Pengacakan Frekuensi Optogenetik Osilasi Theta Hippocampal Memisahkan Pengambilan Memori Kerja Dari Kode Spatiotemporal Hippocampal Bagian 3

Kecepatan optogenetik neuron MS mengarah pada sinkronisasi theta non-fisiologis

Anehnya, stimulasi optogenetik 8 Hz yang berhubungan dengan tempo osilasi theta menyebabkan penurunan kinerja ketika diterapkan selama pengkodean atau pengambilan memori episodik dalam tugas NPOR, serta pengambilan memori kerja spasial dalam Tugas DNMT. Untuk lebih memahami efek mondar-mandir theta pada fisiologi hippocampal, kami menganalisis fase penguncian osilasi theta sebelum dan selama stimulasi optogenetik 8 Hz (Gambar Tambahan 7a) dan menemukan bahwa stimulasi tersebut menyebabkan peningkatan sinkronisasi fase melintasi zaman stimulasi (Gambar Tambahan 7b). Selain itu, kami menganalisis korelasi silang osilasi theta pada CA1 dorsal (~ jarak 1 mm antara elektroda sepanjang sumbu septotemporal (Gambar Tambahan 7c) dan menemukan bahwa mengatur ritme theta pada 8 Hz menyebabkan peningkatan korelasi silang antara kedua elektroda tersebut ( Gambar Tambahan 7d).

Genetika adalah ilmu yang mempelajari pewarisan dan variasi genetik, dan ingatan merupakan aspek yang sangat memprihatinkan. Jadi, apa hubungannya genetika dengan ingatan? Artikel ini akan mengeksplorasi masalah terkait memori dari perspektif genetik.

Pertama-tama, kita tahu bahwa gen genetik adalah dasar bagi perkembangan fisik dan intelektual manusia, dan superioritas gen tersebut akan mempengaruhi ingatan seseorang. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa IQ dan daya ingat seseorang dipengaruhi oleh faktor genetik. Penelitian menunjukkan bahwa gen genetik memainkan peran penting dalam kecerdasan dan memori. Oleh karena itu, beberapa orang dilahirkan dengan ingatan yang lebih kuat, sementara yang lain perlu bekerja keras dan berlatih untuk meningkatkan ingatan mereka.

Kedua, faktor lingkungan juga merupakan faktor penting dalam perkembangan memori. Kita tidak hanya membutuhkan dukungan gen genetik tetapi juga perlu meningkatkan daya ingat kita melalui pelatihan ilmiah dan kebiasaan hidup yang baik. Misalnya, kita bisa memaksakan diri untuk berolahraga setiap hari, cukup tidur, mengikuti prinsip makan yang sesuai, dan lain-lain, yang dapat membantu meningkatkan fungsi otak dan daya ingat kita.

Terakhir, masyarakat awam tidak terlalu mementingkan pengaruh faktor genetik terhadap perkembangan daya ingat. Karena faktor genetik tidak bersifat mutlak, maka daya ingat dan kecerdasan seseorang masih dapat ditingkatkan dengan meningkatkan upaya dan pelatihannya. Kita hendaknya selalu menjaga sikap belajar yang positif dan berkesinambungan, serta senantiasa menggali dan mengembangkan potensi daya ingat kita. Saya yakin hanya dengan cara inilah kita bisa menjadi lebih cerdas dan mempunyai rasa pencapaian yang lebih besar. Singkatnya, hubungan antara genetika dan ingatan sangat erat, namun kita tidak boleh terlalu menekankan faktor genetik, tetapi harus terus meningkatkan ingatan dan kecerdasan kita melalui pengembangan diri dan pelatihan.

Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat daging cincang berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak dengan berbagai cara.

Klik tahu 10 cara meningkatkan daya ingat

Diskusi

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neuron saat melakukan stimulasi optogenetik neuron MS dengan resolusi sub-detik untuk mengontrol ritme theta dan menilai perannya dalam fisiologi dan memori hipokampus. Yang penting, dengan menggunakan opsin rangsang dan stimulasi teracak atau 8 Hz, kami mampu secara konsisten dan kuat menghapuskan atau mempercepat theta hipokampus.

Dibandingkan dengan penghambatan MS menggunakan opsin penghambat atau senyawa farmakologis (misalnya muscimol), pendekatan kami memungkinkan perbandingan dalam subjek dari dua keadaan yang berlawanan (paced vs abolishedtheta) sambil mempertahankan tingkat aktivitas dalam sel MS-PV. Kami menggabungkan tugas jalur linier dengan isyarat yang, bersama dengan pendekatan teori informasi, memungkinkan kami menguraikan kode hipokampus spasial dan temporal. Metode ini mengurangi kebutuhan akan ambang batas yang sewenang-wenang, memungkinkan pendekatan standar terhadap analisis pencitraan kalsium. Sementara sebagian besar neuron piramidal CA1 mengekspresikan campuran kode spatiotemporal, kami memfokuskan analisis kami pada neuron yang disesuaikan secara spesifik dengan tempat, waktu, atau jarak yang ditempuh.

Meskipun pengkodean spasial telah diselidiki secara luas di CA1, kode temporal dan jarak baru-baru ini mendapatkan lebih banyak perhatian. Kode temporal28,35–37 dan jarak37 telah diekstraksi dengan menjepit isyarat visuospasial atau diekstraksi secara analitis menggunakan model linier umum dalam paradigma realitas virtual26,27,38. Di sini, kami mengusulkan pendekatan untuk menguraikan kode spasial, temporal, dan jarak menggunakan pendekatan teori informasi yang, bersama dengan tugas pergantian isyarat kami, memungkinkan analisis kode spatiotemporal dan multipleks dunia nyata pada hewan yang bergerak bebas. Sejumlah besar neuron piramidal CA1 mengkodekan informasi multipleks tentang lokasi, jarak, dan waktu seperti yang dilaporkan sebelumnya26,27,38 selain sinyal gerak diri seperti akselerasi, kecepatan, dan orientasi60.

Kami menemukan bahwa pengacakan frekuensi dan stimulasi optogenetik 8 Hz masing-masing secara drastis menghapus atau mempercepat ritme theta, dan menyebabkan penurunan aktivitas keseluruhan dalam subpopulasi sel piramidal CA1 sementara tidak menyebabkan perubahan signifikan pada aktivitas sel tempat, serupa dengan laporan sebelumnya yang menggunakan penghambatan farmakologis36, 46,47 atau optogenetic9,48 mondar-mandir dari MS atau input septum ke hipokampus. Karena neuron MS diketahui sebagai pendorong utama osilasi hipokampus, kami berharap bahwa stimulasi MS akan dikaitkan dengan gangguan aktivitas sel waktu atau jarak dalam kondisi ritme theta berkurang, namun tidak ada perubahan yang terjadi ketika theta dihapuskan atau diatur. Selain itu, kecepatan osilasi hipokampus hingga 8 Hz tidak menyebabkan perubahan kualitas kode spasial seperti yang dilaporkan sebelumnya9 dan tidak mengubah kode temporal seperti yang diamati dalam paradigma perilaku kita.

Meskipun dilaporkan bahwa sel waktu (tetapi bukan tempat) dapat bergantung langsung pada masukan medial entorhinal cortex (MEC)61, bukti eksperimental terbaru menunjukkan bahwa lesi MEC tidak menyebabkan perubahan apa pun dalam fisiologi sel waktu hipokampus62. Khususnya, penyelidikan yang lebih baru menemukan bahwa kecepatan optogenetik MS tidak mengganggu kode spasial sel grid di entorhinalcortex63, lebih lanjut menunjukkan bahwa aktivitas MS tidak terlibat langsung dalam kode spasial dalam formasi hipokampus. Bersama dengan hasil kami, hal ini menunjukkan bahwa kode temporal bisa jadi merupakan hasil komputasi yang bergantung pada MS di dalam korteks entorhinal63 (1) atau dihasilkan secara intrinsik di dalam hipokampus itu sendiri (2).

Meskipun penelitian awal menemukan bahwa MS memainkan peran penting dalam menjaga sel waktu dan mendukung memori kerja36, bukti eksperimental baru-baru ini menunjukkan bahwa kontribusi sel waktu terhadap kinerja memori kerja mungkin lebih kecil dari perkiraan sebelumnya62. Karena neuron MS-PV kemungkinan mempertahankan tingkat aktivitas yang signifikan selama pengacakan frekuensi stimulasi optogenetik (berbeda dengan pendekatan penghambatan), hasil kami sangat mendukung peran aktivitas septum yang waktunya tepat dalam mendukung memori kerja, seperti yang dihipotesiskan sebelumnya. Meskipun kami mengamati penurunan kinerja memori saat menggunakan stimulasi optogenetik selama pengambilan, stimulasi selama fase pengkodean tugas DNMTS tidak terkait dengan penurunan memori dalam tugas DNMTS. Kecepatan osilasi pada 8 Hz selama fase pengkodean atau pengambilan tugas NOPR menyebabkan gangguan pengambilan memori. Analisis elektrofisiologi kami lebih lanjut mengungkapkan bahwa stimulasi tersebut menyebabkan daerah punggung CA1 yang jauh berada pada fase yang sama, dengan penguncian fase non-fisiologis. Meskipun kami tidak secara langsung menyelidiki hubungan sebab akibat antara perubahan fase dan kinerja memori, waktu lonjakan, dan presesi fase juga ditemukan terkait dengan perubahan fungsi memori kerja meskipun meninggalkan tempat pengkodean yang utuh64. Selain itu, penguncian fase neuron piramidal terhadap osilasi sebelumnya telah terbukti menjadi prediktor kinerja memori65.

Khususnya, salah satu keterbatasan pendekatan kami dalam menetapkan properti penyetelan waktu dan jarak adalah bahwa hal ini memerlukan pengambilan sampel empat kali lebih banyak daripada jalur linier biasa yang meningkatkan kemungkinan photobleaching ketika menambahkan kondisi stimulasi ke garis waktu eksperimental. Meskipun kami menemukan bahwa kode spasial tetap tidak terpengaruh oleh stimulasi optogenetik dalam sesi yang sama, perangkat keras pencitraan yang lebih baru yang mencakup sensor dengan sensitivitas yang ditingkatkan dapat membantu mencegah photobleaching dan memungkinkan sesi perekaman yang lebih lama, sehingga mengambil sampel sel temporal dan jarak bersama dengan stimulasi. Kami juga menemukan bahwa kumpulan neuron yang secara signifikan dan spesifik mengkode hanya satu variabel sangatlah kecil dibandingkan dengan jumlah neuron penghubung, sehingga persyaratan pengambilan sampel untuk neuron yang sangat spesifik ini jauh lebih tinggi.

Kami memberikan bukti eksperimental bahwa manipulasi MS tidak mengubah kecepatan lokomotor dan sebaliknya, kecepatan lokomotor tidak menentukan frekuensi theta. Meskipun kode tempat dan waktu dipertahankan selama stimulasi MS kami, sebagian (~6%) sel dimodulasi secara langsung dan dapat menjelaskan gangguan memori yang diamati dalam pengujian perilaku kami. Interneuron PV di hipokampus sebelumnya telah dilaporkan menjadi bagian dari sirkuit mikro yang penting dalam mengatur konsolidasi memori66,67, dan manipulasi optogenetik kami dapat dikaitkan dengan pembungkaman sebagian sel-sel ini. Selain itu, meskipun kami tidak mengamati perubahan pita frekuensi selain theta, kami tidak dapat mengecualikan bahwa waktu lonjakan neuron piramidal CA1 dapat diubah secara drastis ketika mengacak osilasi theta, sementara stimulasi 8 Hz terbukti tidak menghasilkan peningkatan aktivitas hipokampus18, yang dapat menjelaskan perbedaan efek dari pola stimulasi tersebut pada kinerja memori kerja. Gangguan memori yang kami amati kemungkinan besar bersifat non-kolinergik: pertama, dalam eksperimen imunohistologis kami, kami hampir tidak menemukan ekspresi ChrimsonR pada neuron ChAT di MS. Kedua, stimulasi optogenetik kami tidak dikaitkan dengan perubahan riak hipokampus, sementara laporan sebelumnya menunjukkan bahwa stimulasi Neuron ChAT dikaitkan dengan berkurangnya frekuensi riak45,57. Transfeksi ChrimsonR pada neuron MS VGLUT2 juga tidak mungkin terjadi karena aktivasi neuron ini dikaitkan dengan peningkatan langsung aktivitas alat gerak 68, yang tidak kami amati.

Meskipun susunan temporal yang tepat dari lonjakan piramidal CA1 dapat menjelaskan, setidaknya sebagian, efek stimulasi MS pada memori, mekanisme alternatif harus dipertimbangkan. Khususnya, selain hipokampus dan korteks entorhinal, neuron MS PV memproyeksikan ke korteks retrosplenial3 dan mungkin bertanggung jawab atas beberapa gangguan memori yang diamati di sini.

Singkatnya, dengan menggunakan pencitraan kalsium, optogenetika, dan elektrofisiologi, kami menemukan bahwa ritme theta dapat diatur atau dihilangkan dengan menggunakan stimulasi MS. Stimulasi seperti itu mengganggu pengambilan memori episodik dan kerja. Efek ini bersifat non-kolinergik dan tidak mengganggu aktivitas riak hipokampus. Akhirnya, meskipun sebagian kecil neuron hipokampus merespons langsung terhadap stimulasi optogenetika MS, sel tempat, waktu, dan jarak tidak terganggu oleh manipulasi osilasi theta. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa meskipun masukan MS ke hipokampus memainkan peran penting dalam memori, kode multipleks pada neuron piramidal CA1 mungkin tidak menjadi substrat langsung untuk fungsi tersebut.

Metode

Hewan

Semua prosedur telah disetujui oleh Komite Perawatan Hewan Universitas McGill dan Dewan Perawatan Hewan Kanada (protokol 2015-7650). Sebanyak n=41 jantan (n=20) dan betina (n=21) berumur 8–16 minggu, tikus B6;129P2 PV-Cre (Laboratorium Jackson, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) digunakan dalam penelitian ini. n=5 tikus digunakan untuk menggabungkan optogenetika dengan pencitraan kalsium; n=3 tikus ditanamkan untuk pencitraan kalsium, optogenetika, dan kontrol elektrofisiologi; n=4 tikus digunakan dalam studi elektrofisiologi; n=29 tikus ditransfusikan dan ditanamkan untuk pengujian perilaku. Tikus ditempatkan secara individual dalam siklus terang/gelap selama satu jam pada suhu 22 derajat dan kelembapan 40% dengan makanan dan air dan libitum. Semua percobaan dilakukan selama bagian terang dari siklus terang/gelap.

Vektor virus terkait adeno

Virus terkait adeno AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, diperoleh dari University of Pennsylvania Vector Core) digunakan dalam semua percobaan pencitraan kalsium. Virus terkait adeno (AAV) dari serotipe dj (kapsid hibrida yang dibuat dari delapan serotipe AAV berbeda) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomat diperoleh dari Fasilitas Inti Vektor di Universitas Kesehatan dan Sains Oregon di Portland, Oregon. Meskipun ia adalah gen rumah tangga, kami tidak mengamati transfeksi dalam sel kolinergik (lihat "Hasil" dan Gambar 2b – e). Konstruk eYFP tanpa urutan ChrimsonR digunakan sebagai kontrol (disebut kontrol YFP dalam naskah ini).

Prosedur operasi

Tikus dibius dengan isofluran (induksi 5%, pemeliharaan 0,5–1%) dan ditempatkan dalam bingkai stereotaxic (David Kopf Instruments). Suhu tubuh dipertahankan dengan bantalan pemanas, mata dihidrasi dengan gel (Optixcare) , dan Carprofen (10 ml/kg) diberikan secara subkutan. Tengkorak dibersihkan seluruhnya dari semua jaringan ikat dan kraniotomi kecil dilakukan menggunakan bor gigi untuk injeksi atau implan selanjutnya.

Suntikan virus. Semua suntikan virus dilakukan menggunakan pipet kaca yang dihubungkan ke injektor Nanoject III (Drummond). 500 nl dari AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (atau kontrol eYFP) dikirim ke MS dengan kecepatan 1 nL/s, pada koordinat berikut berdasarkan atlas stereotaxic mouse referensi69 (jarak dari Bregma di mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) −4,50 menggunakan sudut 5 derajat pada bidang ML. Setelah operasi, hewan dipantau sampai pemulihan.

Implan serat optik. Dua minggu setelah injeksi, tikus dibius untuk implantasi setelah prosedur pembedahan yang sama. Serat optik berdiameter 200 μm dengan ferrule keramik (Thorlabs) ditanamkan pada koordinat yang sama. Implan disemen di tempatnya menggunakan C&B-Metabond® (Patterson dental). Cat kuku hitam diaplikasikan di atas semen gigi untuk menghalangi emisi cahaya selama stimulasi optogenetika.

Implan elektroda. Serangkaian 7 mikroelektroda tungsten (~1 MΩimpedansi) diturunkan di CA1 punggung yang mencakup stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad), dan stratum lacunosummoleculare (lm). Sekrup yang ditempatkan pada tulang di atas korteks frontal dan otak kecil masing-masing berfungsi sebagai landasan dan referensi. Setelah penempatan elektroda, ground, dan referensi, semen gigi diaplikasikan untuk mengamankan implan secara permanen ke tengkorak.

Implan untuk pencitraan kalsium. Kami menyuntikkan virus AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL pada 1 nl s−1) di CA1 hippocampal menggunakan koordinat berikut: anteroposterior (AP) − 1.86 mm dari bregma, mediolateral(ML) 1,5 mm, dorsoventral (DV) 1,5mm. Dua minggu setelah penyuntikan, tikus dibius dengan isofluran dan tengkoraknya dibersihkan. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Pencitraan kalsium simultan dan rekaman elektrofisiologi. Untuk mengontrol efek implan GRIN pada theta hippocampal serta cross-talk antara mini-scope dan lampu eksitasi optogenetik, kami memasang mikro-elektroda tungsten ke lensa GRIN. Untuk tujuan ini, kami menempatkan lensa GRIN secara horizontal di bawah mikroskop pembesaran rendah di lingkungan bebas debu. Mikroelektrodewa tungsten ditempatkan dengan lembut di tepi atas lensa GRIN menggunakan mikromanipulator. Kami menggunakan diameter lensa GRIN yang diketahui sebagai unit referensi untuk memperkirakan tonjolan elektroda yang diinginkan (~50 µm, selanjutnya dinilai secara digital setelah mengambil foto mikro persiapan) dengan koordinat implantasi yang kami rencanakan. Lem super dalam jumlah kecil (~50 µL) diendapkan pada tepi atas lensa GRIN dengan elektroda terpasang dan dibiarkan kering selama~10 menit, sebelum mengaplikasikan lapisan lem berikutnya. Lima lapisan tipis digunakan untuk menjaga elektroda tetap menempel pada lensa GRIN. Setelah implantasi rakitan elektroda GRIN ini menggunakan protokol yang dijelaskan di atas, kabel yang menonjol ditekuk secara perlahan dan disembunyikan di bawah tutup pelindung (tinggi 1–1,5 cm) yang diambil dari pir pipet hisap amanual sebagai pengganti Kwik-Sil.

Prosedur perilaku in vivo

Pembiasaan. Tikus ditangani dengan lembut selama ~ 5 menit selama satu minggu, dengan pembiasaan progresif terhadap prosedur penyumbatan (serat optik, miniskop, dan penambat pra-amplifikasi elektrofisiologi). Hewan-hewan kemudian diberi jadwal minum (akses 2 jam per hari).

Rekaman miniskop. Miniscopes (V3) dirakit menggunakan instruksi sumber terbuka (miniscope.org). Data pencitraan diperoleh menggunakan sensor pencitraan CMOS (Aptina, MT9V032) dan dimultipleks melalui kabel koaksial ringan. Data diperoleh menggunakan kotak akuisisi data (DAQ) yang terhubung melalui pengontrol host USB (Cypress, CYUSB3013). Perilaku hewan dicatat menggunakan webcam tingkat konsumen (Logitech) yang dipasang di atas lingkungan. Data kalsium dan perilaku dicatat menggunakan miniscope.org, sumber perangkat lunak akuisisi kustom DAQ. DAQ secara bersamaan memperoleh aliran pencitraan perilaku dan seluler pada 30 Hz sebagai file 1000 bingkai yang tidak terkompresi untuk sesi perekaman 15-menit, bersama dengan stempel waktu yang sesuai untuk memungkinkan penyelarasan temporal data pencitraan perilaku dan kalsium secara tepat.

Rekaman elektrofisiologi in vivo. Setelah 1 minggu pemulihan pasca operasi dan satu minggu pembiasaan terhadap pengaturan tethering, LFP dari tikus yang ditanamkan dicatat. Semua sinyal yang terekam dari elektroda yang ditanamkan diperkuat oleh pre-amplifier tambatan sebelum didigitalkan pada 22 kHz menggunakan sistem perekaman digital (Neuralynx, AS). Rekaman setiap sinyal saluran disimpan bersama dengan rekaman video dan sinyal TTL dari Dioda Laser untuk analisis selanjutnya.

Stimulasi optogenetik. Stimulasi laser disampaikan melalui kabel serat optik (diameter 200 μm) menggunakan sumber cahaya serat dioda laser (Lensa Doric). Intensitas cahaya dikalibrasi dan panjang gelombang dikoreksi menggunakan Power Meter Bundle dengan Konsol PM100D dan S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Setiap stimulasi tempo (termasuk 8 Hz) dilakukan dengan menggunakan pulsa persegi 5 ms. Untuk menerapkan stimulasi cahaya acak, kami menggunakan mikrokontroler Arduino untuk menghasilkan sinyal osilasi white noise yang langsung dimasukkan ke input analog driver dioda laser. Untuk melakukan stimulasi frekuensi yang dipilih secara acak, kami menggunakan protokol standar 5 s ON, 5 s OFF, tetapi untuk setiap periode stimulasi, kami menggunakan mikrokontroler Arduino untuk memilih frekuensi stimulasi secara acak pada pita theta. Saat menerapkan stimulasi optogenetik selama berperilaku, sepotong pipa heat shrink yang longgar dipasang di sekitar persimpangan antara kabel patch dan implan ferrule tikus untuk membatasi emisi cahaya tampak. Intensitas cahaya dinyatakan sebagai daya nominal, yang diukur pada ujung rakitan kabel implan serat optik (sebelum penempatan bedah), dan dikoreksi untuk panjang gelombang yang sesuai.

Tes perilaku

Jalur linier nada berurutan. Tikus diberi jadwal minum dan hanya dapat mengakses air selama 2 jam per hari mulai pukul 18.00 hingga 20.00. Untuk menguraikan kode spasial, temporal, dan jarak, kami membangun jalur linier sepanjang 134 cm menggunakan batu bata Lego® abu-abu sedang, yang memungkinkan modifikasi dan implementasi yang mudah tanpa kesulitan. perlu memodifikasi struktur labirin secara permanen. Sensor piroelektrik ditempatkan di setiap ujung jalur linier dan dihubungkan ke mikrokontroler Arduino. Setiap deteksi memicu nada baru secara berurutan, yang menunjukkan kemajuan dalam pemberian hadiah. Nada berikut digunakan dan disampaikan menggunakan speaker apiezo: bunyi bip 1 detik pada 2000 Hz, bunyi bip 250 ms pada 3000 Hz, dan nada kontinu pada 4000 Hz. Ketika nada terakhir yang terus menerus dipicu, hadiah (sukrosa 10% dalam air) diberikan pada ujung awal jalur linier dalam tutup tabung Falcon 15 mL. Perubahan arah lari sebelum memicu nada berikutnya dianggap kesalahan dan tidak memicu pengiriman hadiah. Kinerja diukur sebagai jumlah percobaan yang benar (tanpa kesalahan) dibagi dengan jumlah percobaan total.

Pengenalan tempat objek baru. Pada hari pertama, tikus dibiarkan bebas menjelajahi lapangan terbuka abu-abu gelap berukuran 45 × 45 cm yang berisi isyarat visual (kisi horizontal dan vertikal putih besar) di dindingnya selama 10 menit. Pada hari kedua, dua benda identik (alas uluran tangan) dipresentasikan selama 10 menit. Pada hari ketiga, tikus dibiarkan menjelajahi lapangan terbuka yang sama sambil berpindah lokasi salah satu dari dua objek tersebut. Untuk mengendalikan potensi bias preferensi spasial, baik posisi awal maupun posisi objek yang dipindahkan, diacak. Tikus telah memberikan perintah pengujian acak yang tetap sama selama tiga hari pengujian. Perilaku direkam dengan kamera video (Logitech) dan dianalisis secara offline. Analisis perilaku dilakukan tanpa mengetahui genotipe dan pengobatan. Eksplorasi objek didefinisikan sebagai zaman di mana tikus menempatkan hidungnya dalam jarak 1 cm dari suatu objek. RI dihitung sebagai berikut:

Penundaan otomatis yang tidak cocok dengan tugas sampel. Tikus diberi jadwal air dan dilatih dalam labirin T berkelanjutan untuk tugas sampel non-cocok yang tertunda. Secara singkat, setiap uji coba dibagi menjadi dua tahap: sampel dan tes. Pada fase sampel, satu lengan diblokir dan tikus dipaksa untuk mengeksplorasi lengan yang berlawanan, di mana mereka menerima 50 μL air sukrosa 10%. Setelah menyelesaikan fase sampel, tikus mengalami penundaan (10 detik) di kompartemen awal. Kemudian, selama fase pengujian, kedua lengan dapat dieksplorasi, namun hanya lengan yang berlawanan (yang belum dijelajahi) yang diberi umpan sehingga tikus harus berpindah lokasi antara fase sampel dan fase pengujian. Tikus dikenakan 10 percobaan (sampel + tes) per hari, selama 10 hari berturut-turut, dan tingkat keberhasilan harian dihitung sebagai jumlah percobaan yang benar dibagi dengan jumlah percobaan.

Analisis histologis post-mortem

Setelah menyelesaikan pengujian perilaku, tikus dibius secara mendalam dengan campuran ketamin/xylazine/acepromazine (masing-masing 100, 16, 3 mg/kg, injeksi intraperitoneal) dan diperfusi secara transkardial dengan paraformaldehyde (PFA) 4% dalam PBS. Otak diekstraksi dan difiksasi semalaman dalam PFA pada suhu 4 derajat dan kemudian dicuci dalam PBS selama 24 jam tambahan pada suhu 4 derajat. Otak dan bagian-bagiannya dilindungi krioproteksi dalam larutan 30% etilen glikol, 30% gliserol, dan 40% PBS sampai digunakan. Setiap otak kemudian dibelah pada ukuran 50 µm menggunakan vibratome: setiap bagian dikumpulkan secara berurutan dalam 4 tabung 1,5 mL yang berbeda untuk memungkinkan analisis yang berbeda. (lokasi elektroda, imunohistokimia).

Imunohistologi. Dengan menggunakan satu tabung bagian otak yang dikumpulkan (25% sampel) untuk setiap analisis, bagian dicuci selama 3 × 5 menit dalam PBS untuk menghilangkan larutan krioprotektif. Bagian diinkubasi semalaman dengan PGT (0.45% Gelatin dan 0.25% Triton dalam PBS) pada suhu 4 derajat. Selanjutnya, irisan diinkubasi dengan antibodi primer: 1:200 kambinganti-kolin-asetil -transferase dari Millipore atau IgG1 anti-PVmonoklonal tikus 1:500 dari Sigma-Aldrich dalam PGT pada suhu kamar masing-masing selama 48 jam atau 2 jam. Setelah pencucian selama 10, 20, dan 30 menit, bagian-bagian tersebut kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder [1:2000 keledaianti-kambing ditambah dengan Alexa 488 atau 1:500 kambing anti-tikus IgG1 digabungkan dengan Alexa 488 (Life Technologies)] dalam PGT untuk 45 menit. Setelah pencucian selama 10,20, dan 30 menit dalam PBS, bagian-bagian tersebut kemudian dipasang pada slide kaca dan ditutup secara permanen dengan media pemasangan Fluoromount yang berisi DAPI. Hanya tikus dengan penempatan implan yang dikonfirmasi secara histologis yang dilibatkan dalam penelitian ini. Untuk GRINlenses, permukaan lensanya harus seperti itu<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Analisis data

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 pada lintasan linier).

Pelacakan perilaku secara otomatis. Untuk mengekstrak informasi tentang posisi, kecepatan, dan arah kepala tikus, kami menggunakan DeepLabCut70,71. Secara singkat, kami melatih model untuk mendeteksi telinga, hidung, tubuh, dan pangkal ekor tikus. Arah kepala diperkirakan menggunakan sudut antara masing-masing telinga atau hidung dan tubuh, tergantung pada ketersediaan pengukuran. Data lokasi diinterpolasi ke frekuensi pengambilan sampel pencitraan kalsium menggunakan interpolasi linier. Kecepatan diekstraksi dengan menghitung Δd/Δt di mana d adalah jarak dan t waktu dan kemudian menghaluskan hasilnya dengan menerapkan filter Gaussian dengan sigma=33 ms untuk menghilangkan artefak deteksi. Sinyal kecepatan digunakan untuk mengidentifikasi periode aktivitas alat gerak dan menghitung modulasi aktivitas tempat, waktu, dan jarak khusus untuk periode tersebut.

Analisis pencitraan kalsium. Analisis data pencitraan kalsium dilakukan menggunakan MATLAB 2020a dan Python 3.8.4. Rekaman video dianalisis menggunakan pipa Analisis Miniscope (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Secara singkat, koreksi gerakan kaku (rotasi dan terjemahan) diterapkan menggunakan NoRMCorre72, dan video diturunkan sampelnya secara spasial (3×) sebelum digabungkan. Jejak kalsium diekstraksi menggunakan CNMFe51 menggunakan parameter berikut: gSig=3 piksel (lebar kernel Gaussian), gSiz=20 piksel (perkiraan diameter neuron), latar belakang_model='ring', spasial_algoritma='hals', min_corr=0.8 (ambang batas korelasi piksel minimum), min_PNR {{17 }} (ambang batas minimum rasio puncak terhadap kebisingan).

Jejak kalsium mentah disaring untuk menghilangkan fluktuasi frekuensi tinggi dan dibinarisasi: Secara singkat, neuron dianggap aktif ketika amplitudo sinyal kalsium yang dinormalisasi melebihi dua standar deviasi, dan turunan orde pertama berada di atas 0 (lihat ref. 52 untuk rincian tambahan pada metodologi52). Untuk mengekstrak neuron yang disetel ke variabel tertentu, lokasi, waktu, dan jarak dimasukkan ke dalam bin (lokasi: wadah 3 cm; waktu: wadah 1 detik; jarak: wadah 3 cm). Dari sinyal biner, kami menghitung kemungkinan marginal sel menjadi aktif P Að Þ yang kami gunakan sebagai proksi untuk aktivitas saraf. Lebih penting lagi, kita kemudian menurunkan kemungkinan aktivitas atau 'probabilitas aktif mengingat keadaan variabel' PA j Si menggunakan variabel binned:

dimana M adalah jumlah total kemungkinan keadaan perilaku, dan P(Si∩Aj) adalah probabilitas gabungan hewan tersebut berada di bin I bersamaan dengan tingkat aktivitas j (0 atau 1). Untuk menilai signifikansi nilai MI yang diperoleh, kami kemudian menghasilkan 1000 pengganti yang dikocok menggunakan permutasi melingkar acak. Kami memilih permutasi sirkular karena menghilangkan hubungan temporal antara aktivitas dan perilaku saraf, sambil tetap menjaga struktur temporal transien kalsium dan dengan demikian memberikan hasil yang lebih konservatif (dibandingkan dengan pengacakan lengkap setiap titik data, yang meningkatkan nilai signifikansi hasil). Karena pengganti yang diacak tidak terdistribusi normal secara sistematis, kami menggunakan pendekatan non-parametrik di mana nilai p (pN) sesuai dengan jumlah titik data dari distribusi yang diacak yang lebih besar dari data aktual untuk setiap nampan, dibagi dengan jumlah permutasi52, 73.

Untuk menentukan modulasi sel dengan stimulasi optogenetik, kami menggunakan pendekatan serupa tetapi menghitung MI antara aktivitas neuron dan sinyal stimulasi biner (sehingga diperlakukan sebagai keadaan perilaku). Prosedur pengocokan melingkar yang sama kemudian digunakan untuk mengekstraksi signifikansi statistik.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1, kumpulan data pelatihan dihasilkan menggunakan 90% data. Sisanya 10% dari data digunakan untuk pengujian. Kesalahan decoding dihitung menggunakan 50 pengganti bootstrap dan kumpulan 160 sel menggunakan titik data yang dipilih secara acak dengan penggantian. Setiap neuron diasumsikan independen satu sama lain, yang pada praktiknya tidak demikian dan menyebabkan kesalahan rekonstruksi yang lebih besar, namun mengurangi waktu komputasi. Probabilitas posterior populasi diperoleh dari persamaan berikut:

Melacak sel selama beberapa hari. Neuron dilacak selama beberapa hari menggunakan CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Singkatnya, jejak spasial diselaraskan menggunakan penyelarasan kaku untuk mengoreksi rotasi dan terjemahan. Setelah penyelarasan, kami menganggap kumpulan sel kandidat sebagai neuron yang sama jika jarak maksimalnya<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Analisis elektrofisiologi. Analisis data elektrofisiologi dilakukan menggunakan MATLAB 2020a menggunakan pemrosesan sinyal dan toolbox wavelet. Konvolusi wavelet diterapkan pada sinyal LFP menggunakan wavelet Morlet yang kompleks ('cmor1–1,5' di MATLAB) ketika akurasi domain waktu dan frekuensi diperlukan. Konvolusi Fourier jendela bergerak (jendela 2 detik pada pita theta, jendela 5 detik pada pita gamma, langkah bergerak 10 ms) digunakan ketika akurasi domain frekuensi lebih diutamakan daripada akurasi domain waktu (misalnya, frekuensi dominan toplot saat mondar-mandir menggunakan optogenetika). Analisis kepadatan spektral daya dilakukan ketika tikus berlari pada kecepatan 5 cm s−1 atau lebih kecuali dijelaskan sebaliknya.

Kekuatan osilasi. OS dihitung sebagai rasio kerapatan spektral daya kumulatif di sekitar frekuensi osilasi puncak ±1 Hz dengan daya pita kumulatif pada pita theta (4–12 Hz). Metrik ini menjadi 1 ketika semua kerapatan spektral daya berada dalam frekuensi osilasi puncak (misalnya 8 Hz jika distimulasi pada frekuensi tersebut).

Deteksi dan analisis SWR. Untuk memantau SWR, tikus diizinkan menjelajahi lapangan terbuka secara bebas selama 10 menit saat merekam. Stimulasi (diacak atau 8 Hz) dilakukan dengan paradigma 5 detik ON, 5 detik OFF. Hanya periode ketenangan yang dipertimbangkan untuk analisis. Untuk tujuan ini, kami menghitung rasio skor z daya theta/delta setelah memfilter setiap pita frekuensi, melakukan transformasi Hilbert, dan hanya mempertimbangkan periode di mana nilai yang dihasilkan di bawah 0. Untuk mendeteksi SWR, kami memfilter sinyal LFP pada rentang 150–250. Pita frekuensi Hz dan selanjutnya diberi skor z. Riak dideteksi menggunakan fungsi findpeaks di MATLAB, dengan parameter berikut: ambang batas=4 sd,minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s.

Referensi

1. Colgin, LL Irama jaringan hipokampus. Nat. Pendeta Neurosci. 17, 239–249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Disinhibisi sel hipokampuspiramidal tikus oleh aferen GABAergik dari septum. J.Fisiol.500, 463–474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Target sinaptik dari proyeksi septum medial di hipokampus dan korteks ekstrahipokampus tikus. J. Ilmu Saraf. 35.15812–15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Sifat penembakan neuron yang diidentifikasi secara anatomis di septum medial tikus yang dibius dan tidak dibius. J. Ilmu Saraf. 26, 9038–9046 (2006).

5. Scotty, F. dkk. Sifat elektrofisiologi yang berbeda dari neuron septohippocampal tikus glutamatergik, kolinergik, dan GABAergik: implikasi baru terhadap ritme hipokampus. J.Fisiol. 551.927–943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Jaringan glutamatergikneuron fungsional di septum medial dan area pita diagonal. J.Fisiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. dkk. Interneuron parvalbumin dari aktivitas populasi lagu hipokampus pada frekuensi theta. Neuron 86, 1277–1289(2015).

8. Etter, G. dkk. Stimulasi gamma optogenetik menyelamatkan gangguan memori pada model tikus penyakit Alzheimer. Nat. Komunitas. 10, 1–11 (2019).

9. Zutshi, I. dkk. Sirkuit saraf hipokampus merespons kecepatan optogenetik frekuensi theta dengan menghasilkan frekuensi osilasi yang dipercepat. Saat ini. biologi. 28, 1179–1188.e3 (2018).

10. Bender, F. dkk. Osilasi theta mengatur kecepatan penggerak melalui jalur septum hipokampus-ke-lateral. Nat. Komunitas. 6.8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com