Bagian 2: Farmakologi Jaringan Terintegrasi Dan Model Ikan Zebra Untuk Menyelidiki Komponen Efek Ganda Cistanche Tubulosa Untuk Mengobati Penyakit Osteoporosis Dan Alzheimer
Mar 30, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
KLIK DI SINI UNTUK BAGIAN 1
3. Hasil
3.1 Senyawa Kandidat dan PoTarget potensial
Dalam penelitian kandungan kimia CT, total 75 bahan diperoleh dari TCMSP. Kemudian PCA dilakukan untuk memvisualisasikan distribusi kimia CT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, bahan-bahan CT beragam dalam ruang kimia, dan 28 di antaranya memenuhi aturan lima Lipinski (Lipinski, 2003). Menariknya, ada banyak bagian yang tumpang tindih antara bahan CT dan obat molekul kecil yang disetujui untuk OP/AD. Ini menggambarkan bahwa banyak senyawa dalam CT memiliki potensi druggability pada OP/AD. Untuk mengevaluasi lebih lanjut druggability mereka, 43 senyawa disaring oleh DL. Setelah prediksi target, 26 senyawa kandidat dipilih untuk analisis selanjutnya. Dan mereka dapat ditambatkan dengan total 847 protein target.
cistamchememiliki efek penyakit anti-Alzheimer.
Entri gen yang terkait dengan OP atau AD dikumpulkan dari database DisGeNET dan GeneCards. Akibatnya, 3052 dan 8042 entri gen masing-masing dikumpulkan. Kami mengadopsi dua skor dari database DisGeNET dan GeneCards sebagai skor evaluasi, menyaring kelima target teratas. Rasio seperlima ditentukan oleh pra-eksperimen. Kemudian 211 target umum OP-ED dipertahankan agar sesuai dengan target dari 26 senyawa kandidat. Akhirnya, total 81 target protein (Tabel Tambahan S2) yang terhubung dengan 22 senyawa kandidat (Tabel Tambahan S3) dipilih untuk mekanisme molekuler analisis aksi, membentuk jaringan interaksi protein-protein (PPI) yang ditunjukkan pada Gambar 2.
Ke-22 senyawa tersebut dibagi menjadi 11 kategori: 5 glikosida fenilethanoid (PhGs) (Decaffeoylacteoside, Cistanoside E, dll.), 3 fenilakril oligosakarida (Cistanoside H, Cistanoside F, dll.), 3 glikosida iridoid dan iridoid (Leonuride, Asam Geniposidik, dll.), 3 lignan dan lignan glikosida (Yangambin, ( plus )-Pinoresinol-O- -D-glucopyranoside, dll.), 2 flavonoid (quercetin, genistein), 1 alkaloid, 1 terpene, 1 sterol, 1 alkohol lemak, 1 asam lemak, dan lainnya. Menurut laporan sebelumnya, senyawa tersebut merupakan komponen utama atau bahan fungsional aktif CT (Fu et al., 2018).
Pada Gambar 2, total 81 target umum ditemukan memiliki korelasi dengan OP dan AD. Derajat PPI diadopsi sebagai parameter karakteristik untuk menentukan signifikansi target potensial. Top 5 protein target diduga terkait dengan OP dan AD adalah albumin (ALB), insulin (INS), interleukin 6 (IL6), TNF-alpha (TNF), dan faktor pertumbuhan epidermal (EGF).
Gambar 1.Distribusi kimia berdasarkan analisis komponen utama (PCA).
3.2 Analisis Jaringan Terintegrasi dan Terklasifikasi
81 protein target diduga dalam Tabel S2 dipilih untuk memulai analisis pengayaan jalur GO dan KEGG. Setelah memfilter berdasarkan nilai-p (batas GO Kurang dari atau sama dengan 0.05, batas jalur KEGG Kurang dari atau sama dengan 0,01), 15 istilah GO dan 66 KEGG istilah jalur dikembalikan, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3 dan 4. Sebanyak 16 istilah GO disertakan: 5 untuk fungsi molekuler, 5 untuk proses biologis, dan 6 untuk komponen seluler. Karena penelitian ini bertujuan untuk menemukan potensi patogenesis umum OP dan AD, kami menghapus istilah jalur yang terkait langsung dengan penyakit lain dan mengklasifikasikan sisanya ke dalam kategori fungsional yang berbeda. Disarankan bahwa 22 bahan aktif CT dapat mengatur total 66 jalur yang terutama berkorelasi dengan transduksi sinyal, sistem endokrin, sistem kekebalan, pertumbuhan sel, dan kematian untuk memainkan peran konfrontatif terhadap OP dan AD.
Untuk mengungkapkan perbedaan aksi berbagai jenis senyawa, jaringan PPI yang dibangun pada Gambar 2 dianalisis menurut kategorinya pada Tabel S3. Gambar 5 mengilustrasikan bahwa 5 PhGs, 2 flavonoid, 1 terpene, dan 1 sterol, khususnya flavonoid, mungkin lebih penting daripada bahan lain dari CT terhadap OP dan AD. Setelah itu, 4 rangkaian senyawa aktif ini dipilih untuk mengungkap jalur terkompresinya. Seperti terlihat pada Gambar 6, PhGs, flavonoid, terpene, dan sterol bekerja bersama atau sendiri-sendiri pada 27 jalur, mengandung 11 modul: pertumbuhan dan kematian sel, sistem endokrin, sistem imun, transduksi sinyal, perkembangan, dan lain-lain. Hasil menunjukkan bahwa senyawa ini mungkin memainkan peran sinergis dalam efek positif CT pada OP dan AD. Perlu dicatat bahwa efek perlindungan PhGs bisa lebih luar biasa daripada flavonoid pada penyakit neurodegeneratif karena PhGs memiliki interaksi langsung dengan jalur penyakit Alzheimer sedangkan flavonoid terkait dengan molekul sinyal dan interaksi. Hanya sterol dan terpene yang berhubungan dengan metabolisme lipid dan sistem ekskresi. Selain itu, PhGs, terpene, dan flavonoid menunjukkan hubungan potensial dengan penyakit endokrin dan metabolik.
Menurut ilustrasi PPI, 2 flavonoid (GE, QU), 1 terpene (AA), dan 1 sterol (BSS) diadopsi sebagai senyawa berharga untuk penelitian lebih lanjut tentang mekanisme molekuler. Menariknya, kami menemukan bahwa semuanya saling terkait dengan jalur pensinyalan MAPK dan jalur pensinyalan TGF-beta. Dan nilai p dari dua jalur juga jauh lebih tinggi. Target diduga dari 4 senyawa berharga dan distribusi protein yang terpengaruh dalam dua jalur ditunjukkan pada Gambar 7.
3.3 Validasi Khasiat Senyawa Berharga
Dalam analisis jaringan yang dibuat pada 3.2, kami menangkap 4 senyawa berharga untuk validasi aktivitas farmakologis. Dengan metode analisis struktur topologi dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa genistein (GE, C9, DL=0.21), quercetin (QU, C11, DL=0.28), asam abietat (AA, C19, DL=0.28), dan -sitosterol (BSS, C20, DL=0.21) menunjukkan interaksi yang layak untuk melawan OP dan AD. Pada bagian ini, larva ikan zebra dalam model in vivo yang diinduksi oleh Pre atau AlCl3 dibuat masing-masing untuk mengevaluasi efek perlindungan dari 4 senyawa terhadap OP dan AD.
3.3.1. Pengaruh 4 senyawa pada OP
Untuk mendeteksi apakah 4 senyawa memiliki efek perlindungan terhadap OP, Pre digunakan untuk membuat model ikan zebra OP. Perkembangan osteoblas pertama kali diperiksa dengan pewarnaan alizarin red untuk menyelidiki efek langsung dari 4 senyawa pada pembentukan tulang. Dibandingkan dengan ikan zebra kontrol, Pre tampaknya menginduksi perubahan morfologi tulang dan kepadatan tulang tengkorak ikan zebra dalam kelompok model (Gambar 8). Penurunan area pewarnaan dan IOD pada kelompok Pra dan tren sebaliknya pada kelompok Ed juga secara visual menunjukkan keberhasilan model OP. Terlebih lagi, area pewarnaan dan 2 IOD tengkorak ikan zebra pada kelompok BSS/GE/QU/AA meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok model (Gambar 9). Penanda khas pembentukan dan resorpsi tulang seperti ALP dan TRAP diuji untuk mengevaluasi lebih lanjut efek anti-osteoporosis dari 4 senyawa. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 10, Pre secara signifikan menurunkan aktivitas ALP dan meningkatkan aktivitas TRAP berbeda dengan kelompok kontrol. Sebaliknya, senyawa Ed dan 4 secara nyata menunjukkan kecenderungan yang berlawanan dengan kelompok Pre pada aktivitas ALP dan TRAP ikan zebra. Hasil-hasil ini digabungkan bersama-sama menegaskan bahwa BSS, QU, GE, dan AA mungkin memainkan peran positif dalam pembentukan tulang pada ikan zebra OP yang diinduksi sebelumnya.
3.3.2. Pengaruh 4 senyawa pada AD
Untuk mengevaluasi efek perlindungan terhadap AD dari 4 senyawa, model ikan zebra AD yang diinduksi AlCl3-yang dikenal baik telah digunakan. Untuk model diskinesia AD ini, penganalisis perilaku digunakan untuk melacak pergerakan ikan zebra. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 11, AS dari kelompok AlCl3 secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol, sedangkan untuk DPZ dan keempat senyawa ASs mendekati kontrol. PRB dan RE tercantum dalam Tabel S4. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi GE, BSS, QU, dan AA meningkatkan DRR sebesar 2.37-37.64 persen , 60.18-103.92 persen , 70.{{14 }}.61 persen , 2.37-42.64 persen , masing-masing dengan signifikan parsial (p-value < 0.001-0.01).="" ss="" dalam="" kelompok="" kontrol,="" kelompok="" alcl3,="" dan="" kelompok="" dpz="" lebih="" lanjut="" mendukung="" bahwa="" pembangunan="" model="" ad="" berhasil.="" re="" untuk="" ge,="" bss,="" qu,="" dan="" aa="" adalah="" 13.12-50.45="" persen="" ,="" 11.41-63.09="" persen="" ,="" 1.63-66.89="" persen="" ,="" 13.{{34}="" },09="" persen="" masing-masing.="" hasil="" ini="" dengan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" menunjukkan="" bahwa="" ge,="" bss,="" qu,="" dan="" aa="" dapat="" meningkatkan="" diskinesia="" ikan="" zebra="" sampai="" batas="" tertentu.="" penentuan="" aktivitas="" penanda="" konduksi="" saraf="" (ache="" dan="" chat)="" pada="" kelompok="" ditunjukkan="" pada="" gambar="" 12.="" alcl3="" secara="" signifikan="" meningkatkan="" aktivitas="" ache="" dan="" menurunkan="" aktivitas="" chat="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol.="" tetapi="" senyawa="" dpz="" dan="" 4="" menunjukkan="" kemampuan="" untuk="" memulihkan="" sebagian="" perubahan="" yang="" disebabkan="" oleh="" alcl3="" dalam="" aktivitas="" ache="" dan="" chat.="" hal="" ini="" sesuai="" dengan="" hasil="" evaluasi="" diskinesia="" efek="" rehabilitasi.="" kesimpulannya,="" ge,="" bss,="" qu,="" dan="" aa="" berpotensi="" menjadi="" agen="" anti-ad="" yang="">
3.4 Validasi Target Putatif
Untuk memverifikasi target diduga yang diprediksi dalam pekerjaan ini, target yang terkait dengan jalur pensinyalan MAPK dan TGF-beta dipilih untuk analisis qRT-PCR. Tingkat ekspresi mRNA relatif mereka dalam model OP ditunjukkan pada Gambar 13. Dibandingkan dengan kelompok Pra, GE meningkatkan tingkat mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2, dan penurunan tingkat tp53, TNF-, jun, tgfbr1, dan c-fos . QU meningkatkan level mapk14a, fgfr1b, tgfb1, bmp2, dan menurunkan level tp53, jun, dan il1b. BSS hanya menunjukkan efek reduksi pada tp53, TNF- , dan mapk3. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 14, dalam model AD, GE, QU, BSS, dan AA mengurangi tingkat ekspresi mRNA tp53. GE dan QU keduanya menurunkan kadar TNF- , bmp2, tgfbr1, sp1, tgfb2, dan ifn , dan meningkatkan kadar jun, sedangkan GE dan AA meningkatkan kadar mapk3. Hanya GE yang muncul untuk membalikkan kebangkitan mapk14a, fgfr1b, fgfr1a, dan igf1ra. Selain itu, QU menurunkan kadar il1b dan EGF yang tinggi. Tingkat ekspresi mRNA relatif dari gen termasuk tp53, TNF-, mapk14a, mapk3, fgfr1b, bmp2, jun, il1b, dan tgfbr1 berubah secara signifikan berbeda dengan kelompok kontrol di setiap model. Hasil ini menunjukkan bahwa mereka dapat berfungsi sebagai penghubung antara kedua penyakit. Selain itu, hasil ini juga menyarankan kemungkinan efek sinergis dari 4 senyawa.
4. Diskusi
OP dan AD adalah penyakit klinis paling umum yang terkait dengan penuaan. Mekanisme patofisiologinya yang kompleks telah membatasi pengobatan yang efektif dari dua penyakit selama bertahun-tahun. Faktor risiko OP dan AD menunjukkan bahwa kelompok rentan kedua penyakit tersebut sebagian mirip, seperti wanita lanjut usia (Abraham et al., 2013; Patel, 2017), penderita diabetes (Vieira et al., 2018; Xia et al., 2012), perokok jangka panjang (Franic dan Verdenik, 2018; Zhong et al., 2015), dan individu yang tidak aktif (Koedijk et al., 2017; Sofi et al., 2011). Lebih lanjut, penelitian saat ini telah mengidentifikasi bahwa beberapa protein kunci dalam AD juga memiliki fungsi dalam metabolisme tulang (Li et al., 2016; Pan et al., 2018). Ada alasan untuk percaya bahwa OP dan AD tidak sepenuhnya independen, bahkan memiliki beberapa koneksi potensial. Ini menyarankan terapi homo potensial untuk heteropati, yang berarti mengobati OP dan AD dengan terapi yang sama.
Atas dasar tujuan terapeutik dan prinsip TCM, maladjustment pada penyakit dapat diklasifikasikan menjadi beberapa "pola". Jadi beberapa penyakit seperti OP dan AD mungkin berbagi satu "pola" dan dirawat oleh TCM yang sama (Jiang, 2005). Sebagai ramuan tonik ginjal, CT banyak digunakan dalam pengobatan OP dan AD. Studi modern telah memberikan beberapa bukti kompak bahwa CT memiliki tindakan farmakologis positif pada kerangka dan sistem saraf. Namun, masih perlu penelitian lebih rinci untuk mengungkap mekanisme CT.
cistanche dan tongkat alimemilikitindakan farmakologis positifpadakerangka dan sistem saraf.
Dalam penelitian ini, untuk pemahaman yang jelas tentang efek CT pada OP dan AD, pendekatan farmakologi jaringan dibuat untuk memprediksi kemungkinan bahan aktif dan menganalisis jalur terkait. Berbeda dengan studi farmakologi jaringan sebelumnya pada CT (Liu et al., 2017). Jaringan molekuler "satu obat - dua penyakit" dilakukan untuk pertama kalinya, bukan hanya berfokus pada satu penyakit. Di satu sisi, analisis jaringan terintegrasi menemukan total 22 senyawa aktif CT dengan efek ganda untuk mengobati OP dan AD. Di sisi lain, pola kedua penyakit tersebut memberikan dukungan untuk mengungkap hubungan mereka. Analisis rahasia menunjukkan bahwa senyawa aktif ini mungkin memiliki efek sinergis pada banyak modul fungsi biologis dan PhG, flavonoid, terpene, dan sterol menunjukkan khasiat yang lebih baik. Untuk memverifikasi kelayakan dan kesesuaian jaringan yang dilakukan ini, ikan zebra digunakan untuk membangun model OP dan AD in vivo dan mengevaluasi kemanjuran empat senyawa. Dan validasi target diduga diterapkan untuk mengungkapkan potensi sinergi mereka. Studi gabungan ini secara in silico dan in vivo memberikan titik awal baru untuk mengungkapkan efek perlindungan CT pada dua penyakit. Ini dapat memberikan petunjuk baru tentang korelasi antara patogenesis OP dan AD, serta membantu pengembangan strategi terapeutik di masa depan untuk dua penyakit. Meskipun demikian, metode ini masih membutuhkan perbaikan dan kesempurnaan untuk sepenuhnya mengeksplorasi mekanisme sinergis CT untuk mengobati OP dan AD. Dalam penelitian ini, hanya senyawa tertentu yang dipilih untuk validasi. Penting untuk memverifikasi lebih lanjut 18 konstituen aktif lainnya dengan target dan jalur yang mendasarinya melalui eksperimen. Dan kesamaan antara OP dan AD masih perlu dieksplorasi dan ditemukan lebih lanjut, terutama dari perspektif pengobatan.
beli cistanche dimana
Dalam penelitian kami, BSS, GE, AA, dan QU terbukti memiliki efek perlindungan pada OP dan AD pada ikan zebra. Lebih menyenangkan lagi, konstituen berharga ini juga telah divalidasi secara eksperimental dalam literatur lain dan menunjukkan aktivitas farmakologis yang konsisten dengan yang ada di makalah ini (Ayaz et al., 2017; Chauhan et al., 2018; King et al., 2015; Ramnath et al. , 2018; Thummuri et al., 2018; Vargas-Restrepo et al., 2018; Wang et al., 2019; Yuan et al., 2018). Ini lebih lanjut membuktikan efektivitas dan rasionalitas jaringan ini dan menunjukkan efek ganda dari 18 senyawa yang tersisa. Untuk validasi target yang diduga, 9 target efektif yang terdiri dari TP53, JUN, TNF, IL1B, MAPK14, MAPK3, FGFR1, BMP2, dan TGFBR1 akhirnya disaring sebagai target umum OP dan AD. TP53 adalah penekan tumor utama, dan aktivasinya dapat menginduksi apoptosis neuron (Xiao et al., 2019). TP 53, JUN, dan SP1 merupakan faktor transkripsi aktif pada OP primer (Xie et al., 2015). TNF dan IL1B adalah sitokin inflamasi yang umum dengan fungsi mempromosikan osteoklastogenesis (Geissler et al., 2018) dan pengeroposan tulang (Sang et al., 2017). Lebih lanjut, keduanya merupakan target terapeutik untuk AD melalui penghambatan peradangan saraf untuk melindungi neuron (Liu et al., 2017). TGFB1, TGFB2, TGFBR1, dan TGFBR1 memiliki efek kompleks pada peradangan saraf (Lippa et al., 1998) dan osteolisis (Quinn et al., 2001). Protein morfogenetik tulang (BMPs) adalah salah satu faktor yang terlibat dalam diferensiasi glial sel progenitor saraf (Kwak et al., 2014). Ekspresi BMP2 yang diregulasi telah terbukti berperan penting dalam diferensiasi osteoblas (Li et al., 2017). Selain target yang divalidasi secara eksperimental ini, 81 target umum yang tercantum dalam Tabel S2 juga diharapkan menjadi target terapeutik, tetapi belum pernah diteliti atau memiliki studi pendahuluan dalam penelitian lain.
Patut dicatat bahwa target berharga ini semuanya terkait dengan jalur pensinyalan MAPK dan TGF-beta berdasarkan analisis pengayaan KEGG. Jalur pensinyalan MAPK mengatur proliferasi sel, diferensiasi, kelangsungan hidup atau apoptosis, peradangan, dan kekebalan bawaan. Telah dilaporkan bahwa jalur pensinyalan MAPK yang dikompromikan berkontribusi pada patologi neurodegenerasi seperti AD (Kim dan Choi, 2015) serta menghambat osteoblas secara langsung (Xiao et al., 2019). Adapun anggota keluarga TGF-, mereka memainkan peran berbeda dalam kerangka dengan efek langsung pada kerusakan tulang (Sun et al., 2016), sedangkan aktivasi pensinyalan TGF-beta neuronal meningkatkan gangguan neurodegeneratif dan penyakit mirip AD (Tesseur et al. ., 2006). Dengan demikian, jalur pensinyalan MAPK dan TGF-beta dapat diharapkan menjadi mekanisme bersama untuk mengungkapkan patogenesis OP dan AD atau memperlambat perkembangannya. Selain kedua jalur tersebut, 22 senyawa aktif yang mengatur total 66 jalur, terutama jalur dengan nilai p tertinggi, seperti jalur pensinyalan Prolaktin, jalur pensinyalan FoxO, dan diferensiasi sel Th17 juga akan layak mendapat perhatian dan penelitian dan sebagai kunci untuk mengungkap korelasi antara OP dan AD. Akhirnya, penemuan yang diringkas mungkin menyiratkan hubungan antara dua penyakit dalam sistem kekebalan dan sistem endokrin.
5. Kesimpulan
Dalam karya ini, kami mengusulkan pendekatan farmakologi jaringan, menggabungkan analisis PCA, skrining DL, pengumpulan dan prediksi beberapa target, konstruksi jaringan PPI, serta analisis jalur GO dan KEGG untuk menyelidiki efisiensi CT untuk pengobatan OP dan AD. Hasil kami menunjukkan bahwa 22 bahan aktif CT mungkin terutama mengatur transduksi sinyal, sistem endokrin, sistem kekebalan, pertumbuhan sel, dan kematian untuk memainkan peran penting dalam pengobatan OP dan AD. Untuk membuat pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme CT, jaringan ini digali dan dianalisis secara mendalam tergantung pada jenis senyawanya. Pada akhirnya, kami menerapkan model OP dan AD ikan zebra secara terpisah untuk mengidentifikasi 4 senyawa berharga dan target terkait, menyediakan metode yang layak untuk menghubungkan genom dengan farmakodinamik dan menemukan senyawa efek ganda.
