BAGIANⅠ: Efek Dan Mekanisme Molekuler Asam Pachymic Pada Cedera Reperfusi Iskemia Ginjal
Mar 25, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
GUI-PING JIANG, YUE-JUANLIAO,L-LI HUANG,XU-JIAZENG & XIAO-HUI LIAO
pengantar
Cedera ginjal akut (AKI)adalah penyakit klinis umum yang disebabkan oleh berbagai etiologi dan memiliki proses patofisiologi yang kompleks (1). Morbiditas dan mortalitas AKI tinggi pada orang dewasa dan anak-anak, sehingga mengakibatkan biaya rawat inap yang besar(2,3). Sebuah meta-analisis dari insiden global AKI mengungkapkan tingkat kejadian AKI adalah 21,6 persen pada orang dewasa dan 33,7 persen pada anak-anak dan tingkat kematian terkait AKI adalah 23,9 persen pada orang dewasa dan 13,8 persen pada anak-anak (4). AKI terjadi pada ~20 persen pasien rawat inap, 10 persen di antaranya memerlukan terapi penggantian ginjal, dan sebanyak 50 persen pasien di unit perawatan intensif, sehingga secara signifikan meningkatkan lama dan biaya rawat inap (5).AKI ditandai dengan penurunan tajam dalam laju filtrasi glomerulus dalam jangka pendek, yang disertai dengan peningkatan kreatinin serum, oliguria, atau keduanya; perubahan ini dapat menyebabkan penyakit ginjal kronis atau penyakit ginjal stadium akhir (6). Karena variabilitas cedera ginjal, kurangnya biomarker awal yang dapat diandalkan, dan heterogenitas jalur yang terlibat dalam patofisiologi, saat ini tidak ada cara pencegahan dan intervensi yang efektif kecuali pengobatan konservatif dan terapi penggantian ginjal (7). Dengan demikian, mengidentifikasi rejimen pengobatan baru dan obat untuk AKI sangat penting. Dekade terakhir telah melihat banyak penelitian memperluas pandangan tradisional tentang nekrosis. Penelitian terbaru telah menantang pandangan tradisional tentang kematian sel dengan mengidentifikasi jalur baru di mana sel mati dengan cara yang diatur, tetapi menunjukkan fitur morfologi nekrosis (7-9). Nekrosis yang diatur ini mengambil beberapa bentuk: Nekroptosis, ferroptosis, pyroptosis, nekrosis yang didorong oleh transisi permeabilitas mitokondria, dan parthanatos (10). Nekroptosis dan ferroptosis adalah bentuk nekrosis teregulasi yang paling banyak dipelajari yang terjadi di ginjal (11). Sebuah penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa menghambat ferroptosis secara efektif memperbaiki AKI (12).
cistanche pharma khususuntukginjal
Ferroptosis adalah jenis baru dari kematian sel pengatur, yang pertama kali diusulkan oleh Dixon et al pada 2012 (13). Jenis kematian sel ini bergantung pada besi dan disertai dengan akumulasi besi masif dan peroksidasi lipid selama kematian sel (13). Ferroptosis memainkan peran pengaturan penting dalam terjadinya dan perkembangan beberapa penyakit, termasuk tumor, penyakit neurologis, dan AKI (14). Dalam studi in vivo, ferrostatin 1 atau 16-86 diberikan 15 menit sebelum iskemia pada tikus dengan beratcedera iskemia-reperfusi(IRI)-AKI, dan kerusakan jaringan ginjal, kreatinin serum, dan urea semuanya menurun pada tikus 48 jam setelah iskemia, dengan demikian, menunjukkan bahwa ferroptosis memiliki peran penting dalam patogenesis IRI.cedera iskemia-reperfusi)(15). Oleh karena itu, mengatur homeostasis besi, melawan peroksidasi lipid, dan menghambat ferroptosis dapat memberikan strategi terapi yang menjanjikan untuk AKI.
Asam pachydermic(PA), triterpenoid tipe lanostane dari Poria cocos, memiliki beberapa efek farmakologis, seperti antitumor, anti-inflamasi, antioksidan, hipoglikemik, sedatif, dan aktivitas hipnotis (16-20). Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa PA(Asam pachymic)dapat memperbaiki cedera ginjal selama sepsis pada tikus dengan menghambat respon inflamasi dan mengaktifkan faktor nuklear erythroid-derived 2 seperti jalur 2(NRF2)/heme oksigenase 1(H2O-1) melalui stres antioksidan (21). Selain itu, asam Poricoic A secara efektif meningkatkan penghambatan melatonin dalam transisi dari AKI ke penyakit ginjal kronis setelah cedera iskemia/reperfusi ginjal (22). PA(Asam pachymic)melindungi terhadap AKI, namun mekanisme perlindungan ini masih harus diselidiki lebih lanjut. PA(Asam pachymic)telah dilaporkan untuk mengaktifkan NRF2 dalam studi cedera ginjal pada sepsis (21). Khususnya, dua agen penginduksi ferroptosis pertama (RSL-3 dan elastin) yang diidentifikasi dalam studi ferroptosis memulai kaskade ferroptosis melalui penghambatan glutathione peroxidase 4 (GPX4) dan sistem transporter sistin/glutamat (xC-/xCT), masing-masing, keduanya merupakan target hilir NRF2 (23). PA(Asam pachymic)diasumsikan mengatur protein hilirnya, GPX4, dan xCT dengan mengaktifkan NRF2 dan mengganggu ferroptosis pada AKI. Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efek PA(Asam pachymic)pada ferroptosis pada tikus dengan cedera ginjal iskemia-reperfusi dan menentukan mekanisme aksi molekuler yang mendasarinya untuk memberikan ide-ide baru untuk pengobatan AKI klinis.
Bahan dan metode
Reagen dan hewan.
PA(Asam pachymic)(bubuk kristal putih dengan kemurnian Lebih dari atau sama dengan 99,9 persen ) dibeli dari MedChemExpress (cat.no.HY-N0371) dan disimpan jauh dari cahaya pada 4C. Sebanyak 30 tikus jantan C57BL/6 (8-10 minggu;20-25g berat badan) dibeli dari Universitas Kedokteran Chongqing (Chongqing, Cina). Kondisi perumahan adalah sebagai berikut:12 jam terang/12 jam gelap,~60 persen kelembaban,25 derajat , akses gratis ke air minum dan makanan, dan penggantian tempat tidur setiap 3 hari; air minum dan bahan tempat tidur didesinfeksi sebelum digunakan. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium, yang dikeluarkan oleh National Institutes of Health pada tahun 1996 (24). Penelitian ini telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University (Chongqing, China; no. persetujuan 2018-019).
Cedera iskemia-reperfusi-model AKI.
Tikus diberi makan dalam kondisi yang sama selama 1 minggu untuk menghasilkan model ginjalcedera iskemia-reperfusi, seperti yang dijelaskan sebelumnya (25). Tikus dibius dengan 50-60 mg/kg natrium pentobarbital (cat.no. P3761; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) dengan injeksi intraperitoneal; kulit di area pembedahan dilap dengan alkohol 70 persen. Sayatan ditempatkan di sisi kiri dan kanan tulang belakang (0.5 cm), dan panjang sayatan adalah 1-1.5 cm di sepanjang punggung. Ginjal kemudian ditarik keluar dari sayatan untuk mengekspos pedikel ginjal. Sebuah klip mikroaneurisma digunakan untuk menjepit pedikel untuk memblokir aliran darah ke ginjal dan menginduksi iskemia ginjal. Iskemia lengkap yang ditunjukkan dengan perubahan warna ginjal dari merah menjadi ungu tua dalam beberapa detik. Setelah 40 menit iskemia, klip mikroaneurisma dilepaskan untuk memungkinkan setiap ginjal memulai reperfusi, yang ditunjukkan dengan perubahan warna ginjal menjadi merah. Kulit otot dijahit setelah warna ginjal kembali normal. Seluruh prosedur iskemia ginjal diselesaikan pada bantalan termostatik, dan suhu tubuh tikus dijaga konstan pada 36.5-37 derajat. Sebanyak 0,8 ml saline steril hangat diberikan secara intraperitoneal ke masing-masing tikus. Setiap hewan ditempatkan di atas bantal pemanas sampai sadar kembali dan kemudian dikembalikan ke kandangnya. Tikus dikorbankan melalui dislokasi serviks 24 jam setelah operasi, dan darah dikumpulkan dari sinus orbital. Sepertiga dari jaringan ginjal digunakan untuk analisis histopatologi, dan dua pertiga sisanya dengan cepat disimpan pada derajat -80 derajat.
Kelompok hewan.
Tikus C57BL/6 dibagi menjadi lima kelompok (n=6/kelompok) menurut tabel bilangan acak, sebagai berikut: Kelompok palsu (Sham), kelompok model (IRI), kelompok dosis rendah (IRI plus PA)) , kelompok dosis sedang (IRI plus PAw), dan kelompok dosis tinggi (IRI plus PAg). Hewan dalam tiga kelompok perlakuan eksperimental menerima injeksi intraperitoneal dengan PA(Asam pachymic)pada dosis 5, 10, dan 20 mg/kg. tetapi selama 3 hari, sebelum model diinduksi. Palsu dan IRI(cedera iskemia-reperfusi) kelompok disuntik dengan volume dimetil sulfoksida yang sama selama 3 hari sebelum model induksi. Metode pemodelan dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (25). Tangkai ginjal bilateral tikus dalam kelompok palsu diekspos dan diperlakukan seperti yang disebutkan di atas, tetapi tidak dijepit. Sayatan bedah dijahit setelah 40 menit.
Analisis biokimia serum.
Tikus dikorbankan 24 jam pasca operasi, dan 0.8-1 ml darah dikumpulkan dari sinus orbital, dibiarkan istirahat selama 30 menit, dan disentrifugasi pada 900xg selama 10 menit pada 4C. Lapisan serum atas dikumpulkan, dikemas, dan disimpan pada derajat -80 . Kreatinin serum (Scr; cat.no.c011-2-1) dan nitrogen urea darah (BUN: cat.no.cO13-2-1) dinilai menggunakan kit reagen, sesuai dengan instruksi pabrik (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute ).
Pemeriksaan histopatologi.
Pada 24 jam pasca IRI(cedera iskemia-reperfusi), bagian dari jaringan ginjal difiksasi dalam 10 persen formalin buffer netral selama 24-48 jam pada suhu kamar, diproses secara rutin dengan menanamkan parafin. Spesimen jaringan tetap parafin diiris menjadi bagian setebal 4 m, yang dipasang pada slide kaca dan diwarnai dengan hematoxylin selama 10 menit pada suhu kamar dan eosin selama 3 menit pada suhu kamar. Mikroskop cahaya BX51 (Olympus Corporation) digunakan untuk mendeteksi perubahan histopatologi ginjal (perbesaran, x200, dan x400). Skor Paller digunakan untuk menilai nekrosis tubulus ginjal pada IRI . ginjal(cedera iskemia-reperfusi)(26). Sebanyak 10 area yang tidak tumpang tindih dipilih secara acak di bawah perbesaran tinggi menggunakan mikroskop cahaya optik (perbesaran, x400), dan 10 tubulus ginjal dipilih secara acak di setiap bidang penglihatan. Bagian patologi ginjal dari tiga tikus di setiap kelompok eksperimen dipilih secara acak untuk observasi. Sebanyak 10 bidang visual dipilih secara acak untuk setiap bagian patologis, dan 10 tubulus ginjal dinilai di setiap bidang visual. Sebanyak 100 tubulus diamati untuk setiap tikus, memberikan total 300 tubulus ginjal diamati pada setiap kelompok. Semakin tinggi skor, semakin serius tingkat kerusakan tubulus ginjal.
Mikroskop elektron transmisi (TEM).
Jaringan ginjal dikumpulkan 24 jam pasca operasi. Setelah anestesi, 1 mm² jaringan ginjal diangkat secara in vivo dan direndam dalam larutan fiksasi jaringan yang terdiri dari 2,5 persen glutaraldehida dan larutan buffer asam fosfat (cat.no.G7776; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) selama 2 jam pada derajat 4 derajat , didehidrasi dalam etanol bertahap (50-100 persen )dan propilen oksida, tertanam di Epon 812(cat. no. GP18{{20}}10; Beijing Zhongjingkeyi Technology Co.Ltd. selama 1 jam pada derajat 35 derajat dan dipadatkan selama 24 jam pada 60 derajat.Bagian ultra tipis (ketebalan, 50-70 nm) ditempatkan pada 200-jaringan tembaga mesh dan diwarnai dengan 2 persen uranil asetat selama 30 menit pada suhu kamar dan 0,04 persen timbal sitrat selama 15 menit pada suhu kamar. Sampel dilihat di bawah mikroskop elektron (JEM-1400 plus, Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.; perbesaran, x5,000 dan x10,{{27} }) Gambar diperoleh menggunakan kamera perangkat SlowScan charge-coupled device dan perangkat lunak TEM analySIS5.0 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH).
Deteksi antioksidan glutathione (GSH) dan lipid peroxidation malondialdehyde (MDA).
Jaringan ginjal (50-100mg) dikumpulkan, dan larutan garam fisiologis (cat.no. B020; Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng) ditambahkan ke jaringan dengan rasio 1:9 berat(g): volume (ml). Jaringan dihomogenkan, untuk menghasilkan 10 persen homogenat jaringan, yang disentrifugasi pada 13.800 xg selama 15 menit pada 4 derajat. Supernatan dihilangkan dan kandungan protein total supernatan ditentukan dengan menggunakan metode asam bicinchoninic (21). GSH(cat.no.A006-2-1) dan MDA(cat.no.A003-2-2) dinilai menggunakan kit reagen, sesuai dengan instruksi pabrik (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute).
blotting Barat.
Protein total diekstraksi dari jaringan ginjal tikus menggunakan buffer lisis sel RIPA (cat. no. WO{{{0}}; Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng) dan konsentrasi protein ditentukan melalui uji BCA (cat.no. A{ {1}}; Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng）. Protein dalam jumlah yang sama 50μug）dipisahkan melalui SDS-PAGE(Cox-2,10.0 ;NRF2,10.0;xCT,12.5;HO-1, 12.5; GPx4.15.0 persen ) dan dipindahkan ke membran PVDF (GE Healthcare Life Sciences).Selanjutnya membran diblokir dengan 5 persen susu bubuk skim selama 1 jam pada suhu kamar, dan diinkubasi dengan antibodi primer terhadap: Siklooksigenase 2(COX-2;1:1,000; cat.no.ab179800;Abcam), GPX4( 1:5,000;cat.no.ab125066;Abcam),xCT(1:2,000;cat.no.ab175186;Abcam), HO-1(1:1 ,000 cat.no.101147;Gentex)and NRF2 (1:1,000;cat.no.D1Z9C;CST)semalam pada 4 derajat. Membran kemudian dicuci dengan TBST(0.1 persen Tween -20)tiga kali. Mengikuti inc . utama ubation, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak (1:10,000;40295G; BIOSS) selama 1 jam pada suhu kamar. Membran dicuci ulang tiga kali dengan TBST dan divisualisasikan dengan BeyoECLPlus (cat. no. P00185; Beyotime Institute of Biotechnology), menggunakan Sistem Pencitraan Chemi Doc (Bio-Rad Laboratories, Inc.) Intensitas pita protein ditentukan menggunakan Perangkat lunak ImageJ v1.8.0 (Institut Kesehatan Nasional). Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
Reverse transcription-quantitative(RT-g)PCR.
Total RNA diekstraksi dari ginjal tikus dalam kelompok yang berbeda menggunakan reagen TRIzol (Takara Bio, Inc.) dan cDNA disintesis menggunakan kit PrimeScript RT Reagent dengan gDNA Eraser(cat.no.RR047A; Takara Biotechnology Co., Ltd.) .Tingkat relatif gen target ditentukan melalui qPCR menggunakan Ultra SYBR Mixture (Takara Biotechnology Co., Ltd.). RT-qPCR dilakukan dalam volume 25 ul dengan 2 ul cDNA, masing-masing 400 nM sense dan primer antisense, dan 12,5 ul Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix (Takara Bio, Inc. pada sistem ABI PRISM 7000 (Biosistem Terapan; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Reaksi dilakukan selama 40 siklus denaturasi pada 95 derajat selama 30 detik, annealing pada 53 derajat selama 30 detik, dan ekstensi pada 72 derajat selama 10 detik. Urutan primer berikut digunakan untuk qPCR:GPX4 maju ,5'-GCCTGGATAAGTACA GGGGTT-3' dan mundur,5'-CATGCAGATCGACTAGCT GAG-3';NRF2 maju,5'-TCTTGGAGTAAGTCGAGA AGTGT-3' dan mundur,5'-GTTGAAACTGAGCGAAAA AGGC{ {28}}';xCT maju, 5'-GGACCGTCATCGGATCA G-3' dan mundur,5-CTCCACAGGCAGACCAGAAAA-3';COX-2 maju,5'-TGAGCAACTATTCCAAACCAGC{{ 37}}'dan mundur,5'-GCACGTAGTCTTCGATCACTATC-3';HO-1 maju.5'-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3' dan mundur,5'-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3'; dan -aktin maju,5'-GGCTGTATTCCCCCTCCATCG-3' dan mundur,5'-CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT-3'.
Nilai rata-rata ekspresi gen setelah normalisasi -aktin digunakan sebagai kalibrator untuk menentukan tingkat relatif gen target. Tingkat ekspresi relatif dari gen target dihitung menggunakan metode 2-△C (27).
Analisis statistik.
Analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software, Inc.) dan perangkat lunak SPSS 23 (IBM Corp.Data disajikan sebagai mean± standar deviasi dari tiga pengulangan independen kecuali dinyatakan lain. Satu arah ANOVA diikuti dengan uji post hoc Tukey digunakan untuk membandingkan perbedaan antara beberapa kelompok<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Hasil
PA(Asam pachymic)mengurangi cedera ginjal pada tikus dengan IRI(cedera iskemia-reperfusi). Scr dan BUN adalah dua indikator penting fungsi ginjal (5). Tingkat Scr dan BUN secara signifikan lebih tinggi di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan mereka yang berada di kelompok palsu (P<0.05; fig.="" 1a="" and="" b).="" treatment="" with="" mid-dose="" and="" high-dose="">(Asam pachymic)secara signifikan mengurangi peningkatan kreatinin serum dan urea dibandingkan dengan IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05); however,="" the="" levels="" of="" serum="" creatinine="" and="" urea="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" light-dose="">(Asam pachymic)kelompok perlakuan dan IRI(cedera iskemia-reperfusi) group (P>{}.05; Gambar 1A dan B).
Seperti yang disajikan pada Gambar. 1D, pewarnaan H&E jaringan ginjal pada kelompok palsu menunjukkan tidak ada perubahan signifikan dalam struktur jaringan ginjal. Sebaliknya, IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok menunjukkan edema dan hilangnya sel epitel tubulus ginjal, pelebaran tubulus, peradangan interstisial, infiltrasi sel inflamasi, deposisi kolagen, dan bahan nekrosis tabung deposisi (Gbr. 1D). Skor Paller, indikator cedera jaringan ginjal (26), secara signifikan lebih tinggi di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan kelompok palsu (P<0.05; fig.="" 1c).="" in="" particular,="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Asam pachymic)terapi secara signifikan memperbaiki lesi ini, dan skor Paller secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05); however,="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="">(cedera iskemia-reperfusi) model group and the low-dose group (P>{}.05; Gambar 1C).
Gambar 1. PA(Asam pachymic)mengurangi cedera ginjal setelah iskemia-reperfusi.(A) BUN dan (B) kreatinin serum diukur pada tikus di Sham, IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok , IRI plus PAL, IRI plus PAM, dan IRI plus PAH (40 menit iskemia ginjal diikuti dengan 24 jam reperfusi; n=6/kelompok). (C) Skor pucat digunakan untuk menilai cedera tubulus ginjal pada kelompok Sham, IRI, IRI plus PAL, IRI plus PAM, dan IRI plus PAH (n=3/grup). (D) Gambar hematoxylin dan eosin ginjal dari tikus di Sham, IRI(cedera iskemia-reperfusi), IRI plus PAL, IRI plus PAM, dan IRI plus PAH grup. Bilah skala, 50 m. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="" iri="" group.="">(Asam pachymic), asam pachydermic; BUN, nitrogen urea darah; IR,cedera iskemia-reperfusi; L, kelompok dosis rendah; M, kelompok dosis sedang; H, kelompok dosis tinggi.
Efek PA(Asam pachymic)pada perubahan morfologi mitokondria dalam jaringan ginjal tikus setelah IRI renal ginjal(cedera iskemia-reperfusi). TEM menunjukkan tidak ada perubahan signifikan dalam struktur mitokondria jaringan ginjal pada kelompok palsu. Pada kelompok model, perubahan mitokondria terkait ferroptosis, seperti penurunan volume mitokondria, peningkatan kepadatan membran, dan penurunan atau tidak adanya krista mitokondria, diamati pada jaringan ginjal (Gbr.2A). Dibandingkan dengan kelompok model, mitokondria dari kelompok dosis sedang terutama menunjukkan edema, dan perubahan spesifik karakteristik ferroptosis jarang terjadi (Gbr.2A). Namun, dalam PA . dosis tinggi(Asam pachymic)kelompok, tidak ada perubahan karakteristik ferroptosis yang diamati pada mitokondria jaringan ginjal, dan hanya tampak edema ringan (Gbr. 2A). Perubahan mitokondria pada kelompok dosis rendah sama seperti pada kelompok model (Gbr.2A).
Efek PA(Asam pachymic)pada ekspresi GSH dan MDA di IRI . ginjal(cedera iskemia-reperfusi). GSH adalah kofaktor yang diperlukan untuk fungsi GPX4. Sintesis GSH secara langsung mempengaruhi aktivitas GPX4. MDA adalah produk oksidasi lipid, yang mencerminkan tingkat peroksidasi lipid intraseluler dan secara tidak langsung mencerminkan terjadinya ferroptosis (28,29). Seperti yang disajikan pada Gambar. 2B, jaringan ginjal memiliki kadar GSH yang lebih rendah secara signifikan di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan kelompok palsu. Di antara kelompok terapi obat, ekspresi GSH secara signifikan lebih tinggi pada kelompok IRI plus PA dan IRI plus PAn dibandingkan dengan IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok model (P<0.05). however,="" gsh="" expression="" did="" not="" significantly="" differ="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">{}.05). Sebaliknya, seperti yang disajikan pada Gambar. 2C, peroksidasi lipid jaringan lebih besar (berdasarkan kadar MDA) di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan kelompok palsu. Di antara kelompok terapi obat, kadar MDA secara signifikan lebih rendah pada kelompok IRI plus PA dan IRI plus PAu dibandingkan dengan kelompok IRI.(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05). notably,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" in="" the="" levels="" of="" mda="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups="" (p="">0.05).
Gambar 2. PA(Asam pachymic)menurunkan ferroptosis di IRI(cedera iskemia-reperfusi)cedera ginjal akut.(A) Gambar mikroskop elektron transmisi di Sham, IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok , IRI plus PAL, IRI plus PAM, dan IRI plus PAH (40 menit iskemia ginjal diikuti dengan 24 jam reperfusi). Perbesaran, x20,000; bilah skala, 1 m. Panah hitam menunjukkan bahwa volume mitokondria menurun, kepadatan membran meningkat dan menurun, atau menghilangnya krista mitokondria yang diamati pada jaringan ginjal. Panah biru menunjukkan edema mitokondria. Tingkat (B) GSH dan (C) MDA dalam jaringan ginjal dinilai (n=6/kelompok). Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(cedera iskemia-reperfusi)kelompok. PA(Asam pachymic), asam pachydermic; IR,cedera iskemia-reperfusi; L, kelompok dosis rendah; M, kelompok dosis sedang; H, kelompok dosis tinggi; GSH, glutathione; MDA, malondialdehid.
PA(Asam pachymic)mengatur ekspresi protein terkait ferroptosis di IRI renal ginjal(cedera iskemia-reperfusi). Dalam penelitian ini, tingkat ekspresi protein terkait ferroptosis GPX4, xCT, dan HO-1 dideteksi melalui analisis western blotting (Gbr.3A dan B) dan RT-qPCR (Gbr.3C). Hasilnya menunjukkan bahwa kadar protein GPX4, xCT, dan HO-1 secara signifikan diturunkan regulasinya di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan kelompok palsu (P<0.05)(fig.3a and="" b).="" similar="" results="" were="" demonstrated="" following="" rt-qpcr="" analysis.="" in="" addition,="" treatment="" with="" moderate-dose="" and="" high-dose="">(Asam pachymic)secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi protein dan mRNA GPX4, xCT, dan HO-1 dibandingkan dengan IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05). however,="" no="" significant="" differences="" in="" protein="" and="" mrna="" expression="" levels="" of="" gpx4.xct="" and="" ho-1="" were="" observed="" between="" the="">(cedera iskemia-reperfusi)dan PA dosis rendah(Asam pachymic) treatment groups (P>{}.05; Gbr.3B dan C).
Gambar 3. PA(Asam pachymic)meningkatkan tingkat ekspresi protein terkait ferroptosis, GPX4, xCT, dan HO‑1.( A ) Western blotting dilakukan untuk mendeteksi tingkat ekspresi protein terkait ferroptosis, GPX4, xCT, dan HO‑1 di IRI(cedera iskemia-reperfusi)tikus cedera ginjal akut (n=3). (B) Ekspresi relatif nilai abu-abu untuk GPX4, xCT, dan HO‑1. (C) Transkripsi terbalik, analisis PCR kuantitatif dilakukan untuk mendeteksi tingkat ekspresi mRNA dari protein terkait ferroptosis (n=3). Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(cedera iskemia-reperfusi)kelompok. PA(Asam pachymic), asam pachydermicd; GPX4, glutathione peroksidase 4; xCT, sistem pengangkut glutamat; HO‑1, heme oksigenase 1; IR,cedera iskemia-reperfusiy; L, kelompok dosis rendah; M, kelompok dosis sedang; H, kelompok dosis tinggi.
Hasilnya menunjukkan bahwa kadar protein dan mRNA dari protein peroksidasi lipid terkait ferroptosis, COX-2 secara signifikan diregulasi selama IRI(cedera iskemia-reperfusi)(Gbr.4). Pengobatan dengan PA dosis sedang dan dosis tinggi(Asam pachymic)secara signifikan menurunkan ekspresi COX-2 dibandingkan dengan IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="">(cedera iskemia-reperfusi)dan PA dosis rendah(Asam pachymic) treatment groups (P>{}.05; Gambar 4).
Gambar 4. PA(Asam pachymic)menurunkan tingkat ekspresi protein terkait ferroptosis, COX‑2.(A) Western blotting dilakukan untuk mendeteksi tingkat ekspresi protein penanda peroksidasi lipid ferroptosis, COX‑2 pada tikus cedera ginjal akut IRI‑. (B) Ekspresi relatif nilai abu-abu untuk COX‑2. (C) Transkripsi terbalik‑analisis PCR kuantitatif dilakukan untuk mendeteksi ekspresi mRNA COX‑2 (n=3). Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. * P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(cedera iskemia-reperfusi)kelompok. PA(Asam pachymic), asam pachydermic; COX‑2, siklooksigenase 2; IR,cedera iskemia-reperfusi; L, kelompok dosis rendah; M, kelompok dosis sedang; H, kelompok dosis tinggi.
PA(Asam pachymic)mempromosikan aktivasi jalur pensinyalan NRF2 di IRI renal ginjal(cedera iskemia-reperfusi).Untuk menyelidiki efek PA(Asam pachymic)pada jalur pensinyalan NRF2, tingkat protein dan mRNA NRF2 dinilai (Gbr.5). Hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi NRF2 secara signifikan lebih rendah di IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok dibandingkan dengan kelompok palsu. Selain itu, ekspresi NRF2 secara signifikan lebih tinggi pada kelompok IRI plus PAw dan IRI plus PAH dibandingkan dengan kelompok IRI(cedera iskemia-reperfusi)kelompok (P<0.05); however,="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" iri+pa,="" and="" iri="" groups(p="">{}.05). Selanjutnya, pengobatan dengan PA(Asam pachymic)juga meningkatkan ekspresi NRF2 dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr.5).
Gambar 5. PA(Asam pachymic)mengaktifkan jalur pensinyalan NRF2.(A) Western blotting dilakukan untuk mendeteksi ekspresi protein NRF2 di IRI(cedera iskemia-reperfusi)tikus cedera ginjal akut. (B) Ekspresi relatif nilai abu-abu untuk NRF2 (n=3). (C) Transkripsi terbalik, analisis PCR kuantitatif dilakukan untuk mendeteksi ekspresi mRNA NRF2 (n=3). Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi. *P<0.05 vs.="" sham="" group;="" #=""><0.05 vs.="">(cedera iskemia-reperfusi)kelompok. PA(Asam pachymic), asam pachydermic; NRF2, faktor inti eritroid yang diturunkan 2 seperti 2; IR,cedera iskemia-reperfusi; L, kelompok dosis rendah; M, kelompok dosis sedang; H, kelompok dosis tinggi.
