Bagian 2 Deteksi Produk Obat Cistanches Herba (Rou Cong Rong) Menggunakan Tanda Tangan Nukleotida Spesifik

Dengan mencari tanda tangan nukleotida yang dikembangkan dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa 15 dari 31 obat paten Tiongkok berlabel mengandungCistanches Herbamalah mengandung pezina, termasuk delapan bahan palsu dan tujuh pezina (Tabel 2). Misalnya, enam batch diganti dengan Cy. songaricum, termasuk tiga batch pil Shihu Yeguang, satu batch pil Kangguzhi Zengsheng, satu batch kapsul Sanbao, dan satu batch partikel Wenweishu.

Selain itu, batch yang berbeda dari produsen yang sama menghasilkan hasil yang agak berbeda. Misalnya, di antara tiga batch dari satu pabrik (ZCY16, ZCY69, dan ZCY71), satu batch terdiri dari campuran Ci.deserticoladan Cy. songaricum, satu batch terdiri dari campuranCi. deserticoladanCi. tubulosadan satu batch hanya berisiCi. tubulosa. Dua batch dari pabrikan lain (ZCY44 dan ZCY70) juga berbeda: satu batch berisi Cy. songaricum, sedangkan batch lainnya berisiCi. deserticoladanCi. tubulosa.

Cistanches Herbaterdeteksi pada 23 dari 31 obat paten Cina yang diuji (Tabel 2), dan hanya 16 sampel yang asli, misalnya, tanpa bahan pezina atau palsu.Ci. tubulosaterdeteksi dalam 16 batch obat paten Cina, dan Ci. deserticola terdeteksi dalam 10 batch. O. coerulescens tidak terdeteksi di salah satu produk (Tabel 2).

Cistanche deserticola memiliki banyak efek, klik di sini untuk tahu lebih banyak

DISKUSI

Perlunya Pengembangan Metode Baru untuk Pemantauan Produk Obat Yang Dipasarkan MengandungCistanchesjamu

Cistanches Herbaadalah tonik yang banyak digunakan dalam obat paten restoratif Cina dan produk obat lainnya. Namun, kontrol kualitas obat paten China menghadirkan tantangan besar karena keragaman dan kompleksitas bahannya. Karena kurangnya pengawasan peraturan, ada peluang besar untuk pemalsuan atau pemalsuan produk. Selain itu, semua produk harus diproses sesuai dengan Farmakope atau standar lainnya; pemalsuan atau pemalsuan tidak diizinkan selama pemrosesan. Dengan demikian, varietas metode kontrol kualitas telah ditetapkan, seperti kromatografi cair dua dimensi multi-hati (Yao et al., 2015), spektroskopi reflektansi inframerah-dekat (Zhang dan Su, 2014; Zhang et al., 2015). ), dan kromatografi cair-spektrometri massa (Wang et al., 2016b). Namun, metode kimia analitik yang saat ini ada di Komisi Farmakope Tiongkok (2015) tidak dapat digunakan untuk mengotentikasi semua bahan dalam obat paten Tiongkok atau untuk mendeteksi keberadaan bahan yang tidak benar. Selain itu, penelitian telah menunjukkan bahwa metabolit yang ditargetkan pada tanaman diubah selama pemrosesan produk, menghasilkan variabilitas yang cukup besar dalam hasil pengujian atau kegagalan total metode pengujian (Ananingsih et al., 2013). Dengan demikian, alat molekuler seperti tanda tangan nukleotida spesifik spesies siap untuk memperkuat sistem kontrol kualitas terhadap risiko substitusi produk palsu dan pemalsuan dan penyertaan bahan yang tidak berlabel.

Meskipun ITS/ITS2 dianggap sebagai alat berefisiensi tinggi untuk mengidentifikasi obat-obatan herbal, urutan ini tidak dapat diperkuat dari sampel yang sangat diproses (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang dkk. melaporkan bahwa ITS2 tidak dapat diamplifikasi dari ekstrak Angelicae Sinensis Radix atau rebusan yang direbus selama lebih dari 120 menit (Wang et al., 2016a). Menurut teknologi tradisional dan Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Cistanches Herba selalu diproses untuk meningkatkan khasiat obatnya; proses ini, termasuk pengeringan oven, pengasinan, dan pengukusan dengan anggur (Zou et al., 2017), yang menyebabkan degradasi DNA. Selain itu, berbagai eksipien ditambahkan selama pemrosesan, seperti madu, pati, dan dekstrin. Jika eksipien ini tidak dihilangkan sepenuhnya, kemurnian DNA akan terpengaruh. Misalnya, proses pembuatan berikut digunakan untuk menghasilkan kapsul Sanbao yang mengandung Cistanches Herba: "Rebus irisan obat selama 1,5 jam dua kali, gabungkan decoctions dan saring campurannya. Konsentrasikan filtrat ke kepadatan relatif 1,20∼1,25 (pada 80 C). Tambahkan bubuk halus lainnya dan campurkan untuk mendapatkan campuran yang homogen. Selanjutnya, keringkan campuran tersebut pada suhu 60◦C, lalu giling hingga halus.

bubuk." Namun, setelah proses produksi yang dijelaskan di atas, mungkin ada kesulitan selama ekstraksi DNA obat paten Cina, dan fragmen panjang mungkin tidak diperkuat dari DNA yang terdegradasi, yang akan mencegah identifikasi pezina. Jadi, untuk memastikan kualitas dan kemurnian DNA, kami menambahkan langkah-langkah tambahan sebelum ekstraksi DNA genom, termasuk mencuci dengan buffer prewash dan mengelusi sepuluh tabung paralel ke dalam satu tabung untuk setiap batch.

Meskipun semua obat paten Cina yang digunakan dalam penelitian ini mengandung 6-25 bahan, pasangan primer yang dikembangkan secara khusus dapat memperkuat urutan pezina dalam obat paten Cina ini. Urutan langsung produk PCR menunjukkan file jejak yang bersih. Dengan demikian, metode tanda tangan nukleotida ini mampu mengidentifikasi baik bahan spesies asli maupun bahan pezina dan harus memperluas penerapan alat diagnostik molekuler berbasis DNA untuk pengawasan pasar.

cedera dan penyakit ginjal dapat diobati dengan cistanche

Tanda Tangan Nukleotida untuk Identifikasi Produk Herba Cistanches yang Efektif

Alat molekuler yang memanfaatkan teknologi PCR sangat menjanjikan untuk otentikasi produk obat dalam sistem kendali mutu. Penerapan primer yang berhasil untuk mengidentifikasi pezina terdegradasi DNA dari Cistanches Herba menunjukkan bahwa metode deteksi berbasis PCR dapat digunakan secara luas. Di pasar jamu Cina, harga bahan-bahan asli spesies Cistanches Herba lebih dari lima kali lipat dari harga bahan pezinanya. Hasil kami menunjukkan bahwa Cy. songaricum adalah pezina Cistanches Herba yang paling umum di pasaran, diikuti oleh Ci. Sinensis. cy. songaricum ditambahkan karena obat-obatan ini memiliki karakteristik morfologi yang sama. Selain itu, komposisi kimia Ci. sinensis mirip dengan Cistanches Herba. Sebagai penanda kontrol kualitas untukCistanches Herbaekstrak, echinacoside dan acteoside dapat diekstraksi dengan murah dari Ci. sinensis. Dengan demikian, beberapa pabrik farmasi menggunakan Ci. sinensis sebagai pengganti dalam produksi ekstrak Cistanches Herba. Secara keseluruhan, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada banyak penipuan di pasar produk obat.

Pemalsuan dalam pengobatan paten Cina mirip dengan yang ditemukan di negara lain. Tingkat pemalsuan serupa telah dicatat di Amerika Utara (Newmaster et al., 2013), Eropa (Raclariu et al., 2017), dan Asia (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). Dalam penelitian ini, tingkat pemalsuan obat paten Cina adalah sekitar 48,4 persen, dengan hanya 16 dari 31 sampel yang asli Cistanches Herba. Selain itu, kami berspekulasi bahwa hasil yang berbeda yang dihasilkan dalam produk dari produsen yang sama dapat dikaitkan dengan perbedaan kualitas batch yang berbeda dari bahan obat Cina. Oleh karena itu, untuk mengontrol kualitas obat paten China, bahan baku harus diautentikasi sebelum diolah menjadi produk.

PemalsuanCistanches Herbasecara tradisional dikaitkan dengan masalah penawaran dan permintaan bahan baku.Ci. deserticoladanCi. tubulosaadalah dua tanaman asli yang saat ini digunakan untuk memformulasiCistanches Herba. Namun, Ci. deserticola adalah satu-satunya spesies asli dalam Cistanches Herba tradisional otentik yang terdaftar di Chinese Pharmacopoeia Commission (2000), di mana Ci. tubulosa diidentifikasi sebagai pezina. Karena kekurangan Ci. sumber daya deserticola,Ci. tubulosatelah terdaftar sebagai suplemen di Farmakope Cina sejak 2005 (Jiang dan Tu, 2009). Sampai saat ini, harga jamu ini sangat berbeda; Ci. tubulosa jauh lebih murah daripada Ci. deserticola karena ada pasokan yang jauh lebih besar dari yang pertama. Di sini, hasil kami menunjukkan bahwa Ci. tubulosa lebih banyak digunakan dalam produk Cistanches Herba yang tersedia secara komersial.

Kesimpulannya, tanda tangan nukleotida dan berbasis PCR

metode yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat berfungsi sebagai alat yang berguna bagi industri produk obat untuk mengautentikasi bahan dan mendeteksi bahan pezina diCistanchesproduk herbal. Sesuai hasil sensitivitas, meskipun proporsi pezina adalah satu dari sepuluh ribu, itu dapat dideteksi melalui qRT-PCR. Ini berarti bahwa sekali tanda tangan nukleotida terdeteksi diCistanchesProduk fungsional yang mengandung herba, dapat diidentifikasi sebagai bahan pezina atau palsu. Sebuah solusi baru untuk mendeteksi bahan palsu atau Cistanches Herba yang dipalsukan disediakan yang sebelumnya tidak tersedia melalui metode deteksi kimia di Farmakope Cina. Selain itu, metode ini dapat digunakan untuk memvalidasi peningkatan jenis obat dan untuk memperluas aplikasi alat diagnostik molekuler berbasis DNA untuk pengawasan pasar.

Untuk meringankankronisginjalpenyakitdengancistanche

KONTRIBUSI PENULIS

JH menyusun penelitian dan berpartisipasi dalam desainnya. XW, RX, dan JC menyumbangkan sampel dan melakukan eksperimen. XW menganalisis data. XW, JH, ZZ, S-GN, JS, dan SC menyusun naskah. Semua penulis telah membaca dan menyetujui naskah akhir.

PENDANAAN

Pekerjaan ini didukung oleh National Natural Science Foundation of China [nomor hibah 81673552], Inovasi CAMS

Fund for Medical Sciences [nomor hibah 2016-I2 M- 3-016], dan United Fund Key Project dari National Natural Science Foundation of China [nomor hibah U1403224].

UCAPAN TERIMA KASIH

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada rekan-rekan kami yang membantu dengan pengumpulan sampel, identifikasi, pekerjaan laboratorium, dan persiapan naskah, termasuk Chaokui Sun, Dianyun Hou, dan Piao Zhang.

MATERI TAMBAHAN

Materi Tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan secara online di: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/lengkap#bahan pelengkap

Gambar Tambahan S1|Hasil penyelarasan sekuens ITS2 dari enam spesies.

Gambar Tambahan S2|Elektroforesis gel agarosa dari semua sampel.

Tabel Tambahan S1|Sampling informasi dari Cistanches Herba dan pezina nya.

Tabel Tambahan S2|Informasi urutan spesies terkait diunduh dari GenBank.

Tabel Tambahan S3|Komposisi yang dinyatakan dari sampel obat paten Tiongkok yang berbeda.

Lembar Data Tambahan S1|Semua urutan diperoleh dalam penelitian ini.

Bentengdeserticola memiliki banyak efek

REFERENSI

Ananingsih, VK, Sharma, A., dan Zhou, W. (2013). Katekin teh hijau selama pemrosesan dan penyimpanan makanan: ulasan tentang stabilitas dan deteksi. Makanan Res. Int. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS, dan Wang, ZH (2007). Echincoside mencegah tingkat ekstraseluler striatal monoamine

neurotransmiter dari penurunan pada tikus lesi 6-hidroksidopamin. J. Etnofarmaka. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Lagu, J., Shi, L., dkk. (2010). Validasi wilayah ITS2 sebagai barcode DNA baru untuk mengidentifikasi spesies tanaman obat. PLoS SATU 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J., dkk. (2014). Analisis bahan biologis persiapan obat tradisional Tiongkok berdasarkan pengurutan throughput tinggi: kisah untuk Liuwei Dihuang Wan. Sci. Rep. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Komisi Farmakope Tiongkok. (2000). Farmakope Republik Rakyat Tiongkok. Bagian I. Beijing: Pers Ilmu Kedokteran China.

Komisi Farmakope Tiongkok. (2015). Farmakope Republik Rakyat Tiongkok. Bagian I. Beijing: Pers Ilmu Kedokteran China.

de Boer, HJ, Ichim, MC, dan Newmaster, SG (2015). DNA barcode dan farmakovigilans obat herbal. Obat Saf. 38, 611–620. DOI: 10.1007/dtk40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR, dan Haque, I. (2011). DNA mini-barcoding: sebuah pendekatan untuk identifikasi forensik dari beberapa spesies ular India yang terancam punah. Forensik. Sci. Int. gen. 5, 181-184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). OTOT: penyelarasan beberapa urutan dengan akurasi tinggi dan throughput tinggi. Asam Nukleat Res. 32, 1792-1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Buku Data Merah Tanaman China. Bagian I. Beijing: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Lagu, J., Chen, S., Ragupathy, S., dkk. (2017). Teknologi turunan dari kode batang DNA (tanda tangan nukleotida dan metode puncak ganda SNP) mendeteksi pezina dan substitusi dalam obat-obatan paten Cina. Sci. Rep. 7:5858. DOI: 10.1038/dtk41598-017-05892-y

Gu, CM, Yang, XY, dan Huang, LF (2016). Cistanches Herba: ulasan neurofarmakologi. Depan. farmasi. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB, dan Hebert, PDN (2006). Barcode minimalis dapat mengidentifikasi spesimen yang DNA-nya terdegradasi. mol. Ekol. Catatan 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.1471-8286.2006.01470.x

Konvensi Farmakope Jepang. (2016). Farmakope Jepang, Edisi ke-17. Tokyo: Kementerian Kesehatan, Tenaga Kerja dan Kesejahteraan Jepang, 1831–1832.

Jiang, Y., dan Tu, PF (2009). Analisis kandungan kimia dalam spesies Cistanche. J. Kromatografi. 1216, 1970–1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T., dan Wolf, M. (2009). 5.8S-28S rRNA interaksi dan anotasi ITS2 berbasis HMM. Gen 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L., dan Ito, Y. (2001). Isolasi preparatif dan pemurnian acteoside dan 2'-acetyl acteoside dari Cistanches salsa (CA Mey.) G. Beck dengan kromatografi arus balik berkecepatan tinggi. J. Kromatografi. A 912, 181–185. DOI: 10.1016/D0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J., dan Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): salah satu hadiah farmasi terbaik dari pengobatan tradisional Tiongkok. Depan. farmasi. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB, dan Tu, PF (2013). Kandungan kimia dari Cistanche Sinensis (Orobanchaceae). Biokimia. Sistem Ekol. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X., dan Han, J. (2016). Tanda tangan nukleotida untuk identifikasi ginseng Amerika dan produknya. Depan. Ilmu Tanaman. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M., dan Shaw, PC (2015). Identifikasi herba penyusun dalam rebusan ginseng dengan penanda DNA. Dagu. Med. 10:1. DOI: 10.1186/dtk13020-015-0029-x

Meusnier, I., Penyanyi, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD, dan Hajibabaei, M. (2008). Sebuah mini-barcode DNA universal untuk analisis keanekaragaman hayati. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Gguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S., dan Ragupathy, S. (2013). Kode batang DNA mendeteksi kontaminasi dan substitusi dalam produk herbal Amerika Utara. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G., dkk. (2017). Otentikasi produk Veronica officinalis menggunakan metabarcoding DNA dan HPLC-MS mengungkapkan pemalsuan yang meluas dengan Veronica chamaedrys. Depan. farmasi. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S., dan Sathishkumar, R. (2016). Memperkirakan otentikasi dan pemalsuan produk herbal di India menggunakan perpustakaan bahan referensi biologis berbasis DNA yang di voucher. Obat Saf. 39, 1211–1227. DOI: 10.1007/dtk40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Lagu, JY, Yao, H., dan Han, JP (2012). Identifikasi molekuler Cistanches Herba dan zat pezinanya berdasarkan urutan nrITS2. J. Med. Tanaman Res. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., dan Kumar, S. (2011). MEGA5: analisis genetika evolusi molekuler menggunakan kemungkinan maksimum, jarak evolusi, dan metode hemat maksimum. mol. Biol. Evolusi 28, 2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Lagu, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX, dkk. (2016b). Kuantifikasi simultan dari 50 senyawa bioaktif dari formula pengobatan tradisional Tiongkok rebusan Gegen-Qinlian menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan dengan spektrometri massa tandem. J. Kromatografi. 1454, 15-25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY, dan Xie, WY (2012). Deserticola Cistanche

YC Ma, "Ginseng gurun": ulasan. Saya. J.Cin. Med. 40, 1123-1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., dan Chen, S. (2016a). Tanda tangan nukleotida untuk identifikasi Angelicae Sinensis Radix (Danggui) dan produknya. Sci. Rep. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

dkk. (2015). Kuantisasi simultan dari lima saponin Notoginseng Panax dengan kromatografi cair dua dimensi multi-hati: pengembangan metode dan aplikasi untuk kontrol kualitas delapan Notoginseng yang mengandung obat paten Cina. J. Kromatografi. 1402, 71-81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C., dan Su, J. (2014). Penerapan spektroskopi inframerah-dekat untuk analisis dan penilaian kualitas cepat produk obat tradisional Cina. Akta. Farmasi. Dosa. B4, 182-192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S., dkk. (2015). Spektroskopi reflektansi inframerah-dekat (NIRS) untuk penentuan cepat ginsenoside Rg1 dan Re dalam pil Naosaitong obat paten Cina. Spektrokim. Akta. Sebuah Mol. Biomol. Spektrosk. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P., dan Jiang, Y. (2017). Penerapan metabolomik berbasis 1H NMR untuk diskriminasi berbagai bagian dan pengembangan alur kerja pemrosesan baru untuk Cistanche deserticola. Akta. Farmasi. Dosa. B7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Pernyataan Konflik Kepentingan: Para penulis menyatakan bahwa penelitian dilakukan tanpa adanya hubungan komersial atau keuangan yang dapat ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan.

Hak Cipta © 2018 Wang, Xu, Chen, Lagu, Newmaster, Han, Zhang, dan Chen. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons (CC BY). Penggunaan, distribusi, atau reproduksi di forum lain diperbolehkan, asalkan penulis asli dan pemilik hak cipta dikreditkan dan publikasi asli dalam jurnal ini dikutip, sesuai dengan praktik akademik yang diterima. Tidak ada penggunaan, distribusi, atau reproduksi diizinkan yang tidak sesuai dengan persyaratan ini.