Latihan Fisik Menghambat Pembentukan Fibrosis pada Penyakit Alzheimer Ginjal Mempengaruhi Jalur Pensinyalan TGFB

{0}}

PENGANTAR 

Penyakit Alzheimer (AD) adalah bentuk paling umum dari demensia, tetapi penampilan sistemiknya baru mulai dibahas dalam beberapa dekade terakhir. Meskipun upaya besar telah dilakukan untuk mengembangkan obat dan terapi modifikasi penyakit, tidak ada prosedur kuratif yang tersedia hingga saat ini [1-3]. Pembentukan plak amiloid dan fungsi abnormal dari prekursor protein amiloid (APP) dianggap sebagai tanda pertama penyakit tidak hanya di sistem saraf pusat (SSP) tetapi juga di perifer [4]. Bukti yang meyakinkan mendukung peran penting amiloid-B (AB) dalam patogenesis AD [5] menunjukkan bahwa penurunan pembersihan AB adalah salah satu proses kunci dalam patomekanisme. Pada AD, beberapa organ perifer terlibat seperti testis [5], pankreas [6], danginjal[7], menyoroti perkembangan penyakit sistemik yang kompleks dengan beberapa target [8]. Telah terbukti bahwaginjalterlibat dalam pembersihan AB [9]. Selain itu, konsentrasi serum AB meningkat secara signifikan pada penyakit kronispenyakit ginjal (CKD) pasien [10, 11]. Akumulasi AB juga telah ditunjukkan padaginjal[12], menyebabkan gangguan filtrasi. Filtrasi yang tepat sebagian diatur oleh transformasi faktor pertumbuhan B (TGFB), yang merupakan sitokin utama dalam patogenesisginjalinflamasi dan fibrosis [13], dan juga dikenal sebagai faktor penting dalam patogenesis AD [14]. Pada AD, pensinyalan TGFB berperan dalam aktivasi mikroglial dan proteksi saraf yang dimediasi astrosit [15]. Selain itu, ekspresi TGFB yang berubah juga mempengaruhi peradangan pada SSP dan jaringan perifer [13, 16].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN PENYAKIT GINJAL/GINJAL

TGFB memiliki tiga isoform: TGFB1, TGFB2, dan TGFB3 [17]. TGFB1 mengambil bagian dalam beberapa proses seperti perkembangan janin, kontrol pertumbuhan dan diferensiasi sel, fibrosis dan pembentukan jaringan parut, pertumbuhan tumor, dan respon imun. Ini adalah sitokin penting dalam pembentukan fibrosis di berbagai organ seperti hati danginjal[19]. TGFB1 membentuk dimer, yang pertama mengikat reseptor TGFB tipe II (TGFRII), kemudian mengaktifkan reseptor TGFB tipe I (TGFRI) Ser/Thr kinase, memulai pembentukan kompleks sinyal intraseluler dari faktor transkripsi Smad. Dalam jalur pensinyalan TGFB kanonik, faktor transkripsi Smad2/3 difosforilasi dan, setelah pembentukan kompleks dengan Smad4, mentranslokasi ke dalam nukleus [20]. Beberapa gen dapat dipengaruhi oleh aktivasi TGFB1 karena menginduksi ekspresi kolagen yang berbeda, mengontrol proliferasi sel, mempengaruhi apoptosis [20] dan mengatur ekspresi matriks metaloproteinase (MMP) [21]. Jalur pensinyalan TGFB non-kanonik memulai aktivasi MAPKes oleh fosforilasi yang pada gilirannya dapat menginduksi ekspresi TGFB lebih lanjut [22]. JNK dan p38 kinase sebagai target TGFB diidentifikasi dalamginjalfibrosis dan mengatur apoptosis [23].

Aktivitas fisik telah terbukti memberikan efek menguntungkan pada pasien manusia. Berolahraga dapat mengatur dan menunda manifestasi AD [24, 25] dan pengurangan biomarker AD seperti tau dan AB dalam plasma juga telah dilaporkan [25]. Aktivitas fisik telah ditemukan untuk mengurangi kejadian AD, beban neuropatologis terkait AD, dan penurunan kognitif [26]. Meskipun banyak penelitian telah dipublikasikan tentang manfaat aktivitas fisik pada pembentukan AD [27], mekanisme intraseluler yang terlibat dalam efek positif ini belum dibahas secara rinci. Ada beberapa model hewan di mana tikus yang dimodifikasi secara genetik dengan ekspresi berlebih tau dan AB telah diuji selama latihan fisik. Dalam model ini, telah terbukti bahwa peningkatan aktivitas fisik mampu menunda manifestasi AD [28, 29]. Lebih lanjut, ditunjukkan bahwa pelatihan jangka panjang pada tikus-tikus ini memiliki efek positif pada disfungsi organ perifer pada DA. Aktivitas fisik mengubah crosstalk PACAP-BMP di ADginjalmelalui normalisasi ekspresi kolagen tipe IV dan akumulasi A [30]. Selain itu, analisis rinci tentang fungsi pelindung pelatihan ekspresi Sox9 pada testis AD telah diterbitkan [31]. Pelatihan aktif juga memengaruhi pensinyalan TGFB karena menekanginjalperadangan dan fibrosis berikutnya [32]. Selain itu, TGFB dan pensinyalannya penting untuk remodeling tulang dewasa yang terganggu padaginjalfibrosis [33]. Selanjutnya, hipotesis utama kami adalah bahwa pelatihan fisik jangka panjang memiliki efek sistemik pada pensinyalan TGFB yang dapat mengaturginjalproduksi matriks di AD. Perubahan jalur pensinyalan ini dapat mengakibatkan penurunan ginjalfibrosis dan menormalkan pembersihan AD. Oleh karena itu, tujuan kami adalah untuk menjelaskan hubungan antara pensinyalan TGFB dan efek menguntungkan dari pelatihan fisik padaginjalfibrosis pada AD. Dalam percobaan kami, kami menyajikan bukti bahwa pelatihan jangka panjang memiliki efek langsung pada sinyalisasi TGFB diginjaltikus AD. Selanjutnya, kami menunjukkan bahwa peningkatan latihan fisik menurunginjalfibrosis melalui normalisasi sinyal TGFB kanonik dan non-kanonik.

Kata kunci:penyakit Alzheimer, fibrosis, aktivitas fisik, Smad, penyakit ginjal; ginjal

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN GINJAL / RENAL DIALYSIS

BAHAN DAN METODE

SatwaTikus Alzheimer-transgenik (n=5) (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9)85Dbo/J) jantan digunakan untuk mengikuti efek AD. Wild type (WT) berumur tiga bulan (tanpa modulasi transgenik dan tanpa pelatihan) (n=5), tikus transgenik Alzheimer (AD) (n=5), dan AD terlatih (TAD) (n=5) tikus disimpan di bawah siklus terang / gelap 12/12 jam dengan makanan dan air ad libitum. Interval treadmill running diterapkan untuk kelompok latihan dan gabungan. Sebelumnya semua hewan yang berolahraga dibiasakan dengan treadmill yang digerakkan motor (Columbus Inst., Columbus Ohio, USA) dan kecepatan lari selama 2 minggu. Pelatihan dilakukan empat kali seminggu, selama 60 menit. Setiap sesi latihan berlangsung 10 siklus, setiap siklus terdiri dari 4 menit lari intensitas tinggi dan 2 menit lari intensitas rendah. Kecepatan lari intensitas rendah bersifat permanen selama percobaan yang berarti kecepatan 10 m/menit. Sedangkan kecepatan lari intensitas tinggi dimulai dari 16 m/menit dan dinaikkan setiap minggu ketiga dengan tercapainya 1 m/menit hingga 20 m/menit. Kelompok Kontrol dan Nutrisi juga dibiasakan dengan treadmill dan tinggal di sana selama 5 menit/hari pada treadmill berdiri [28]. Eksperimen dimulai dengan hewan berusia 3-bulan dan diakhiri pada usia 10 bulan. Penelitian dilakukan sesuai dengan pedoman etik (nomor izin etik untuk penelitian ini: PEI/001/2105-6/2014, Semmelweis University, Hungaria). Kit PCR Langsung Jaringan Hewan Phire digunakan untuk genotipe hewan (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik.

Morfologi mikroskopis cahayaSetelah semua tes kognitif selesai, tikus berumur {{0}} bulan dibius dengan injeksi ketamin intraperitoneal (Richter, konsentrasi: 100 mg/ml)/xylazine (Produlab Pharma, konsentrasi: 20 mg/ ml) koktail dalam dosis 0,1 ml/10 g berat badan dan perfusi transkardial dengan salin es dingin heparin [28] danginjaltelah dihapus. Sampel jaringan dicuci dalam PBS tiga kali dan difiksasi dalam campuran 4:1 etanol absolut dan 40 persen formaldehida, kemudian dibenamkan dalam parafin. Untuk pewarnaan trichrome Masson (Sigma-Aldrich, MO, USA) bagian serial dibuat dan jaringan fibrotik divisualisasikan. Protokol pewarnaan dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik. Kamera DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) pada mikroskop Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengambil fotomikrograf.

Imunohistokimiadilakukan padaginjalsampel jaringan dari tikus WT, AD, dan TAD untuk memvisualisasikan lokalisasi Smad2, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), dan kolagen tipe I (Col. I) [30].Ginjaldifiksasi dalam campuran 4:1 etanol absolut dan 40 persen formaldehida dan dicuci dalam etanol 70 persen. Setelah embedding bagian serial dibuat, deparafinisasi diikuti dengan pembilasan dalam PBS (pH 7,4). Situs pengikatan non-spesifik diblokir dengan 1 persen albumin serum sapi yang dilarutkan dalam PBS (Amresco LLC, Solon, OH, USA). Bagian diinkubasi dengan poliklonal Smad2 (Sigma-Aldrich, MO, USA) pada pengenceran 1:500, PCNA (Pensinyalan Sel, Danvers, MA, USA) pada pengenceran 1:800 atau Kol. I (Sigma-Aldrich, MO, USA) antibodi pada pengenceran 1:500 pada 4◦C semalam. Antibodi primer divisualisasikan dengan penambahan antibodi sekunder anti-kelinci Alexa Fluor 555 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) digunakan pada pengenceran 1:1000. Sampel dipasang di media pemasangan Vectashield (Vector Laboratories, Peterborough, Inggris) yang mengandung DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) untuk pewarnaan DNA nuklir. Anti-kelinci Alexa Fluor 555 digunakan tanpa antibodi utama untuk kontrol negatif. Fotomikrograf diambil menggunakan kamera DP74 (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) pada mikroskop Olympus Bx53 (Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) untuk visualisasi Kol. I. Gambar diperoleh menggunakan perangkat lunak cellSense Entry 1.5 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Jepang ) dengan pengaturan kamera konstan untuk memungkinkan perbandingan intensitas sinyal fluoresen FL. Untuk deteksi Smad2 dan PCNA, digunakan mikroskop confocal Olympus FV3000 (Olympus Co. Tokyo, Jepang) dengan menerapkan objektif perendaman minyak 60x (NA: 1,42). Untuk eksitasi, garis laser 543 nm digunakan. Waktu piksel rata-rata adalah 4Bs. Seri gambar Z dengan ketebalan optik 1m direkam dalam mode pemindaian berurutan. Gambar Alexa555 dan DAPI di-overlay menggunakan software Adobe Photoshop versi 10.0. Kontras gambar sama-sama meningkat tanpa mengubah pengaturan konstan.

Analisis RT-PCRGinjaldari WT (n=5), AD (n=5), dan TAD (n=5) digiling secara mekanis dan dilarutkan dalam Tri zol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ), setelah 30 menit inkubasi pada 4◦C dan total RNA diisolasi [30]. RNA dipanen dalam air bebas RNase dan disimpan pada -70◦C. Kit RT Kapasitas Tinggi digunakan untuk transkripsi balik (Biosistem Terapan, Kota Foster, CA, AS). Untuk urutan pasangan primer yang diterapkan dan detail reaksi berantai polimerase, lihat Tabel 1. Amplifikasi dilakukan dalam siklus termal (Labnet MultiGene™ 96-well Gradient Thermal Cycler; Labnet International, Edison, NJ, USA) sebagai berikut: 95◦C, 2 menit, diikuti oleh 35 siklus (denaturasi, 94◦C, 30 detik, annealing selama 45 detik pada suhu optimal seperti yang diberikan pada Tabel 1; ekstensi, 72◦C, 90 detik) dan kemudian 72◦C ,

7 menit Aktin digunakan sebagai pengendalian internal. Produk PCR dianalisis menggunakan 1,2 persen gel agarosa yang mengandung etidium bromida dan didokumentasikan dengan sistem geldokumetary FluorchemE (ProteinSimple, CA, USA). Densitas optik dari sinyal produk PCR ditentukan dengan menggunakan freeware ImageJ 1,40 g. Sebelum pengukuran densitas optik, kami melakukan kalibrasi individual pada setiap fotomikrograf. Kemudian kami meningkatkan perbesaran foto untuk mencapai ukuran piksel individual dan dengan metode tangan bebas, jalur dilingkari dengan tepat dan mengukur kepadatan terpadu area tersebut. Piksel diukur dalam 5 percobaan independen oleh 3 operator independen. Sinyal pertama-tama dibandingkan dengan aktin WT untuk perbandingan perbedaan ekspresi yang lebih baik pada tikus AD dan TAD. Angka di bawah jalur menunjukkan analisis statistik eksperimen di mana setiap eksperimen terpisah (setidaknya 5) dinormalisasi untuk sinyal aktinnya sendiri dan kemudian perbedaan statistik dihitung.

Analisis Western blot

Ginjaltikus WT (n {{{0}}), AD (n=5), dan TAD (n=5) dicuci dalam garam fisiologis N dan disimpan pada -7{{1 0}}◦C. Sampel digiling secara mekanis dalam nitrogen cair dan dikumpulkan dalam 100mL homogenisasi penyangga RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) (150 mM natrium klorida; 1,0 persen NP40, 0,5 persen natrium deoksikolat; 50 mMTris, pH 8,0) yang mengandung protease inhibitor (Aprotinin ( 10 g/mL), 5 mM Benzamidine, Leupeptin (10ug/mL), Inhibitor tripsin (10 g/mL), 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 8 mM NaFluoride, 1 mM Na-orthovanadate). Pelet disonikasi dengan ledakan berdenyut selama 30 detik pada 40 A (ColeParmer, IL, USA). Total lisat sel untuk analisis westernblot disiapkan [30]. 20 g protein dipisahkan dalam 7,5 persen gel SDS-poliakrilamida untuk mendeteksi TGF-1, TGF R1, TGF-R2, Smad2, Smad3, ERK1/2, P-ERK1/2, p38, P-p38,

JNK, PP2A, PP2B, p21, PCNA, Cleaved caspase3, MMP9, kolagen tipe I (Kol. I), dan aktin. Kit deteksi PhosphoSer/Thr (Millipore, Billerica, MA, USA) digunakan untuk mendeteksi tingkat fosforilasi rantai samping asam amino Ser/Thr. Protein diblot ke membran nitroselulosa dan diekspos ke antibodi primer semalaman pada suhu 4◦C dalam pengenceran seperti yang diberikan pada Tabel 2. Inkubasi diikuti dengan pencucian PBST selama 30 menit kemudian membran ditutupi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase IgG antirabbit dalam 1 :1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) atau IgG anti-tikus dalam pengenceran 1:1500 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Untuk mendeteksi chemiluminescence yang ditingkatkan (Advansta Inc., Menlo Park, CA, USA) digunakan sesuai dengan instruksi dari pabriknya. Aktin digunakan sebagai pengendalian internal. Sinyal ditangkap dengan kamera yang didinginkan pada sistem dokumenter gel (Fluorchem E, ProteinSimple, CA, USA). Densitas optik dari sinyal diukur dengan menggunakan freeware ImageJ 1.40g. Sebelum pengukuran densitas optik, kami melakukan kalibrasi individual pada setiap fotomikrograf. Kemudian kami meningkatkan perbesaran foto untuk mencapai ukuran piksel individual dan dengan metode tangan bebas, jalur dilingkari dengan tepat dan mengukur kepadatan terpadu area tersebut. Piksel diukur dalam 5 percobaan independen oleh 3 operator independen. Sinyal pertama-tama dibandingkan dengan aktin WT untuk perbandingan perbedaan ekspresi yang lebih baik dalam AD dan TAD. Angka di bawah jalur menunjukkan analisis statistik eksperimen di mana setiap eksperimen terpisah (setidaknya 5) dinormalisasi ke sinyal aktinnya sendiri dan kemudian perbedaan statistik dihitung.

Analisis statistikSemua data mewakili setidaknya lima percobaan independen. Untuk semua gambar, sampel hewan WT, AD dan TAD yang sama dipilih dengan kontrol batin mereka untuk perbandingan yang lebih baik. Hanya satu foto demonstratif dari kelompok hewan yang sama yang digunakan di setiap gambar. Analisis statistik dilakukan dengan analisis varians satu arah (ANOVA), dilanjutkan dengan uji post-hoc HSD Tukey. Ambang batas untuk perbedaan yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan sampel kontrol ditetapkan pada p < 0.05="" dan="" untuk="" sampel="" ad="" #p=""><0,05. menunjukkan,="" perbedaan="" wt="" dibandingkan="" dengan="" ad="" dan="" tad,="" #="" menunjukkan="" perbedaan="" ad="" dibandingkan="" dengan="">

HASIL

Aktivitas fisik menormalkan jalur pensinyalan TGF kanonik pada ginjal tikus ADEkspresi elemen jalur pensinyalan TGFB kanonik diselidiki secara rinci. Ekspresi protein dan mRNA TGFB1 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan ketikaginjaltikus WT dan AD dibandingkan tetapi peningkatan ekspresi ditemukan pada sampel TAD (Gbr. 1A, B). Ekspresi TGFRI berkurang pada AD tetapi aktivitas fisik menormalkannya (Gbr. 1A, B), sedangkan ekspresi TGFBRII meningkat padaginjaltikus AD tetapi berkurang setelah aktivitas fisik (Gbr. 1A, B). Sejalan dengan pengamatan tersebut, ekspresi Smad2 meningkat pada sampel AD dan dinormalisasi setelah fisikaktivitas (Gbr. 1A, B). Sebaliknya, ekspresi Smad3 menunjukkan penurunan moderat dalamginjaltikus AD yang dikompensasikan dalam sampel TAD (Gbr. 1A, B). Peningkatan sinyal positif Smad2 terlihat di sistem tubular korteks tetapi tidak diginjalsel darah pada tikus AD. Elevasi ini berkurang di tubulus hewan TAD (Gbr. 1C).

Jalur pensinyalan non-kanonik dimodifikasi pada ginjal tikus AD setelah aktivitas fisikMAPK-es, seperti ERK, p38, dan JNK, merupakan bagian penting dari pensinyalan TGF non-kanonik [22]. Ekspresi mRNA ERK tidak diubah dalamginjaltikus AD tetapi menunjukkan penurunan sampel TAD (Gbr. 2A). Ekspresi protein kinase ini tidak berkorelasi dengan ekspresi mRNA dan pengurangan yang kuat terdeteksi padaginjaltikus AD dengan normalisasi moderat setelah peningkatan aktivitas fisik (Gbr. 2B). Bentuk aktif terfosforilasi meningkat secara menarik pada sampel AD dan menunjukkan penurunan yang serupa dalamginjaltikus TAD (Gbr. 2B). ekspresi mRNA p38 tidak berubah secara signifikan dalam sampel apapun (Gbr. 2A). Ekspresi protein p38 sangat meningkat padaginjaltikus AD yang sebagian dikompensasi oleh aktivitas fisik (Gbr. 2B). Menariknya, bentuk terfosforilasi yang lebih aktif menunjukkan pengurangan sampel AD yang

dinormalisasi pada hewan TAD (Gbr. 2B). ekspresi mRNA JNK berkurang baik dalam sampel AD dan TAD (Gbr. 2A). Ekspresi protein dari 2 isoform JNK dideteksi dengan analisis western blot. Fungsi non-redundan untuk JNK1 dan JNK2 telah terungkap [34] dan terdeteksi penurunan signifikan isoform 57 kDa dan isoform 46 kDa dalam sampel AD (Gbr. 2B). Isoform 57 kDa dan 46 kDa menunjukkan peningkatan setelah aktivitas fisik diginjaltikus TAD (Gbr. 2B).

Perubahan ekspresi Ser/Thr fosfatase dan fosforilasi protein termodifikasi dalam ADPerubahan ekspresi dan fungsi protein spesifik Ser/Thr telah ditunjukkan pada AD [35, 36]. Kami mendeteksi peningkatan ekspresi PP2B diginjaltikus AD, tetapi dikurangi dengan aktivitas fisik (Gbr. 2A, B). Sebaliknya, ekspresi fosfatase spesifik Ser/Thr seluler utama lainnya, PP2A, muncul dengan penurunan yang kuat dalamginjaltikus AD (Gbr. 2A, B). Dalam sampel TAD, mRNA dan ekspresi protein dari subunit katalitik PP2A meningkat (Gbr. 2A, B). Investigasi fosforilasi protein pada residu Ser/Thr menunjukkan sinyal kuat pada 55 kDa inginjaltikus AD, mewakili berat molekul tau (Gbr. 2C). Pita tinggi lainnya muncul pada 10 kDa yang sesuai dengan berat molekul C-terminal APP yang terbelah (Gbr. 2C). Fosforilasi kedua protein ini berkurang saat berolahraga (Gbr. 2C).

Pensinyalan TGF memengaruhi siklus sel dan apoptosisSebagai penanda proliferasi sel p21 dan tingkat ekspresi PCNA dipantau. Aktivasi TGFB diketahui menginduksi ekspresi p21 [37]. Selanjutnya, aktivasi TGFB1 menghasilkan perubahan proliferasi sel [38]. Oleh karena itu, ekspresi antigen nuklir sel (PCNA) yang berproliferasi diselidiki. Tingkat protein p21 meningkat secara signifikan pada AD tetapi berkurang pada sampel TAD (Gbr. 3A, B). PCNA merespons secara berbeda: AD menyebabkan penurunan ekspresi protein, sementara protein PCNA meningkat saat berolahraga (Gbr. 3A, B). Imunohistokimia dilakukan untuk mengidentifikasi sel-sel positif PCNA dan menghasilkan penurunan imunoreaktivitas dalam sel-sel tubular pada ginjal tikus AD. Menariknya, kepositifan PCNA yang dinormalisasi ditunjukkan dalam sel tubular pada tikus TAD. Tidak ada sel positif PCNA yang terdeteksi padaginjalsel darah (Gbr. 3C). Karena pensinyalan TGF1 dapat mempengaruhi apoptosis [39], bentuk aktif caspase3 proapoptosis diselidiki. Meskipun sedikit ekspresi mRNA dari caspase3 terdeteksi dalam sampel WT, tidak ada capase3 aktif yang dibelah. Sebaliknya, mRNA yang kuat dan caspase3 yang terbelah muncul dalam sampel AD, sementara peningkatan aktivitas fisik mengurangi ekspresi protein proapoptosis (Gbr. 3A, B).

Fibrosis ginjal diturunkan oleh aktivitas fisikHasil sebelumnya menunjukkan kemungkinan fibrosis pada ginjal hewan AD. Pertama, ekspresi MMP9, yang dapat diatur melalui aktivasi TGFB1, diselidiki [21]. mRNA MMP9 diekspresikan di semua sampel tetapi menunjukkan peningkatan yang signifikan hanya pada ginjal tikus TAD. Ekspresi protein dari matriks metaloproteinase berada pada batas deteksi dalam sampel WT tetapi menunjukkan peningkatan yang signifikan pada hewan AD. Anehnya, latihan fisik aktif secara dramatis meningkatkan ekspresi MMP9 (Gbr. 4A, B). Komponen lain dari proses fibrotik adalah peningkatan deposisi kolagen tipe I diginjal[40]. Dalam sampel WT, mRNA rendah dan ekspresi protein kolagen tipe I terdeteksi tetapi peningkatan yang kuat ditunjukkan pada hewan AD. Gerakan fisik aktif menormalkan baik mRNA dan ekspresi protein kolagen tipe I (Gbr. 4A, B). Kolagen tipe I biasanya mengelilingi tubulus dan terlokalisasi juga di interstitium. Dengan pewarnaan patohistologis rutin dari trikrom Masson, warna biru menunjukkan adanya semua jenis kolagen, yang terlihat di sekitar tubulus,ginjalsel darah, dan sejumlah kecil di interstitium di ginjal WT. Dalam sampel AD, akumulasi kuat terlihat di interstitium dan di beberapa tubulus. Setelah aktivitas fisik, jumlah kolagen berkurang, dan tidak ada akumulasi yang terdeteksi di interstitium (Gbr. 4C). Imunohistokimia kolagen tipe I dilakukan untuk menentukan akumulasi kolagen. Di WTginjal, mirip dengan pewarnaan Masson, sinyal muncul di sekitar tubulus,ginjalsel darah dan sinyal interstisial yang lemah juga terlihat. Dalam sampel dari tikus AD, imunopositif yang kuat ditunjukkan di interstitium dan di sekitar sistem tubular. Anehnya, pengurangan terlihat di jaringan interstisial, tetapi sinyal yang signifikan muncul di bagian apikal sel epitel tubulus pada hewan TAD (Gbr. 4D).

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN NYERI GINJAL / GINJAL

DISKUSI

Meskipun proses pembentukan AD dibahas secara luas di SSP, perubahan dan kemungkinan patologi perifer yang menyertainya tidak diselidiki secara rinci. Hipotesis utama kami adalah bahwaginjalfibrosis adalah proses yang mungkin mempengaruhi manifestasi AD dan akumulasi A. Di sisi lain, pelatihan fisik jangka panjang memiliki efek positif pada AD yang mungkin memiliki korelasi dengan jalur sinyal perubahan TGFB sistemik. Organ perifer telah terbukti terlibat dalam patogenesis AD, antara lain, aktivitas enzim metabolik yang berubah telah terdeteksi pada pasien AD [41] dan Akumulasi telah ditunjukkan di pankreas [42] dan diginjal[30]. Penyakit sistemik yang mempengaruhi berbagai organ ini membuat diagnosis dini dan penyembuhan DA menjadi sulit. Pembersihan DA dari SSP sebagian diatur oleh astrosit dan mikroglia tetapi sebagian setelah melewati sawar darah otak dapat dihilangkan di perifer [43]. Pembersihan perifer ini dianggap sebagai salah satu target obat yang mungkin untuk mengurangi konsentrasi AD dalam plasma [44]. Sekresi molekul kecil oleh tubulus proksimal ginjal merupakan fungsi homeostatik vital dan dapat mengambil bagian dalam sekresi racun atau protein ke dalam urin [45]. Telah ditunjukkan bahwa AD disekresikan dalam urin dan dapat menjadi tanda diagnostik demensia [46]; selain itu, disfungsi ginjal pada orang tua dapat meningkatkan risiko demensia [47], dan ditemukan bahwa kadar serum AD secara signifikan lebih tinggi pada pasien CKD [10]. Data ini menunjukkan kemungkinan fungsi dariginjaldalam pembersihan AD di perifer. Latihan fisik telah terbukti memiliki efek positif pada fungsi ginjal karena mempertahankan morfologi glomerulus yang tepat dan melindungi sekresi tubulus [48]. Peningkatan aktivitas fisik telah terbukti menurunkan sinyal TGFB pada ginjal dan latihan fisik dapat menjadi strategi antifibrotik yang baik [32]. Secara keseluruhan, aktivasi TGF mungkin memiliki hubungan langsung dengan pensinyalan terkait aktivitas fisik yang dapat mempertahankan pembersihan AD di perifer. Oleh karena itu, kami menyelidiki jalur pensinyalan TGFB pada tikus AD terlatih WT, AD, dan jangka panjang.

Dalam penelitian ini, ditunjukkan bahwa ekspresi TGFFRII meningkat pada ginjal tikus AD dan sebagian dinormalisasi dalam sampel TAD. TGFBRII yang meningkat menunjukkan peningkatan aktivasi jalur pensinyalan TGFB pada AD [49]. Penurunan ekspresi TGF RI menunjukkan bahwa TGF berikatan dengan afinitas yang lebih tinggi terhadap TGFBRII dan pembentukan homodimer kemungkinan besar terjadi pada AD [50]. Mirip dengan hasil ini, pembentukan homodimer TGFFRII telah ditunjukkan pada makrofag diginjalfibrosis [51]. Di sisi lain, pelatihan jangka panjang menyamakan ekspresi reseptor TGFB yang menunjukkan pembentukan kompleks reseptor heterodimer yang dapat distabilkan oleh peningkatan ekspresi TGFB1 [50]. Selain itu, ekspresi Smad2 dan Smad3 diubah secara kontroversial di AD. Smad2 diketahui teraktivasi secara klasik oleh reseptor TGF dan ditranslokasikan ke dalam nukleus sedangkan Smad3 memiliki fungsi yang berbeda [52]. Telah dipublikasikan bahwa down-regulation Smad3 mempengaruhi fibrosis [53]. Ekspresi normal dari faktor transkripsi Smad dalam sampel TAD menunjukkan

bahwa aktivitas fisik menyeimbangkan kembali pensinyalan TGFB dan mengurangi aktivasi patobiokimianya. Keluarga mitogen-activated protein kinase (MAPK) yang mengandung p38MAPK, JNK, dan ERK memiliki interaksi dengan sinyalisasi TGF [54]. Peningkatan ekspresi p38 telah ditunjukkan pada sel epitel tubulus yang menginduksi fibrosis ginjal dan pemblokirannya dapat menjadi target pengobatan fibrosis yang baik [55]. Pada tikus AD, peningkatan ekspresi protein p38 terdeteksi yang selanjutnya mendukung pembentukan fifibrosis. Sebaliknya, fosforilasi p38 berkurang pada ginjal AD menunjukkan aktivasi tergantung stadium fibrosis p38 MAPK [56]. Di sisi lain, peningkatan aktivitas fisik sebagian menormalkan bentuk p38 dan terfosforilasi yang ada di ginjal menunjukkan fungsi penyeimbang dari pelatihan dalam pembentukan fibrosis yang dimediasi p38-. Mirip dengan p38 kinase, penghambatan JNK dapat menekan pembentukan fibrosis [57]. Aktivasi JNK memiliki berbagai fungsi di berbagai bagian ginjal, seperti filtrasi glomerulus dan proses fibrotik interstisial [58]. Ekstrak protein dalam percobaan kami yang berasal dari lisat ginjal total menunjukkan bahwa selama perkembangan AD, JNK kemungkinan memiliki fungsi yang berbeda di bagian tubulus dan glomerulus dengan aktivasi isotipe spesifik sel pada ginjal yang terkena AD. Aktivasi MMP yang diinduksi TGFB1 dilaporkan tergantung pada fungsi p38 [59], sedangkan penghambatan aktivitas ERK mengurangi fibrosis interstisial [60]. Data ini sangat mendukung fungsi berbeda dari anggota keluarga MAPK dalam patogenesis fibrosis ginjal pada AD. Kami mendeteksi ekspresi ERK yang rendah pada ginjal tikus AD, sementara jumlah bentuk aktifnya yang terfosforilasi meningkat secara signifikan. Pada kelompok tikus percobaan yang mengambil bagian dalam pelatihan fisik jangka panjang, kami mendeteksi ekspresi ERK dan fosfo-ERK yang dinormalisasi dan efek menguntungkan padafungsi ginjal.Pengamatan ini mendukung kontribusi ERK dalam transformasi fibrotik ginjal pada AD dan menunjukkan pengaruh positif yang sangat nyata dari pelatihan fisik pada morfologi ginjal dan fungsi tikus AD. Baru-baru ini, laboratorium kami telah membuktikan keterlibatan ERK dalam mekanotransduksi sel-sel tulang rawan yang sedang berkembang [61].

TGFBRII, Smad, JNK, p38, dan fosforilasi ERK terjadi pada residu Ser [62] yang mengusulkan kemungkinan aktivasi Ser/Thr fosfatase. Disregulasi PP2B telah ditunjukkan pada AD [35, 63]. Di sisi lain, PP2B tidak secara signifikan mengatur fosforilasi tau di otak, meskipun mampu mendefosforilasi di beberapa situs fosforilasi [35]. Ser/Thr fosfatase seluler utama lainnya, PP2A juga mendefosforilasi protein pada residu Ser dan aktivitasnya berkurang pada AD dan ia mampu mengatur fosforilasi tau dengan afinitas lebih tinggi daripada PP2B [64]. Penurunan PP2A, tetapi peningkatan ekspresi PP2B pada ginjal tikus AD ditunjukkan, mirip dengan SSP. Peningkatan fosforilasi pada residu Ser, sebagai akibat dari penurunan ekspresi PP2A, dapat menginduksi hiperfosforilasi protein tau atau APP seperti yang diperkirakan pada ginjal mencit AD. Defosforilasi JNK dan p38 dapat diatur secara langsung oleh PP2B [65], oleh karena itu, penurunan aktivasi kinase ini pada AD dapat menjadi konsekuensi dari peningkatan ekspresi PP2B. Di sisi lain, defosforilasi ERK kinase dapat terjadi secara dominan melalui aktivasi PP2A [66], selanjutnya penurunan ekspresi PP2A dapat menyebabkan peningkatan fosforilasi ERK pada AD. Pelatihan jangka panjang tikus AD bertindak menuju normalisasi ekspresi PP2B dan PP2A yang pada gilirannya tampaknya menggeser tingkat fosforilasi Ser/Thr enzim MAPK lebih dekat ke normal. Beban mekanik memberikan efek keseimbangan pada fosforilasi reversibel melalui keterlibatan PP2B dan PP2A dalam membedakan kondrosit juga [61].

Aktivasi jalur pensinyalan TGFB non-kanonik mengatur proliferasi sel dan apoptosis. Mirip dengan hasil kami, sel positif p21 telah ditunjukkan dalam sistem tubular ginjal [67], dan kami juga menunjukkan peningkatan ekspresi mereka pada AD. Elevasi ini menunjukkan penghentian siklus sel pada AD yang dimediasi oleh aktivasi MAPK, sementara p21 berinteraksi dengan PCNA dan memblokir sel dalam fase S dari siklus sel [68]. Kami mendeteksi aktivasi p21 dan kemungkinan penurunan kuat PCNA dalam sistem tubular tikus AD. Mirip dengan temuan kami sebelumnya, peningkatan aktivitas fisik menormalkan siklus sel dalam sel-sel sistem tubular. Di sisi lain, p21 juga memiliki hubungan dengan aktivasi caspase dan JNK, sementara ERK juga menginduksi pembelahan caspase3 [69, 70]. Aktivasi Caspase3 telah diidentifikasi memainkan peran penting dalam patogenesis AD melalui akumulasi A dan gangguan sinoptik yang diinduksi pembelahan ABPP yang dimediasi caspase [71]. Pada ginjal tikus AD, kami mendeteksi ekspresi caspase 3 yang dibelah tinggi yang menunjukkan peningkatan apoptosis dan hilangnya fungsi sel tubular dan glomerulus. Proses ini dapat meningkatkan akumulasi AD di interstitium ginjal seperti yang telah kami tunjukkan sebelumnya [30].

CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN INFEKSI GINJAL/GINJAL

Signalization TGFB dimediasi telah terbukti meningkatkan ekspresi kolagen dan akumulasi di interstitium [40]. Menurut hasil ini pada ginjal tikus AD, kami menunjukkan ekspresi kolagen tipe I yang meningkat secara signifikan yang terakumulasi di interstitium. Data ini sangat menyarankan bahwa perubahan sinyal TGFB kanonik dan non-kanonik pada AD memainkan peran penting dalam fifibrosis ginjal [18, 72]. Sebaliknya, pelatihan jangka panjang mengurangi lokalisasi kolagen tipe I interstisial setidaknya sebagian melalui penyeimbangan kembali sinyalisasi TGFB. Fifibrosis yang berkurang dapat menginduksi pembersihan AD dan menurunkanginjalakumulasi seperti yang telah kami tunjukkan sebelumnya [30]. Hipotesis ini didukung oleh temuan kami, karena pelatihan fisik, menghasilkan akumulasi kolagen tipe I dalam sel epitel tubulus, yang ditunjukkan pada ginjal tikus TAD yang menyiratkan proses degradasi kolagen. MMP9 dapat diaktifkan oleh pensinyalan TGFB di ginjal [73] dan menghasilkan degradasi matriks fibril. Meskipun MMP memiliki peran penghambatan dan stimulasi dalam fibrosis, MMP9 dianggap sebagai agen profibrotik yang dimediasi oleh aktivasi TGFB [74]. Sebaliknya, telah ditunjukkan bahwa MMP9 dapat memainkan peran regulasi dalam degradasi kolagen tipe I di ginjal [75]. Pada ginjal tikus AD, kami menunjukkan peningkatan ekspresi MMP9 yang menunjukkan fungsinya dalam proses fibrotik yang dikendalikan oleh kaskade pensinyalan TGFB. Di sisi lain, peningkatan lebih lanjut diukur setelah pelatihan jangka panjang yang dapat menjadi alasan pengurangan kuat dalam ekspresi dan penampilan tubular dari kolagen tipe I. Dalam stimulus mekanis, laboratorium kami telah menunjukkan bahwa ekspresi MMP9 meningkat pada kultur khondrogenik primer. [76], dan hasil serupa telah dipublikasikan dalam pembentukan jaringan parut di mana kompresi mekanis meningkatkan ekspresi MMP9 [77]. Pada cedera ginjal akut, peningkatan MMP9 memiliki fungsi anti-apoptosis dan melindungi bagian S3 tubulus proksimal [78]. Selanjutnya, jalur pensinyalan TGFB yang diaktifkan oleh tegangan geser dan penurunan pembentukan fifibrosis juga telah terdeteksi di paru-paru [79]. Selain itu, stres mekanis pada sel epitel paru menginduksi remodeling ECM melalui aktivasi MMP9 dan mengubah ekspresi kolagen [80]. Oleh karena itu, kita dapat menyimpulkan bahwa peningkatan aktivitas fisik menginduksi remodeling produksi matriks melalui modulasi sinyal TGFB tidak hanya secara lokal tetapi juga secara sistemik. Keterbatasan pekerjaan kami adalah bahwa tikus transgenik mungkin memiliki pembentukan AD lebih cepat dan fungsi ginjal tidak diselidiki secara rinci. Harus diselidiki lebih lanjut bahwa hanya produksi matriks yang diinduksi TGFB yang diubah pada ginjal fibrotik tikus AD atau regulasi keseimbangan natrium dan kalium dan pembersihan AD juga terlibat dalam pelatihan jangka panjang. Selain itu, akumulasi kolagen tipe I dalam urin juga dapat diikuti lebih lanjut untuk meningkatkan pelatihan fisik jangka panjang pada AD mengarah pada pengurangan fibrosis ginjal. Di sisi lain, kami membuktikan in vivo bahwa pelatihan fisik jangka panjang memiliki efek sistemik pada pensinyalan TGFB kanonik dan non-kanonik. In vivo kami menunjukkan bahwa latihan fisik mengurangi pembentukan fibrosis ginjal pada AD yang memiliki efek positif pada manifestasi penyakit. Sebagai kesimpulan, data kami menunjukkan bahwa aktivasi jalur pensinyalan TGFB memainkan peran penyebab dalam transformasi fibrotik ginjal tikus AD. Sebagai pendekatan yang sangat sederhana untuk mencapai perubahan positif dalam kondisi ini, kami merekomendasikan pelatihan fisik jangka panjang, karena dapat menormalkan ekspresi dan fosforilasi anggota jalur pensinyalan TGFB kanonik dan non-kanonik dan menghasilkan peningkatan fifibrosis ginjal. Selain itu, latihan fisik yang menghambat fifibrosis dapat menyeimbangkan kembali fungsi ginjal dan dapat menyebabkan peningkatan pembersihan DA sistemik pada DA.