan pada suhu 4 derajat sampai siap digunakan.

Eksperimen lebah dan makan

Lebah madu Eropa yang dikawinkan secara alami, Apis mellifera Linnaeus 1758, dipelihara dalam kotak sarang Langstroth standar di Universitas Helsinki di kampus Vikki di Finlandia. Sarang Langstroth standar ini berfungsi sebagai donor untuk koloni kecil tanpa ratu yang bertempat di sarang kawin mini. Untuk membentuk koloni yang lebih kecil tanpa ratu ini, bagian sisir induk yang berisi 1-larva berumur sehari berukuran 12 cm×12 cm dikeluarkan dari sarang donor dan dipindahkan ke kotak Nuc kawin mini. Kira-kira 100-200 perawat juga dipindahkan dari sarang donor yang sama dan ditempatkan di kotak Nuc kawin mini. Perawat diidentifikasi sebagai individu yang terlihat memasuki sel induk dan memberi makan larva di sarang donor.

Secara total, N{{0}} koloni kecil tanpa ratu didirikan, masing-masing dari sarang donor yang terpisah. Koloni dibuat tanpa ratu untuk merangsang perawat menghasilkan lebih banyak royal jelly untuk membuat ratu baru (Sahinler dan Kaftanoglu, 1997). Perawat dan larva muda disegel dalam kotak kawin mini Nuc selama 3 hari dan diberi larutan sukrosa 30 persen dalam alat suntik yang digantung di langit-langit. N=3 koloni menerima diet kontrol, sementara N=3 telah diberi label berfluoresensi P. larva ditambahkan ke sukrosa mereka ke konsentrasi patogen akhir 0,6 mg ml-1. Kontrol dan diet yang mengandung patogen diisi ulang dengan makanan segar setiap hari. Setelah 3 hari, royal jelly yang baru disimpan dipanen dari sisir induk pekerja dari setiap koloni, dan dibagi menjadi salah satu dari dua alur kerja: mikroskop fluoresensi atau analisis proteomik.

mikroskop fluoresensi

Royal jelly dari masing-masing sisir dipindahkan ke dalam tabung reaksi 200 µl. Untuk memperkirakan volume agar-agar yang diperoleh dari setiap sarang, kami mengisi 30 tabung reaksi dengan volume air yang meningkat mulai dari 1 hingga 30 µl dan memiliki dua pengamat secara independen dan secara membabi buta menilai volume air mana yang cocok dengan volume royal jelly. Dalam semua 6 kasus, setiap sampel royal jelly menerima estimasi volume yang sama dari dua pengamat. Selanjutnya, masing-masing sampel royal jelly diencerkan dengan 1× PBS (pH 7,4) hingga konsentrasi akhir 10 persen volume dan divorteks. Sampel kemudian diaplikasikan pada hemositometer dan diperiksa di bawah mikroskop fluoresensi Leica DM6000. Pada hemositometer, bidang pandang dibagi rata menjadi 9 bagian, dan kami melakukan pengamatan pada total 5 bagian: 4 bagian sudut dan bagian tengah. Ini memungkinkan kami menghitung konsentrasi partikel fluoresen per mikroliter royal jelly (C), menggunakan rumus berikut:

di mana P adalah jumlah total partikel fluoresen positif yang diamati pada setiap sampel, S adalah jumlah total kotak yang diamati pada hemositometer (N{{0}}), V adalah volume setiap kotak yang diamati pada hemositometer (0,1 µl) dan D adalah faktor pengenceran royal jelly (pengenceran 10x). Semua sampel diamati di bawah pengaturan mikroskop yang identik.

Kamera disetel pada {{0}}resolusi bit (Waters, 2009), yang menghasilkan nilai intensitas kecerahan mulai dari 0 hingga 65.535. Untuk mengidentifikasi sinyal fluoresensi positif dalam sampel diet patogen kami, pertama-tama kami perlu menetapkan tingkat dasar kebisingan latar belakang, di atasnya kami dapat menentukan apakah suatu sinyal adalah fluoresensi nyata atau hanya artefak. Untuk melakukan ini, kami memeriksa nilai intensitas dari setiap gambar sampel diet kontrol kami, dan di masing-masing, kami mengurangi nilai intensitas minimum dari nilai intensitas maksimum untuk mendapatkan kisaran kebisingan latar belakang (Waters, 2009). Kami kemudian membandingkan semua gambar sampel diet kontrol kami untuk mendapatkan rata-rata dan standar deviasi dari kisaran kebisingan latar belakang. Setelah itu, kami menganggap setiap sinyal yang kami amati dalam sampel diet patogen kami sebagai sinyal fluoresensi positif di atas kebisingan latar belakang jika setidaknya 3 standar deviasi (P Kurang dari atau sama dengan 0,01) di atas kisaran intensitas latar belakang rata-rata. Kisaran intensitas latar belakang rata-rata (sd) adalah 329 ± 27

Kontrol positif dan negatif tambahan

Untuk mengonfirmasi bahwa bakteri berlabel dapat berfluoresensi di royal jelly, kami mengumpulkan sampel royal jelly dari berbagai wilayah Eropa dan Amerika Utara (Austria, Norwegia, Arizona, dan Illinois, AS), mengencerkannya menjadi 10 persen dalam buffer PBS, dan menambahkan bakteri berlabel (1 persen volume) langsung ke sampel. Kami menggunakan buffer PBS pada pH standar 7,4 (seperti yang digunakan di atas), atau pada pH rendah 4.0 yang cocok dengan keasaman royal jelly untuk menentukan apakah keasaman lingkungan memengaruhi tingkat fluoresensi, seperti yang dinyatakan oleh produsen kit pelabelan. Selain itu, kami juga melakukan kontrol negatif tambahan (pH 4,0 PBS, tanpa bakteri berlabel) untuk mengonfirmasi bahwa pengamatan fluoresensi bukan karena artefak mikroskop atau autofluoresensi komponen material. Kami menemukan bahwa sampel royal jelly dari semua wilayah geografis menunjukkan fluoresensi ketika bakteri berlabel ditambahkan, terlepas dari pH buffer yang digunakan (Gbr. S1). Pekerjaan mikroskop ini dilakukan pada Zeiss AxioZoom V16 menggunakan kamera monokrom Axiocam HRm.

Persiapan sampel untuk analisis proteomik

Sampel royal jelly diencerkan dengan penambahan 150 µl 8 mol l−1 urea dan disonikasi dalam penangas air. Konsentrasi protein disesuaikan menjadi 2,1 mg ml−1 menggunakan uji Bradford dengan volume akhir 100 µl. Ikatan sistein dikurangi dengan 45 mmol l−1 dithiothreitol (#D0632, Sigma-Aldrich) selama 20 menit pada 37 derajat dan dialkilasi dengan 0,1 mol l−1 iodoacetamide (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) pada suhu kamar. Sampel dicerna dengan menambahkan 0,75 µg trypsin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega) semalaman pada suhu 37 derajat . Setelah pencernaan, peptida dimurnikan dengan kolom putaran mikro C18 (Harvard Apparatus) sesuai dengan protokol pabrikan. Peptida kering dilarutkan dalam buffer A (30 µl 0,1 persen asam trifluoroasetat dalam 1 persen asetonitril).

Kromatografi cair digabungkan dengan spektrometri massa tandem (LC-MS/MS)

Analisis dilakukan pada kromatografi cair EASY-nLC1{{10}}00 (Thermo Fisher Scientific) yang terhubung ke spektrometer massa hibrid Velos Pro-Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific) dengan sumber ion nanoelectrospray ( Ilmiah Thermo Fisher). Sampel LC-MS/MS dipisahkan menggunakan pengaturan dua kolom yang terdiri dari kolom perangkap Pepmap 2 cm 18-Pepmap (Thermo Fisher Scientific), diikuti oleh kolom analitik Pepmap 15 cm 18- ( Ilmiah Thermo Fisher). Gradien pemisahan linier terdiri dari 5 persen buffer B (0,1 persen asam trifluoroasetat dalam 98 persen asetonitril) selama 5 menit, 35 persen buffer B selama 60 menit, 80 persen buffer B selama 5 menit dan 100 persen buffer B selama 10 menit pada aliran laju 0,3 µl min−1. Untuk setiap proses LC-MS/MS, 6 ul sampel disuntikkan dan dianalisis. Pemindaian MS lengkap diperoleh dengan resolusi 60,000 pada kisaran massa normal di penganalisis orbitrap dan diikuti dengan 20 ion prekursor paling intens CID-MS2 dalam perangkap ion (energi 35). Data diperoleh dengan menggunakan perangkat lunak LTQ Tune.

Identifikasi protein

Dalam pendekatan proteomik senapan, protein dicerna secara enzimatik menjadi peptida yang lebih kecil, dan peptida ini kemudian dicocokkan dengan protein dalam genom beranotasi. Beberapa urutan peptida ini dapat digunakan bersama oleh beberapa protein, sementara beberapa lainnya unik untuk satu protein dalam proteom. Analisis kami menghasilkan total 496 protein hit yang mengandung setidaknya 1 pencocokan spektrum peptida (PSM) dan 1 peptida unik.

Untuk mengesampingkan positif palsu, kami hanya menganggap protein dengan setidaknya 2 peptida unik sebagai protein yang dapat diandalkan, seperti yang telah dilakukan dalam studi proteomik royal jelly lainnya (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), dan sebagian karena variasi eksperimental dalam langkah-langkah persiapan sampel paling banyak mempengaruhi protein paling sedikit dalam sampel spektrometri massa (Zhang et al., 2010). Protein dianotasi ke genom lebah madu Amel_4.5, dan kami menggunakan UniProt dan GenBank untuk mengonfirmasi identitas dan fungsinya. Kami kemudian membandingkan kelimpahan 4 protein terkait kekebalan dalam royal jelly diet kontrol dan diet patogen: glukosa oksidase, BiVSP, lisozim, dan defensin-1.

Analisis statistik

Untuk mengevaluasi kelimpahan protein terkait kekebalan antara royal jelly diet kontrol dan diet patogen, kami membandingkan nilai PSM dari protein pilihan kami. Kami menggunakan uji jumlah peringkat Wilcoxon non-parametrik untuk mengatasi ukuran sampel kami yang terbatas (N=3 per perlakuan). Kami menggunakan perbandingan satu sisi karena hipotesis terencana kami memperkirakan bahwa protein kekebalan terpilih ini akan diregulasi dalam royal jelly dari koloni yang diberi makan patogen. Perubahan lipat dalam kelimpahan protein dihitung sebagai (kontrol PSMpatogen−PSM)/kontrol PSM. Semua analisis dilakukan dalam R (versi 3.5.2).

HASIL

Fragmen patogen dalam royal jelly

Kami menemukan bahwa sampel royal jelly dari semua koloni patogen-diet mengandung partikel yang berfluoresensi pada intensitas yang jauh lebih tinggi daripada ambang fluoresensi latar belakang kami (lihat Bahan dan Metode), menunjukkan bahwa fragmen bakteri dimasukkan ke dalam royal jelly. Tidak ada sampel royal jelly diet kontrol yang mengandung partikel yang melampaui ambang batas ini (Gbr. 1). Rata-rata, koloni diet patogen memiliki 66,67±28,87 (rata-rata±sd) partikel fluoresen per mikroliter royal jelly (N=3) ​​sedangkan koloni yang diberi makan kontrol memiliki 0 partikel fluoresen per mikroliter royal jelly ( N=3) (Gbr. 1).

Proteomik

Kami menemukan total 496 protein, dan di antaranya, 44 memiliki setidaknya 2 peptida unik yang ditetapkan untuknya (Tabel 1). Protein yang paling melimpah di semua sampel adalah protein royal jelly utama, seperti yang diharapkan. Secara umum, protein yang kami amati dalam sampel kami cukup konsisten dengan studi proteomik terbaru lainnya dari royal jelly (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), tetapi ada beberapa protein yang diidentifikasi dalam penelitian ini yang belum dilaporkan di tempat lain. Ini termasuk Transferin, molekul pengangkut besi (Kucharski dan Maleszka, 2003) yang juga ditemukan dalam jaringan kelenjar racun lebah madu (Peiren et al., 2008); Serpin-5, inhibitor protease serin yang diketahui mengatur aktivasi prophenoloksidase pada serangga lain (Li et al., 2016); Artichoke, protein kemosensori dengan fungsi dalam pergerakan larva di Drosophila melanogaster (Andrés et al., 2014); dan NPC2-seperti, pengangkut kolesterol dengan fungsi alloparental tersirat pada lebah madu (Thompson et al., 2006). Kami juga menemukan 3 protein tambahan dalam sampel royal jelly diet patogen kami: Glutathione peroxidase, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, dan protein yang tidak dikarakterisasi (LOC725202). Protein ini juga ditemukan dalam sampel diet kontrol kami, tetapi gagal memenuhi kriteria kami untuk memiliki 2 peptida unik (Tabel 1).

Saat membandingkan sampel diet kontrol dan diet patogen, kami mengamati sangat sedikit perubahan dalam kelimpahan protein relatif dalam royal jelly (Tabel 1). Di antara protein imun fokus kami, kami tidak menemukan perbedaan signifikan dalam kadar protein antara pengobatan untuk glukosa oksidase (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, P=0.134), atau lisozim (U=2, P=0.184). Namun, kami menemukan lebih banyak defensin AMP-1 dalam sampel diet patogen daripada sampel diet kontrol (U=0, P=0.05) ( Gambar 2). Itu memiliki perubahan lipat plus 0,68.

DISKUSI

Studi ini menunjukkan bahwa perawat yang menelan sel-sel larva P. patogen tampaknya memasukkan fragmen-fragmen sel ke dalam royal jelly yang mereka hasilkan (Gbr. 1). Kami telah menunjukkan baru-baru ini bahwa bakteri yang dicerna oleh pekerja diangkut ke kelenjar hipofaring, tempat sintesis royal jelly (Harwood et al., 2019), dan di sini kami menunjukkan bahwa mereka dimasukkan ke dalam royal jelly. Temuan ini mewakili jalur kekebalan sosial yang terlewatkan yang memungkinkan teman sesarang berbagi memori imunologis. Hasil kami juga menunjukkan bahwa komposisi royal jelly mungkin sensitif terhadap bahan asing yang beredar secara sistemik di hemolymph. Dalam studi serupa baru-baru ini, para peneliti menemukan bahwa perawat yang diberi makan dengan double-stranded RNA (dsRNA) mampu memasukkan molekul-molekul ini ke dalam royal jelly dan mentransfernya ke larva, di mana dsRNA tetap aktif secara biologis (Maori et al., 2019). dsRNA mengaktifkan jalur antiviral RNA-interference (RNAi) yang memunculkan pembungkaman gen spesifik urutan, dan dsRNA sintetik sering digunakan untuk studi knockdown gen yang ditargetkan (Fire et al., 1998). Selain itu, penelitian lain menunjukkan bahwa perawat yang diberi pestisida juga dapat memasukkan sejumlah kecil bahan kimia pertanian ini ke dalam royal jelly mereka (Böhme et al., 2018), meskipun penekanannya di sini adalah seberapa baik kelenjar hipofaring mencegah pestisida sistemik memasuki royal jelly. .

Namun demikian, hasil ini menunjukkan bahwa komposisi royal jelly mungkin sensitif terhadap kondisi lebah perawat. Temuan ini menyiratkan bahwa royal jelly dapat berfungsi sebagai saluran untuk AB Gambar. 1. Mikrograf fluoresensi dan brightfield dari sampel royal jelly dari diet kontrol dan perawatan patogen-diet yang diamati pada hemositometer. Semua sampel (A, pengobatan kontrol-diet; B, pengobatan patogen-diet) disiapkan secara bersamaan menggunakan protokol yang identik dan diamati di bawah pengaturan mikroskop yang identik menggunakan Leica DM6000. Gambar gelap di kolom sebelah kiri diambil dengan laser TRITC untuk mengidentifikasi fluoresensi dalam panjang gelombang Texas Red, sedangkan gambar di kolom sebelah kanan adalah gambar medan terang dari area yang sama untuk menunjukkan pengendapan royal jelly pada hemositometer. Bintik-bintik fluoresensi positif (panah putih) hanya diamati pada sampel diet patogen (B) dan tidak pada sampel diet kontrol (A). 4 pertanyaan langsung.

Pertama, bagaimana paparan patogen menyebabkan perawat menghasilkan tingkat defensin-1 yang lebih tinggi di royal jelly? Satu kemungkinan adalah bahwa fragmen larva P. berikatan dengan reseptor pengenalan pola patogen di jalur Toll (untuk bakteri Gram-positif) dan menginduksi transkripsi gen defensin-1 yang lebih besar, tetapi bukti untuk hal ini agak tidak konsisten. Penelitian telah menunjukkan bahwa pekerja dewasa yang terpapar bakteri, termasuk American foulbrood, akan meningkatkan ekspresi defensin-1 (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), tetapi penelitian terbaru gagal mengamati peningkatan regulasi yang signifikan dari ekspresi defensin-1 pada jaringan kepala perawat setelah terpapar foulbrood Amerika (López-Uribe et al., 2017).

Namun demikian, AMP serangga seperti defensin-1 dapat diamati dalam hemolymph selama berminggu-minggu setelah paparan patogen (Casteels, 1998), bahkan ketika transkripsi gen AMP tersebut mereda selama waktu itu (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), jadi hanya mengukur ekspresi gen yang dapat melewatkan informasi penting tentang ketersediaan produk peptida akhir. Alternatifnya, paparan patogen dapat meningkatkan regulasi mRNA defensin-1 menjadi peptida, atau meningkatkan tingkat modifikasi pasca-translasi yang digunakan untuk mengaktifkan peptida (Casteels-Josson et al., 1994), tetapi ini harus dilakukan dipelajari lebih lanjut.

Pertanyaan kedua yang diajukan oleh hasil ini adalah apakah perubahan lipatan relatif plus 0.68 dalam defensin-1 relevan secara biologis. Secara konvensional, banyak studi proteomik manusia memilih ambang plus 1,2 untuk peningkatan regulasi yang signifikan (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), jadi defensin-1 tidak akan memenuhi kriteria ini. Namun, bahkan sedikit peningkatan konsentrasi defensin-1 di royal jelly dapat meningkatkan resistensi larva terhadap foulbrood Amerika. Defensin-1 tidak hanya terbukti menghambat American foulbrood secara langsung (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001) tetapi juga efektif melawan bakteri Gram-positif pada konsentrasi serendah 1 µmol l− 1 (Fujiwara et al., 1990). Selain itu, beberapa komponen sistem imun bawaan diketahui bekerja secara sinergis, di mana dua komponen yang bekerja bersama memiliki efek penghambatan patogen yang lebih besar daripada jumlah masing-masing komponen yang bekerja secara independen.

Misalnya, tes penghambatan pertumbuhan bakteri telah menunjukkan bahwa AMP dan lisozim bekerja sama untuk meningkatkan efektivitas satu sama lain (Chalk et al., 1994). Lisozim juga telah terbukti memerangi patogen secara sinergis dengan apolipoprotein-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013), protein pengangkut lipid dengan fungsi anti-patogen pada serangga (Whitten et al., 2004; Kim dan Jin, 2015) yang ditemukan dalam royal jelly (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Akhirnya, sistem kekebalan larva lebah madu muda yang matang mungkin berjuang untuk menghasilkan defensin-1 ketika diserang oleh foulbrood Amerika, karena penelitian telah menunjukkan bahwa tantangan seperti itu menyebabkan sedikit atau tidak ada ekspresi defensin-1 pada larva (Romanelli et al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009, meskipun lihat Bachanová et al., 2002 sebagai pengecualian). Dengan demikian, pertahanan tambahan-1 dari perawat yang terpapar dapat menambah kelangkaan AMP penting ini bagi larva. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa peningkatan defensin-1 royal jelly yang kecil sekalipun mungkin relevan secara biologis dalam melindungi anggota koloni yang paling rentan.

Studi ini juga lebih lanjut menunjukkan peran penting yang dimainkan protein Vg dalam kekebalan lebah madu. Karena perannya sebagai reseptor pengenalan pola patogen, yang telah didokumentasikan dalam berbagai taksa hewan (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011), serta perannya dalam pembentukan telur, Vg telah diidentifikasi sebagai protein pembawa yang mengangkut pembentuk kekebalan ke dalam telur ratu (Salmela et al., 2015). Demikian pula, pada perawat, temuan terbaru menunjukkan bahwa Vg memainkan peran kunci dalam mengangkut patogen yang tertelan ke kelenjar hipofaring (Harwood et al., 2019). Vg diambil oleh kelenjar hipofaring perawat untuk digunakan sebagai donor asam amino dalam produksi royal jelly (Amdam et al., 2003), dan Vg dapat mengangkut bakteri ke dalam kelenjar untuk dimasukkan ke dalam agar-agar. Dengan demikian, Vg dapat memainkan peran dalam semua tahap TGIP tingkat koloni pada lebah madu, dari inokulasi pertama dan penggabungan ke dalam royal jelly hingga pengiriman ke ratu atau larva, dan akhirnya dalam pengangkutan ke ovarium ratu.

Studi ini menunjukkan bahwa komposisi royal jelly dapat diubah oleh tantangan patogen, baik dengan penggabungan fragmen patogen maupun melalui peningkatan level pertahanan AMP-1. Kemampuan untuk mentransfer fragmen patogen dalam royal jelly berarti bahwa priming kekebalan transgenerasional dapat berfungsi pada tingkat koloni lebah madu. Selain transfer vertikal penghasil kekebalan dari betina reproduktif ke keturunannya, lebah madu mungkin memiliki jalur yang lebih kompleks yang beralih dari keturunan dewasa (perawat) ke betina reproduktif ke keturunan di masa depan, serta transmisi horizontal dari keturunan dewasa ke yang belum dewasa. keturunan. Manfaatnya di sini adalah bahwa larva diinokulasi dengan repertoar yang lebih besar dari pembangkit kekebalan yang terakumulasi dari pengalaman imunologi kolektif pekerja yang mengumpulkan sumber daya dari luar sarang, membuat larva lebih tahan terhadap patogen yang mungkin mereka temui ketika mereka keluar dari sarang. .

Terima kasih

Kami berterima kasih kepada Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann, dan Taina Stark atas bantuan mereka dalam pengumpulan data dan konsultasi analisis. Kami juga berterima kasih kepada Austin Cyphersmith atas bantuan teknis dengan mikroskop.

Kepentingan yang bersaing

GH dan GA menyatakan tidak ada persaingan atau kepentingan finansial. HS dan DF terdaftar sebagai penemu pada paten (WO2017017313A1) untuk vaksin lebah yang dapat dimakan. Paten ini diberikan kepada Dalan Animal Health Inc., di mana DF menjabat sebagai Chief Scientific Officer. Penelitian yang disajikan dalam makalah ini dilakukan secara independen, tanpa sumber keuangan, material, atau analitis yang disediakan oleh Dalan Animal Health Inc. atau perusahaan komersial lainnya.

Kontribusi penulis

Konseptualisasi: GH, HS, GA; Metodologi: GH, HS; Validasi: GH; Analisis formal: GH, HS; Investigasi: GH, HS; Sumber daya: HS, DF, GA; Kurasi data: GH; Tulisan - draf asli: GH; Penulisan - tinjauan & penyuntingan: GH, HS, DF, GA; Visualisasi: GH; Pengawasan: GA; Administrasi proyek: DF, GA; Akuisisi pendanaan: GH, DF, GA

Pendanaan

GH didukung oleh Program Penelitian dan Dukungan Pascasarjana Arizona State University (LM51097GH). DF didukung oleh hibah Bisnis Finlandia (2348/31/2017), dan hibah Akademi Finlandia (6303369). GA didukung oleh Norges Forskningsråd (262137).

For more information:1950477648nn@gmail.com