Fenilethanoid Glikosida Dari Paraboea Martinii Melindungi Sel Pheochromocytoma (PC12) Tikus Dari Cedera Sel yang Diinduksi Hidrogen Peroksida
Mar 04, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid
Stres oksidatif diketahui memainkan peran penting dalam patogenesis beberapa penyakit. Hal ini terkait dengan etiologi penyakit Alzheimer (AD), penyakit Parkinson (PD), epilepsi, dan penyakit lainnya [1-3]. Saat ini, kemajuan berkelanjutan telah dibuat dalam studi patogenesis AD, PD, dan penyakit lainnya. Namun, karena keterbatasan pengetahuan tentang mekanisme molekuler yang mendasari AD, PD, dan penyakit lainnya, strategi pencegahan atau kuratif yang efektif untuk penyakit ini belum direalisasikan [4]. H2O2 merupakan komponen penting dari spesies oksigen reaktif (ROS). Dengan demikian, cedera sel PC12 yang diinduksi H2O2-adalah model stres oksidatif yang paling umum digunakan dan banyak digunakan dalam studi eksperimental efek neuroprotektif [5]. Heme oxygenase 1 (HO-1) dan glutamate-cysteine ligase-catalytic subunit (GCLC) adalah enzim antioksidan seluler yang penting, dan kedua gen tersebut diatur di hilir faktor nuklir eritroid 2 (Nrf2), yang muncul sebagai terapi yang menjanjikan. target untuk perlindungan saraf [6,7]. Glikosida feniletanoid, berasal dari unit C-6-C-3, mengandung banyak gugus hidroksil fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan dan antipenuaan yang signifikan. Selama beberapa tahun terakhir, penelitian telah menunjukkan bahwa banyak tanaman obat mengandung glikosida fenilethanoid yang menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan. Misalnya, glikosida fenilethanoid yang berasal dariramuan herbaldiketahui memberikan efek protektif pada defisit kognitif pada AD. Studi tersebut menyelidiki mekanisme perlindungan terkait menggunakan model AD senescence-accelerated prone mouse 8 (SAMP8). Hasilnya menunjukkan bahwa kemampuan glikosida fenilethanoid untuk memperbaiki defisit kognitif pada tikus SAMP8 mungkin terkait dengan promosi plastisitas sinaptik yang melibatkan proses antioksidan [8]. Dalam penelitian ini, dua glikosida fenilethanoid dipisahkan dan dimurnikan dari simpul kayu Tectona grandis (jati); senyawa ini ditampilkan efek antioksidan penting yang ditentukan menggunakan metode amperometrik [9]. Selanjutnya, senyawa glikosida caffeoyl phenylethanoid dari Lindernia ruellioides mengerahkan efek antioksidan tergantung dosis dan superoksida anion radikal bebas secara in vitro [10]. Mekanisme kerja glikosida fenilethanoid terkait dengan regulasi jalur pensinyalan Nrf2/ARE, yang mempengaruhi sintesis SOD, CAT, GSH-PX, dan enzim antioksidan lainnya [11]. Famili Gesneriaceae, yang terdiri dari 150 genera dan sekitar 3700 spesies, terutama tersebar di daerah tropis dan beriklim sedang di Asia timur dan selatan, Oseania, Amerika Selatan, Afrika, Eropa Selatan, dan Meksiko [12].
Gesneriaceae di Cina. Dilaporkan bahwa sekitar 100 spesies memiliki khasiat medis dan sebagian besar didistribusikan di provinsi Guangxi dan Guizhou [13]. Dalam beberapa tahun terakhir, penelitian tentang tanaman Gesneriaceae telah meningkat secara bertahap di berbagai wilayah di dunia, dan beberapa konstituen baru dengan aktivitas fisiologis telah ditemukan [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt termasuk dalam Parabola (Gesneriaceae) dan merupakan tanaman herba. Berdasarkan "The Chinese Traditional Medicine Resource Records", tercatat bahwa seluruh tanaman digunakan sebagai obat. Selain itu, dapat mengerahkan banyak aktivitas farmakologis pada kondisi seperti hematemesis, edema, disentri, cedera traumatis, dan fraktur [15]. Bai membuktikan bahwa glikosida fenilethanoid adalah salah satu unsur kimia utama tanaman Gesneriaceae [16]. Beberapa peneliti juga menemukan bahwa glikosida fenilethanoid memiliki aktivitas antioksidan yang signifikan [17]. Li menunjukkan bahwa glikosida fenilethanoid dariCistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 persen) dari delapan glikosida fenilpropanoid diukur dengan metode normalisasi area puncak HPLC. Sebagai contoh, grafik kromatografi parabosida B dan parabosida II ditunjukkan pada Gambar 1, dan kandungan relatifnya masing-masing ditemukan 98,23 persen dan 99,20 persen . Garis sel pheochromocytoma adrenal tikus yang berdiferensiasi buruk (PC12) dibeli dari Bank Sel di Akademi Sains China (Shanghai, Cina). Medium Elang (DMEM) dan serum kuda yang dimodifikasi Dulbecco dibeli dari Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Fetal bovine serum (FBS) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 diperoleh dari Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). Trizol dibeli dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kit reagen PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) diperoleh dari TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, China). Primer untuk HO-1, GCLC, dan GAPDH disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, China). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (MTS) diperoleh dari Promega Corp. (Madison, USA). Inhibitor H2O-1 zinc protoporphyrin (ZnPP) dibeli dari Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Inkubator CO2 Thermo311 (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrumen Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo), dan xCELLigence RTCA DPlus Analyzer dan E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA) juga digunakan .
Cistanche deserticola
Kultur dan pengobatan sel
Sel PC12 ditumbuhkan dalam DMEM yang mengandung 5 persen FBS dan 5 persen serum kuda pada 37 derajat dalam atmosfer CO2 5 persen yang dilembabkan. Sel PC12 dibagi menjadi tiga kelompok sebagai berikut: kelompok kontrol, kelompok model, dan kelompok perlakuan. Delapan glikosida fenilpropanoid dilarutkan dalam DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">
Penentuan H2O2
Kami menentukan konsentrasi H2 O2 yang tepat menggunakan analisis seluler real-time (RTCA). Sel-sel PC12 diunggulkan dalam lempeng mikro-16 CIM pada volume 100 L dan kemudian diinkubasi selama 12 jam pada suhu 37 derajat dalam atmosfer 5 persen CO2. Sel PC12 dibagi menjadi kelompok kontrol dan model. Selanjutnya, 10 L H2O2 (50, 100, 200, dan 400 M) ditambahkan ke kelompok model, dan kelompok kontrol diperlakukan dengan 10 L DMEM lengkap, dipasang di tiga sumur kompleks. E-Plate 16 ditempatkan di xCELLigence RTCA, dipantau setiap 15 menit, dan hasilnya dicatat selama 32 jam. Pengaruh H2O2 pada sel PC12 dianalisis menggunakan perangkat lunak analisis data xCELLigence RTCA. Nilai indeks sel (CI) digunakan untuk menentukan konsentrasi dan durasi kerja H2O2 yang optimal.
Ekstraksi dan isolasi senyawa
Fraksi dipisahkan berdasarkan polaritasnya menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya. P. martini kering udara (4 kg) berturut-turut diekstraksi tiga kali dengan larutan etanol berair 75 persen [20]. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator untuk menghilangkan etanol, dan diperoleh ekstrak kasarnya. Sampel dilarutkan dalam air deionisasi dan kemudian diekstraksi berturut-turut dengan petroleum eter, etil asetat, n-butanol, dan air. Ekstrak n-butanol (400 g) difraksinasi menggunakan kolom resin berpori AB-8 dan larutan etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70, dan 95 persen ). Enam fraksi (fraksi 1-6) akhirnya diperoleh. Fraksi 3 dan 4 dilakukan pemisahan menggunakan kolom MCI dengan gradien langkah MeOH-H2O2 (10-100 persen). Selanjutnya, produk diisolasi menggunakan Sephadex LH-20 dengan 50 persen MeOH sebagai eluen. Senyawa 1 (41,0 mg) dan 6 (15,6 mg) diisolasi dari fraksi 3. Senyawa 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg), dan 8 (26,0 mg) diperoleh dari fraksi 4 menggunakan Sephadex Kromatografi LH-20 dengan 50 persen MeOH sebagai eluen. Isolasi akhir dilakukan dengan HPLC semi-persiapan fase terbalik (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) dengan deteksi MeOH dan UV 50 persen pada 280 nm untuk menghasilkan senyawa 4 (39,0 mg) dan 5 (9,0 mg) [20].
Uji viabilitas sel
Sel PC12 diunggulkan di 96-piring sumur dengan kepadatan 2 × 1{{10}}4 sel/sumur pada volume akhir 100 L . Sel PC12 diinkubasi pada 37 derajat dengan 5 persen CO2 selama 12 jam. Selanjutnya, sel diperlakukan dengan berbagai konsentrasi ekstrak kasar (0.025, 0,05, 0,1, 0,2, dan 0,4 mg/mL) dan senyawa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 pada lima konsentrasi (3,125, 6,25, 12,5, 25, dan 50 M). Setelah pretreatment selama 24 jam, viabilitas sel ditentukan dengan uji MTS. Sel PC12 dipreinkubasi dengan atau tanpa inhibitor HO-1 tanpa ZnPP (15 M) selama 30 menit, kemudian diinkubasi dengan atau tanpa caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3,125 M) selama 12 jam, dan akhirnya diinkubasi dengan 400 M H2O2 selama 6 jam lagi. Setelah pengobatan, jumlah sel yang masih hidup ditentukan dengan uji MTS [6].
Efek perlindungan dari ekstrak kasar dan senyawa monomer pada H2O2-sel PC12 yang diberi perlakuan
Sel-sel dikultur dalam pelat sumur {{0}}pada volume akhir 100 L. Pengenceran serial ekstrak kasar (0.025, 0,05, 0,1, 0,2, dan 0,4 mg/mL) ditambahkan ke kelompok perlakuan. Setelah perlakuan awal selama 12 jam, 400 M larutan H2O2 (konsentrasi optimal) ditambahkan ke kelompok perlakuan dan kelompok H2O2 masing-masing sumur selama 6 jam. Larutan MTS kemudian ditambahkan ke setiap sumur, dan pelat diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 derajat C. Pelat digoyang dengan kecepatan rendah selama 5 menit pada suhu kamar sampai semua kristal larut sepenuhnya. Perlindungan sel ditentukan berdasarkan hasil uji MTS menurut 2204 X. GONG ET AL dari pabrikan. Diunduh dari https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 oleh tamu pada 27 Agustus 2021instruksi. Densitas optik ditentukan pada panjang gelombang absorbansi 490 nm. Kami selanjutnya melacak aktivitas senyawa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 yang diisolasi dari fraksi 3 dan 4. Pengenceran seri senyawa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25, dan 50 M) ditambahkan ke kelompok perlakuan untuk menentukan efek perlindungan masing-masing pada sel PC12 yang diinduksi H2O2-.
glikosida fenilethanoid dari Cistanche deserticola: Melindungi neuron & anti-penuaan
PCR waktu-nyata kuantitatif (qRT-PCR)
Sel PC12 dipanen pada 12 jam setelah perawatan dengan 3,125 M caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II. Total RNA diekstraksi menggunakan TRIzol-reagen, dan alikuot total RNA ditranskripsi terbalik menggunakan Primescript RT Master Kit sesuai dengan instruksi pabrik. Primer berikut digunakan untuk percobaan sesuai dengan laporan sebelumnya [21]. HO-1: Maju 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, Mundur 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Maju 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Mundur 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Maju 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Mundur 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Aliquot dari cDNA yang diperoleh kemudian diamplifikasi dengan PCR. Kondisi reaksi sebagai berikut: denaturasi awal pada 95 derajat (30 detik), diikuti oleh 40 siklus pada 95 derajat (5 detik), 60 derajat (34 detik), dan 72 derajat (35 detik). Semua primer diuji dan sinyal fluoresen FL terdeteksi; kemudian, nilai Ct dihitung dan nilai relatif dibandingkan dengan kelompok kontrol menggunakan persamaan berikut: Ct=Ct (sampel) Ct (kontrol endogen), Ct {{36} } Ct (sampel) Ct (tanpa perlakuan), dan lipat perubahan=2−△△Ct. Gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) digunakan sebagai kontrol internal.
Ekstraksi protein
Sel PC12 diunggulkan pada cawan 100-mm pada 1 × 107 sel/piring. Setelah perlekatan, sel masing-masing diperlakukan dengan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3,125 M) selama 12 jam. Glikosida kemudian dihilangkan, dan sel diinkubasi dengan H2O2 selama 6 jam. Setelah inkubasi, sel dicuci dua kali dengan PBS dingin dan dikerok dari cawan dengan 1 mL PBS. Homogenat sel disentrifugasi pada 1500 rpm selama 10 menit. Setelah perawatan, protein seluler diekstraksi menggunakan buffer lisis sel Beyotime RIPA dengan 1 mM PMSF sesuai dengan instruksi pabrik. Selain itu, protein sitoplasma dan inti diisolasi seperti yang dijelaskan dalam protokol kit ekstraksi inti dan sitoplasma Beyotime. Konsentrasi protein sampel dideteksi menggunakan kit uji protein Beyotime BCA, dan semua sampel disimpan pada suhu -80 derajat untuk analisis western blotting [6].
Analisis noda barat
Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan setelah ekstraksi dan denaturasi protein total dari kelompok yang berbeda. Setelah elektroforesis, protein dipindahkan ke membran PVDF, yang kemudian diblok dengan 5 persen susu bubuk skim selama 4 jam. Setelah dicuci, antibodi primer (antibodi poliklonal kelinci GAPDH (pengenceran 1:10,000), antibodi poliklonal kelinci HO-1 (pengenceran 1:1000), atau antibodi poliklonal kelinci GCLC (pengenceran 1:1000) ditambahkan ke dalam membran, yang diinkubasi semalam pada suhu 4 derajat. Keesokan harinya, membran PVDF dicuci tiga kali dalam TTBS. Selanjutnya, antibodi sekunder (conjugated affinity pure kambing anti-kelinci IgG (pengenceran 1:1000) berlabel lobak peroksidase ditambahkan ke membran, yang kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam.Membran PVDF dicuci dan dikenakan reagen deteksi chemiluminescence ECL untuk sinyal paparan pada film sinar-X, yang kemudian diperbaiki dan dipindai [22].
Analisis statistik
Data dianalisis menggunakan SPSS 19.0, dan hasilnya disajikan sebagai mean dengan standar deviasi (SD) dari tiga percobaan independen. Nilai p < 0.05="" dianggap="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" secara="">
Hasil Pembentukan model H2O2
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, H2O2 pada 50, 100, dan 200 M tidak menyebabkan tingkat kematian sel yang sesuai. Namun, 400 M H2O2 bekerja pada sel PC12 dalam waktu 2-6 jam, dan kerusakan oksidatif pada sel cenderung stabil. Oleh karena itu, kami menganggap bahwa induksi dengan H2O2 pada konsentrasi 400 M selama 6 jam sesuai untuk meniru cedera yang diinduksi stres oksidatif pada sel PC12.
Efek perlindungan dari ekstrak kasar pada sel PC12 yang diberi H2O2
Dibandingkan dengan kelompok model H2O2 (Gambar 3), ekstrak n-butanol pada konsentrasi 0.05, 0.1, {{10} }.2, dan 0.4 mg/mL secara signifikan meningkatkan kerusakan oksidatif pada sel PC12 yang diinduksi oleh H2O2 (p < 0.05)="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" konsentrasi.="" data="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" fraksi="" n-butanol="" mengandung="" aktivitas="" protektif="" yang="" lebih="" kuat.="" namun,="" ekstrak="" petroleum="" eter="" dan="" etil="" asetat="" menunjukkan="" aktivitas="" protektif="" hanya="" pada="" konsentrasi="" tinggi="" (petroleum="" eter:="" 0.1="" dan="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" etil="" asetat:="" 0,2="" dan="" 0,4="" mg/ml,="" p=""><0,05). selain="" itu,="" konsentrasi="" ekstrak="" fase="" air="" yang="" berbeda="" tidak="" menunjukkan="" efek="" perlindungan="" (p=""> 0,05). Selanjutnya, kami telah menambahkan data dari studi validasi menggunakan SH-SY5Y human neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y) dalam File Tambahan. Pengobatan dengan 250 M H2O2 mengakibatkan penurunan viabilitas sel; namun, pengobatan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3.125, 6.25, 12.5, 25, dan 50 M) secara signifikan melemahkan kematian sel SH-SY5Y. Hasil percobaan membuktikan bahwa caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II melindungi sel SHSY5Y dari kerusakan sel yang diinduksi H2O2-.
Struktur senyawa yang diisolasi dari fraksi n-butanol
Untuk memastikan bahwa ekstrak n-butanol mengandung komponen aktif, selanjutnya kami fraksinasi delapan senyawa dari ekstraksi. Struktur senyawa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, dan 8 diidentifikasi dengan data spektral yang berbeda (1 H-NMR, 13C-NMR, dan ESI-MS) berdasarkan perbandingan dengan data yang dipublikasikan untuk paraboside A , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, dan isonuomioside A, masing-masing [20]. Sebagai contoh, data untuk paraboside B adalah sebagai berikut: gom coklat; 20 D 55.7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; untuk data rinci spektroskopi 1 H dan 13C NMR ditunjukkan dalam referensi 20; HR-ESI-MS (negatif) m/z 741.2231 [MH]− (dihitung untuk C33H41O19, 741.2242) [20]. Data paraboside II adalah sebagai berikut: serbuk amor putih; 20 D 80.5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks nm (logε): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; untuk data rinci spektroskopi 1 H dan 13C NMR ditunjukkan dalam referensi 20; ESI-MS (negatif) m/z 637
Efek perlindungan dari senyawa terisolasi terhadap H2 O2-toksisitas yang diinduksi dalam sel PC12
Uji MTS digunakan untuk menyelidiki efek senyawa terisolasi pada viabilitas sel PC12 yang terpapar H2O2-toksisitas yang diinduksi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, dibandingkan dengan kelompok kontrol, sel PC12 diberi perlakuan awal dengan lima konsentrasi caleolarioside B, paraboside B, paraboside II, atau paraboside A yang berbeda (3.125, 6.25, 12.5, 25, dan 50 M) selama 24 jam tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam viabilitas sel (p > 0,05). Dengan demikian, pretreatment sel PC12 dengan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II tidak menghasilkan sitotoksisitas. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, 400 M H2O2 secara signifikan menurunkan viabilitas sel dibandingkan dengan kelompok kontrol. Selain itu, viabilitas sel H2O2- yang diobati dengan sel PC12 meningkat secara nyata setelah perlakuan awal sel PC12 dengan konsentrasi caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II yang berbeda; selanjutnya, viabilitas sel adalah yang tertinggi setelah pengobatan dengan 50 M caleolarioside B, 50 M paraboside B, dan 12,5 M paraboside II. Lima senyawa lainnya tidak menunjukkan efek perlindungan yang signifikan pada sel PC12 yang diobati dengan H2O2-. Untuk mengilustrasikan temuan ini, kami membahas salah satunya sebagai contoh, sedangkan yang lain tidak dijelaskan dalam naskah.
Tingkat transkripsi HO-1 dan GCLC
Kami selanjutnya menguji tingkat transkripsi H O{{0}} dan GCLC dalam sel PC12 yang diobati dengan caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II. Total mRNA dikumpulkan dari sel PC12 yang dirawat dan yang tidak diobati selama 12 jam dan kemudian menjadi sasaran analisis ekspresi dengan qRT-PCR. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7(a,c,e), tingkat transkripsi H O-1 meningkat secara signifikan setelah sel PC12 diberi perlakuan awal dengan konsentrasi caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II yang ditunjukkan selama 12 jam (p < 0.05).="" seperti="" yang="" ditunjukkan="" pada="" gambar="" 7="" (b),="" tingkat="" transkripsi="" gclc="" juga="" meningkat="" secara="" signifikan="" dalam="" sel="" pc12="" yang="" diberi="" perlakuan="" sebelumnya="" dengan="" konsentrasi="" caleolarioside="" b="" yang="" ditunjukkan="" selama="" 12="" jam.="" namun,="" kadar="" gclc="" dalam="" sel="" pc12="" yang="" diberi="" paraboside="" b="" selama="" 12="" jam="" menurun="" secara="" signifikan="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" model="" (p=""><0,05; gambar="" 7(d)).="" selanjutnya,="" dengan="" perlakuan="" paraboside="" ii,="" kadar="" gclc="" pada="" sel="" pc12="" tidak="" berbeda="" nyata="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" model="" (p=""> 0,05; Gambar 7(f)).
Ekspresi HO-1 dan GCLC
HO{{0}} dan GCLC adalah enzim antioksidan seluler yang penting, dan keduanya merupakan gen hilir yang diatur Nrf2-. Ekspresi protein H2O-1 dan GCLC juga diamati setelah pengobatan [6]. Gambar 8 menunjukkan kadar protein HO-1 dan GCLC dalam sel PC12 setelah perlakuan dengan 400 M H2O2; hasilnya menunjukkan intensitas fluoresen FL dari H O-1 dalam kelompok caleolarioside B dan paraboside B lebih besar daripada kelompok yang diberi perlakuan H2O2-(Gambar 8(a,c)). Namun, ekspresi GCLC tidak berubah secara signifikan oleh senyawa, kecuali caleolarioside B (Gambar 8(b)). Selanjutnya, inhibitor kimia H O-1 digunakan untuk mengevaluasi lebih lanjut peran enzim antioksidan dalam mengatur efek perlindungan yang diberikan oleh caleolarioside B, paraboside B, atau paraboside II terhadap H2O2-yang diinduksi sitotoksisitas. Caleolarioside B, paraboside B, dan paraboside II (3,125 M) mencegah sitotoksisitas yang diinduksi H2O2-, tetapi efek perlindungan tersebut dibalikkan oleh inhibitor HO-1 ZnPP (p <0,01) pada="" 15="" m="" (gambar="" 8="">
Manfaat Cistanche: Meningkatkan reproduksi pria
Diskusi
Penuaan populasi adalah masalah global yang parah. Banyak penyakit yang berhubungan dengan kepikunan, seperti AD dan PD, yang merupakan ancaman serius bagi kesehatan masyarakat. AD dan PD telah muncul sebagai penyakit paling mematikan ketiga secara global, setelah penyakit kardiovaskular dan kanker. Oleh karena itu, neurodegenerasi telah menjadi topik penelitian yang mendesak di seluruh dunia. Namun, patogenesis AD dan PD, penyakit neurodegeneratif pada sistem saraf pusat, masih belum jelas hingga saat ini. Selain itu, hanya ada beberapa obat yang dapat secara efektif mengobati AD atau PD karena mekanisme patogeniknya yang kompleks [23]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa ROS, seperti anion superoksida (O2−) dan H2O2, merupakan faktor utama yang berkontribusi terhadap penyakit neurodegeneratif. Perubahan patologis selama PD termasuk degenerasi neuron dan kematian substansia nigra dan dopamin striatal [24,25]. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan obat antioksidan yang efektif untuk mengobati PD, dan penemuan obat tersebut telah menjadi arah penelitian yang penting [26]. Saat ini, jalur pensinyalan Nrf2/ARE tampaknya menjadi jalur stres antioksidan endogen yang paling penting [27]. Ares terletak di 5′- memenuhi wilayah peringkat gen, seperti HO-1 dan GCLC [28,29]. HO-1 dan GCLC adalah gen terkait Nrf2-yang diatur di hilir protein ini [6]. ARE selanjutnya dapat mempengaruhi tingkat antioksidan dan mengaktifkan ekspresi hilir H O-1 dan gen pelindung lainnya, yang dapat meningkatkan aktivitas perlindungan sel [30,31]. Selanjutnya, temuan menunjukkan bahwa efek perlindungan resveratrol terhadap toksisitas yang diinduksi A {{2{{50}}} dalam sel PC12 terjadi melalui peningkatan regulasi ekspresi H2O-1 melalui aktivasi Nrf2 intraseluler jalur pensinyalan [32]. Sel PC12 adalah model sel saraf yang diterima dan banyak digunakan dalam studi efek neuroprotektif [33]. H2O2 dapat dengan mudah melewati membran sel dan bergabung dengan besi untuk membentuk radikal bebas yang sangat aktif, yang menginduksi stres oksidatif dan cedera sel [34]. H2O2 merupakan ROS yang penting, dan radikal bebas mudah dihasilkan dan relatif stabil, sehingga biasanya digunakan untuk membentuk model stres oksidatif menggunakan sel PC12 [5]. Dalam penelitian ini, pretreatment sel PC12 dengan konsentrasi nontoksik ekstrak tumbuhan melindungi sel dari H2O2-menginduksi sitotoksisitas dengan menurunkan pembentukan ROS. Glikosida feniletanoid mengandung banyak gugus hidroksil fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan dan antipenuaan. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ekstraksi n-butanol menghasilkan perlindungan yang lebih baik daripada fraksi polaritas lainnya (Gambar 3). Dengan demikian, kami selanjutnya menyaring aktivitas pelindung dari delapan senyawa yang diisolasi dari fraksi n-butanol. Hasil penelitian menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa Gambar 8. Analisis kadar protein HO-1 dan GCLC pada sel PC12. (a) Analisis Western blotting dari ekspresi HO-1 dan GCLC dan GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. (b) Ekspresi protein GCLC analisis Western blot. (c) analisis Western blot ekspresi protein H2O-1. (d) HO-1 inhibitor ZnPP mengurangi efek neuroprotektif. Data disajikan sebagai mean ± SD, n=3. ***p < 0.001="" versus="" kelompok="" kontrol;="" #p=""><0,05 versus="" kelompok="" h2o2="" (tanpa="" perlakuan="" znpp),="" ##p=""><0,01 versus="" kelompok="" h2o2="" (tanpa="" perlakuan="" znpp),="" ###p=""><0,001 versus="" kelompok="" h2o2="" (tanpa="" perlakuan="" znpp);="" dan="" p=""><0,01, versus="" kelompok="" h2o2="" (dengan="" perlakuan="" znpp),="" dan="" &p=""><0,001, versus="" kelompok="" h2o2="" (dengan="" perlakuan="" znpp).="" (grup="" kontrol;="" grup="" model:="" h2o2;="" grup="" negatif="" znpp:="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" grup="" positif:="" znpp="" plus="" caleolarioside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" ii="" ditambah="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" diunduh="" dari="" https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145="" oleh="" tamu="" pada="" 27="" agustus="" 2021caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" memiliki="" efek="" perlindungan="" yang="" signifikan="" terhadap="" h2o2-="" yang="" diinduksi="" oksidatif="" kerusakan="" pada="" sel="" pc12.="" hasilnya="" juga="" menunjukkan="" bahwa="" pengobatan="" h2o2="" menginduksi="" cedera="" sel="" pc12="" yang="" signifikan="" dan="" penurunan="" viabilitas="" sel,="" sedangkan="" pengobatan="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" secara="" signifikan="" mengurangi="" efek="" ini="" (gambar="" 6).="" sebuah="" penelitian="" sebelumnya="" melaporkan="" bahwa="" jalur="" nrf2/are="" adalah="" salah="" satu="" jalur="" antioksidan="" endogen="" yang="" paling="" penting,="" dan="" dapat="" meningkatkan="" ekspresi="" penanda="" hilir,="" seperti="" h="" o-1,="" untuk="" melindungi="" sel="" [7].="" hasil="" analisis="" qrt-pcr="" dan="" western="" blotting="" menunjukkan="" bahwa="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" secara="" signifikan="" meningkatkan="" kadar="" h="" o-1.="" namun,="" tingkat="" transkripsi="" gclc="" meningkat="" secara="" signifikan="" pada="" sel="" pc12="" yang="" diobati="" dengan="" caleolarioside="" b="" tetapi="" menurun="" pada="" mereka="" yang="" diobati="" dengan="" paraboside="" b="" dibandingkan="" dengan="" yang="" ada="" di="" kelompok="" model.="" selanjutnya,="" paraboside="" ii="" tidak="" mengubah="" ekspresi="" penanda="" ini,="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" model="" (gambar="" 7="" dan="" 8(a-c)).="" selain="" itu,="" efek="" perlindungan="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" terhadap="" cedera="" sel="" pc12="" yang="" diinduksi="" h2o2-dibalikkan="" oleh="" inhibitor="" ho-1="" znpp="" (gambar="" 8(d)).="" kesimpulannya,="" fenilethanoid="" glikosida="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b,="" dan="" paraboside="" ii="" secara="" efektif="" melindungi="" sel="" pc12="" dari="" h2o2-yang="" diinduksi="" kerusakan="" oksidatif.="" dengan="" demikian,="" senyawa="" ini,="" diisolasi="" dari="" p.="" martini,="" mungkin="" mewakili="" calon="" obat="" potensial="" untuk="" pengobatan="" penyakit="">
Manfaat dari Cistanche:mengobati penyakit neurodegeneratif
Referensi
[1] Butterfield DA. Perspektif stres oksidatif pada penyakit Alzheimer dan prediksi penekanan penelitian masa depan. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.
[2] Sanggul C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, dkk. Stres oksidatif dan peptida amiloid-beta pada penyakit Alzheimer. Biol Redoks. 2018;14:450–464.
[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, dkk. Kerusakan neuron dopaminergik oleh stres oksidatif pada penyakit Parkinson (ulasan). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.
[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, dkk. Asosiasi polimorfisme rs823128, rs1572931, dan rs823156 dengan pengurangan risiko penyakit Parkinson. laporan saraf. 2017;27:936–941.
[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, dkk. Tindakan antioksidan 7,8-dihidroksiflflavon melindungi sel PC12 terhadap 6-sitotoksisitas yang diinduksi hidroksidopamin. Neurochem Int. 2014;64:18–23.
[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, dkk. Efek neuroprotektif dari empat glikosida fenilethanoid pada H2O2-menginduksi apoptosis pada sel PC12 melalui jalur Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.
[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, dkk. Jalur Nrf2-ADALAH: target yang muncul melawan stres oksidatif dan peradangan saraf pada penyakit neurodegeneratif. Terapi Farmakol. 2016;157:84–104.
[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, dkk. Efek glikosida fenilethanoid, berasal dariramuan herbal, pada defisit kognitif dan aktivitas antioksidan pada tikus SAMP8 jantan. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.
[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, dkk. Glikosida feniletanoid dari simpul kayu jati dan aktivitas antioksidannya. J Biol Active Prod Nat. 2016; 6:272–281.
[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, dkk. Aktivitas antioksidan senyawa glikosida caffeoyl phenylethanoid dari Lindernia ruellioides secara in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.
[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, dkk. Peran jalur Nrf2-ADALAH dalam cedera stres oksidatif dan hubungannya dengan jalur pensinyalan lainnya. Anim Peternakan Pakan Sci. 2016;37:42–48.
[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, dkk. Kemajuan dalam studi Gesneriaceae. Obat Baru Chin J. 2003;12:261–263.
[13] Wen F, Li ZD. Penelitian lanjutan pada tanaman Gesneriaceae. Sumber Daya Tumbuhan Liar Dagu. 2006;25:1–6.
[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, dkk. Kemajuan penelitian triterpenoid tanaman Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.
[15] Perusahaan jamu Cina. Catatan sumber daya pengobatan tradisional Tiongkok. Cina: Pers Sains; 1994.
[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, dkk. Distribusi glikosida fenilethanoid pada tanaman obat Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.
[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, dkk. Aktivitas antioksidan glikosida fenilethanoid dari Brandisia hancei. J. Etnofarmaka. 2000;71:483–486.
[18] Li L, Shi DF, Gui YG, dkk. Studi tentang aktivitas antioksidanglikosida fenilethanoid dari Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.
[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, dkk. Efek perlindungan dariglikosida dari cistanchepada kerusakan sel PC12 PARABOLA MARTINI MELINDUNGI SEL PC12 DARI H2O2-CEDERA TERINDUKSI 2211
