Profil Metabolomik Berbasis NMR Untuk Pemulungan Radikal Dan Sifat Anti-Penuaan Bagian 2

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

2.5. Klasifikasi Ekstrak Herbal berdasarkan Analisis Komponen Utama

Variasi metabolit antara daun herba yang diuji dianalisis lebih lanjut menggunakan analisis data multivariat (MVDA). Analisis komponen utama (PCA), metode pengenalan pola, adalah MVDA tanpa pengawasan yang memberikan pemahaman utama tentang hubungan antara sampel. Plot skor PCA menunjukkan pemisahan herbal ke dalam kelompok, sedangkan plot pemuatan menyoroti metabolit yang memberikan pemisahan [85,86]. Model PCA menunjukkan kebugaran yang baik (R2X=0.997) dan prediktabilitas tinggi (Q2=0.993) di mana variasi antara R2X(cum) dan Q2(cum) kurang dari 0 .3, sehingga menunjukkan bahwa masing-masing ekstrak herbal secara merata dan merata berkontribusi pada pemisahan kelompok yang diamati. Pengamatan ini sejalan dengan Wheelock et al. [87].

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Plot skor analisis komponen utama menunjukkan bahwa herbal yang dipilih dipisahkan menjadi dua kelompok tanpa outlier yang luar biasa seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A. Komponen utama (PC)1 menunjukkan variasi sampel terbesar, kemudian diikuti oleh PC2. PC1 dan PC2 memberikan kontribusi persentase varians masing-masing sebesar 29,7 persen dan 24,9 persen. Oleh karena itu, varian total sekitar 54,6 persen dijelaskan oleh PC ini. Hasil dari plot kolom pemuatan mengungkapkan metabolit yang bertanggung jawab untuk pemisahan herbal menjadi sisi positif PC1 (V.negundo dan C.longa) dan sisi negatif PC1 (P. minus, P. indica, O.javanica dan C. caudatus) (Gambar 4B).

Data dari plot kolom pemuatan PC1 menemukan bahwa senyawa fenolik, terutama kelompok flavonoid dan asam fenolik, bertanggung jawab untuk pemisahan herbal yang dipilih. Kuersetin (1), kuersetin-3-O-rhamnosida (2), kuersetin-3-O-glukosida (3), kuersetin-3-O-glukuronida (4), kuersetin-3- O-arabinofuranoside (5), rutin (6), turunan mvricetin (7), catechin (8), epicatechin (9), isorhamnetin (10), astragalin (11), asam klorogenat (12), asam galat (13), kandungan asam kumarat (14), asam askorbat (15), asam format (21), asam fumarat (22), 3-metilxantin (26) dan apigenin (28) sebagian besar lebih tinggi pada P. minus, P. indica , C. caudatus dan O.javanica karena terletak di sisi negatif plot. Sebaliknya, V.negundo dan C.longa dibedakan dari herbal lain dengan adanya serotonin (27) dan D-limonene (29) dalam ekstraknya.

2.6. Korelasi antara Bioaktivitas dan Metabolit Menggunakan Partial Least-Squares Analysis (PLS)

Untuk memahami hubungan antara bioaktivitas terukur dan metabolit yang ditemukan dalam herbal yang diuji, PLS, sebagai metodologi MVDA yang diawasi, diimplementasikan untuk mengkorelasikan data variabel independen (pergeseran kimia NMR dari metabolit) dengan data variabel dependen, yang adalah penghambatan uji DPPH, ABTS dan ORAC, serta aktivitas anti-elastase dan anti-kolagenase. Metodologi ini diterapkan karena PLS memiliki pencapaian yang besar dalam menghubungkan bioaktivitas yang diuji dengan metabolit, sehingga dapat memberikan model untuk prediksi [88]. Melalui analisis PLS, hubungan antara bioaktivitas seperti aktivitas penangkapan radikal dan sifat anti-penuaan dengan metabolit dalam sampel dapat ditetapkan. Oleh karena itu, metabolit yang bertanggung jawab sebagai penanda bioaktif kemudian dapat disarankan.

Biplot adalah campuran skor dan plot pemuatan yang dihasilkan dari analisis PLS, seperti yang dilaporkan oleh Mediani et al. [80]. Biplot kuadrat terkecil parsial untuk aktivitas pembersihan radikal (Gambar 5A) dan sifat anti-penuaan (Gambar 5B) menunjukkan bahwa semua sampel dipisahkan dengan baik dan dikelompokkan tanpa outlier yang mencolok. PC1 memisahkan daun P. minus, C.caudatus, dan P. indica dari V. negundo, O.jaoanica, dan C.longa. Berdasarkan aktivitas pembilasan radikal dan sifat anti-penuaan biplot, model menunjukkan nilai fitness (R'Y) yang baik masing-masing sebesar {{10}}.988 dan 0.966. Sementara itu, prediktabilitas (Q4) untuk aktivitas penangkal radikal dan sifat anti-penuaan masing-masing adalah 0,984 dan 0,951.

Seperti yang ditunjukkan dari biplot PLS aktivitas penangkapan radikal (Gambar 5A), bioaktivitas (DPPH, ABTS, dan ORACassay) diarahkan ke sisi positif biplot, yang merupakan area paling aktif dan paling dekat dengan P.minus, P. indica dan C.caudatus. Sebaliknya, V. negundo, O.javanica, dan C. longa diarahkan ke sisi negatif biplot, yang dianggap sebagai area yang paling tidak aktif dan jauh dari uji DPPH, ABTS, dan ORAC, dan menunjukkan korelasi negatif. dengan bioaktivitas. Dalam situasi ini, P. mimus, P. indica, dan C.caudatus telah mengelompok terpisah dari herbal yang paling tidak aktif, menunjukkan bahwa herbal ini menunjukkan efek penangkap radikal yang lebih kuat, sehingga menunjukkan bahwa ekstrak herbal ini mungkin mengandung kadar fenolik yang lebih tinggi. senyawa. Di antara tiga herbal paling aktif, P. minus ditemukan berkorelasi lebih kuat dengan uji DPPH dan ABTS, diikuti oleh uji ORAC.

Temuan ini sesuai dengan hasil in vitro dari aktivitas penangkap radikal yang telah dilakukan. Hasilnya menunjukkan bahwa P. minus menunjukkan efek radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan herbal lainnya. Hasilnya menunjukkan bahwa P. minus adalah ramuan paling aktif untuk pembasmi spesies oksigen reaktif. Metabolit sekunder yang signifikan yang berkontribusi pada aktivitas penangkapan radikal P. minus diidentifikasi sebagai quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, catechin, isorhamnetin, astragalin, dan apigenin.oteflavonoidSemua metabolit ini terletak lebih dekat ke P. minus dan juga ke tes pembersihan radikal DPPH dan ABTS. Sebuah studi sebelumnya oleh Mediani et al. juga menemukan bahwa sampel tanaman yang dikeringkan-beku menunjukkan jumlah -glukosa, -glukosa, katekin, dan asam klorogenat yang lebih tinggi, yang mungkin berkontribusi pada kapasitas pemulung radikal DPPH yang kuat dari ramuan tersebut. Namun, efek pembersihan radikal yang tinggi dari P.minus juga dapat disumbangkan oleh metabolit yang tidak teridentifikasi dalam ekstrak.

Temuan serupa juga ditemukan untuk sifat anti-penuaan. Gambar 5B menyajikan biplot yang diperoleh dari PLS sifat anti-penuaan. Bioaktivitas (aktivitas anti-elastase dan anti-kolagenase) diproyeksikan pada sisi positif dari biplot, yang merupakan area paling aktif dan lebih dekat dengan P.minus, P. indica, dan C.caudatus. Sebaliknya, V.negundo, O.javanica, dan C.longa diarahkan ke sisi negatif biplot, yang dianggap paling tidak aktif dan jauh dari aktivitas anti-elastase dan anti-kolagenase. Hal ini menunjukkan korelasi negatif atau lebih lemah terhadap bioaktivitas. Dalam situasi ini, P.mimus, P.indica, dan C. caudatus dikelompokkan terpisah dari herbal yang paling tidak aktif, menunjukkan bahwa ekstrak herbal ini menunjukkan penghambatan elastase dan kolagenase yang lebih besar. Di antara tiga herbal yang paling aktif, P. minus lagi ditemukan memiliki korelasi yang kuat dengan sifat anti-penuaan dibandingkan dengan herbal lainnya.

Temuan ini sesuai dengan hasil in vitro dari sifat anti-penuaan yang telah dilakukan sebelumnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa P.minus merupakan herba yang paling aktif menghambat enzim elastase dan kolagenase. Metabolit sekunder signifikan yang berkontribusi terhadap sifat anti-penuaan P. minus diidentifikasi sebagai quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, turunan myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, dan apigenin. Metabolit lain seperti -glukosa, -glukosa, asam fumarat, dan asam lemak mungkin juga bertanggung jawab atas bioaktivitas. Semua metabolit ini terletak lebih dekat ke P. minus dan aktivitas anti-elastase dan anti-kolagenase.

Cistanche dapat anti-penuaan

Diskriminasi herbal yang dipilih ini sesuai dengan sampel aktivitas penangkapan radikal yang tinggi khususnya. minus, P.India dan C.caudatus, yang diharapkan dapat dibedakan dari yang lain karena tingginya konsentrasi metabolit sekunder, terutama flavonoid, Kehadiran senyawa fenolik ini juga diyakini berkontribusi pada aktivitas penghambatan elastase dan kolagenase yang lebih besar dari ramuan ini [67-79,89-92].

Kontribusi senyawa bioaktif ekstrak tumbuhan terhadap kemampuan menangkal radikal bebas dan aktivitas anti-penuaan telah didokumentasikan oleh berbagai penelitian [66,72,75,79,92-101]. Selain itu, metabolit seperti flavonoid (quercetin, kaempferol, myricetin, epicatechin, dan catechin) dan fenol lainnya seperti resveratrol dan procyanidin B2, telah terbukti secara signifikan menghambat elastase dan kolagenase [69-71,79].

Dalam penelitian ini, sinyal metabolit untuk variabel penting dalam nilai proyeksi (VIP) diidentifikasi dan ditinjau untuk mendapatkan metabolit paling signifikan yang berkorelasi dengan bioaktivitas yang diuji. Ini dilakukan untuk meningkatkan integritas hasil yang disajikan di sini, yang memeriksa potensi diskriminatif dari metabolit yang diidentifikasi.vitamin c puritanGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5 dianggap signifikan untuk diskriminasi [102]. Dalam penelitian ini, semua metabolit yang berkontribusi terhadap aktivitas pembersihan radikal dan sifat anti-penuaan dapat diklasifikasikan sebagai metabolit pembeda yang signifikan karena nilai VIP-nya di atas 1,0 (Tabel 2). Kedua model PLSbiplot divalidasi menggunakan 100 permutasi acak, untuk mengkonfirmasi kemampuan validitas (R2) dan prediktif (Q2) dari model asli dengan beberapa model, dibandingkan dengan goodness of fit. R2 menggambarkan bahwa model fitness signifikan dan menjelaskan tingkat variabel Y dalam model, sedangkan Q2 menawarkan kualitas prediksi model yang serupa dengan yang dilaporkan oleh Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Hasil mengungkapkan bahwa semua perpotongan sumbu Y dari R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheNilai intersep R2 dan Q2 masing-masing berada dalam kisaran 0.0367-0.0872 dan-0.444 hingga-0.492, menunjukkan bahwa kedua model PLS valid dan tidak menunjukkan pakaian berlebihan. Oleh karena itu, kedua model PLS ini dapat dikategorikan sebagai model kinerja yang baik dan temuan ini meningkatkan keandalan model.

2.7. Kuantifikasi Relatif Metabolit Sekunder

Kuantifikasi relatif dari beberapa metabolit sekunder yang telah diidentifikasi dari tumbuhan yang dipilih ditunjukkan pada Gambar 6. Metabolit ini ditemukan sebagian besar lebih tinggi pada tumbuhan yang paling aktif seperti P. minus, terletak di sisi positif dari biplot, dan lebih dekat dengan hampir semua bioaktivitas yang diuji.apa itu cistanche?Hasil ini mengungkapkan bahwa metabolit sekunder terutama dari kelompok senyawa flavonoid yang hadir dalam jumlah tinggi di P. minus mungkin telah berkontribusi pada pembasmi radikal bebas dan sifat anti-penuaan dari ramuan ini?

Ketika membandingkan struktur yang berbeda dari flavonoid yang dapat berkontribusi pada efektivitasnya, dicatat bahwa pola hidroksilasi pada cincin-B mungkin menjadi salah satu faktor penting untuk efek penghambatan metabolit pada aktivitas enzim penuaan [80] . Sim dkk.[104] juga mengungkapkan bahwa pada tingkat protein dan mRNA, efek penghambatan flavonoid ini menjadi kuat dengan meningkatnya jumlah kelompok di cincin-B, dan mereka memeriksa hubungan struktur-aktivitas beberapa flavonoid dalam MMP-1 ekspresi gen dalam fibroblas dermal manusia UV-Airradiated.

3. Bahan dan Metode

3.1. Bahan Kimia dan Reagen

Deuterated methanol-d4(CH3OH-d4), non-deuterated KH2PO4, sodium deuterium oxide (NaOD), trimetil silil propionic acid-d4 sodium salt (TSP), etanol, dan metanol dipasok oleh Merck Millipore International (Darmstadt, Jerman). Quercetin, buffer fosfat, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH),2,2-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-asam sulfonat)[ABTS ],Trolox,kalium persulfat,2,2'-azobis(2-amidinopropana)[AAPH, epigallocatechin gallate (EGCG), buffer HEPES, enzim elastase,N-metoksi suksinil-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide dan deuterium oksida (D2O) dipasok oleh Sigma (Aldrich, Jerman).

3.2. Bahan Tanaman dan Pengambilan Sampel

Daun segar O.jacanica, P. minus, dan C.longa dikumpulkan dari Felda Sungai Koyan Satu, Raub, dan Pahang. Daun V.negundo diperoleh dari Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia. Daun segar P. indica dipanen di Taman Universitas Pertanian, Universiti Putra Malaysia, dan daun segar daun C. caudatus dikumpulkan di Institut Pertanian, Serdang, Selangor. Spesimen voucher herbal ini ditempatkan di herbarium, Institut Biosains, Universiti Putra Malaysia, dan setiap spesimen divalidasi oleh ahli botani.Cistanche anti penuaanSemua daun dipanen secara konsisten di pagi hari, pada hari yang cerah untuk memastikan keandalan kandungan metabolit. Plot di lapangan terbuka untuk setiap ramuan dipisahkan menjadi enam bagian dan setiap sampel dikumpulkan dari setiap segmen sebagai enam ulangan.

3.3.Persiapan Sampel

Setelah dipanen, daun segar dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan semua residu, dikeringkan dengan kertas tisu laboratorium, dan langsung dibekukan dengan nitrogen cair untuk menghentikan semua reaksi enzimatik dan mengawetkan metabolit sebelum liofilisasi. Sampel kemudian dikeringkan dalam pengering beku LABCONCO (Kansas City, MO, USA) sampai berat dan kadar air yang konsisten mencapai di bawah 10 persen . Semua sampel kering digiling menggunakan blender laboratorium hingga menjadi serbuk halus dan diayak menggunakan ayakan uji laboratorium (ENDECOTTS LTD.London, Inggris) berukuran 300 um untuk mendapatkan ukuran yang seragam. Sampel bubuk dikemas vakum dalam kemasan aluminium untuk melindunginya dari paparan cahaya dan kelembaban dan disimpan pada-80 derajat sebelum analisis.

3.4. Ekstraksi

Prosedur ekstraksi dijelaskan oleh Mediani et al. [105] diikuti dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 10 g masing-masing sampel bubuk direndam dalam 100 mL 60 persen etanol dalam labu berbentuk kerucut kuning dan disonikasi selama 1 jam menggunakan ultrasonik bath sonicator (WiseClean, model WUC-D10H, Seoul, Korea) di bawah suhu terkontrol (di bawah 40 derajat ) . Sampel disaring melalui kertas saring Whatman no.1 dan sisanya diekstraksi kembali dua kali dan disaring setelah ekstraksi pertama selesai. Ekstrak kemudian dikumpulkan dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator di bawah vakum pada 40 derajat. Zat kental yang diturunkan kemudian dikeringkan dengan menggunakan pengering beku LABCONCO untuk memastikan penghapusan air secara menyeluruh dan disimpan pada suhu -80 sampai digunakan lebih lanjut. Terakhir, ekstrak kasar kering diencerkan ke konsentrasi yang diperlukan untuk semua penyelidikan yang dilakukan.

3.5. Kegiatan Pemulungan Radikal DPPH

Aktivitas pembersihan radikal dari sampel ditentukan dengan mengikuti teknik yang dikembangkan oleh Kong et al.[106], yang dikembangkan dari metode modifikasi dari Brand-Williams et al. [107]dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, 50uL ekstrak sampel dalam metanol pada konsentrasi yang berbeda (0 hingga 500 ug/mL) ditambahkan dengan 195uLlarutan 0,2mMmethanolic2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) yang baru disiapkan dan disimpan. Semua sampel uji disiapkan dalam 96 wellplate. Proses penghilangan warna direkam pada 515 nm menggunakan spektrofotometer (pembaca pelat mikro Biotek EL 800, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) setelah inkubasi 60 menit dalam kegelapan dan dibandingkan dengan kontrol positif dan sampel kosong. Persentase aktivitas penangkapan radikal diukur menurut persamaan berikut:

dimana A adalah absorbansi kontrol tanpa ekstrak tumbuhan dan Simple adalah absorbansi ekstrak tumbuhan.

Ekstrak tumbuhan atau konsentrasi kontrol positif yang menangkap 50 persen DPPH radikal bebas yang stabil dihitung sebagai IC menggunakan grafik linier persentase aktivitas penangkapan radikal terhadap

ekstrak tumbuhan/konsentrasi kontrol positif. ICso yang lebih rendah menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih tinggi. Semua percobaan dijalankan dalam enam ulangan dengan Trolox dan quercetin sebagai kontrol positif.

3.6.Pengujian Pemulung Radikal ABTS

Untuk uji scavenging radikal ABTS, analisis dilakukan mengikuti prosedur yang dijelaskan oleh Arnao et al.[108] dengan beberapa amandemen. Larutan stok yang disiapkan adalah larutan ABTS plus 7 mM dan larutan kalium persulfat 2,45 mM. Untuk menyiapkan larutan kerja, kedua larutan stok dicampur dalam jumlah yang sama dan dibiarkan bereaksi dalam gelap selama 16 jam pada suhu kamar. Kemudian, larutan kerja diencerkan dengan air suling untuk memperoleh absorbansi 0.700±0,005 unit pada 734 nm menggunakan spektrofotometer (UV-1650spektrofotometer PC, Shimadzu, Kyoto, Jepang) dan dikenal sebagai Solusi ABTS plus. Solusi ABTS plus disiapkan dengan segar untuk setiap pengujian. Solusi ABTS plus ini 900 L） dibiarkan bereaksi dengan 100 L ekstrak herba selama 2 menit. Absorbansi kemudian dibaca pada 734 nm menggunakan spektrofotometer. Kurva standar yang terdiri dari 3,1 ug/mL hingga dan 50 ug/mL Trolox dikembangkan, dan hasilnya dinyatakan sebagai mg Trolox Equivalent Antioksidan Kapasitas/g sampel (mg TEAC/g sampel).

3.7. Uji Pemulung Radikal ORAC

Sebuah uji ORAC untuk mengukur kemanjuran pemulung radikal peroksil dilaksanakan seperti yang dinyatakan oleh Huang et al. [109] menggunakan pembaca fluoresensi lempeng mikro FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman). Setiap ekstrak herba dan Trolox (standar) disiapkan dalam larutan buffer fosfat 75 mM （PBS） pH 7,4. Dalam 96-mikroplate hitam sumur, total 150 L fluorescein 10 nM yang dilarutkan dalam PBS）ditambahkan diikuti oleh 25 L Trolox, ekstrak tumbuhan, atau PBS sebagai blanko. Solusi ini dipipet dalam sumur rangkap tiga. Microplate diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 derajat dan ditutup dengan penutup. Fluoresensi diukur dengan panjang gelombang eksitasi pada 458 nm dan panjang gelombang emisi pada 520 nm. Sinyal latar belakang ditentukan dengan melakukan pengukuran setiap 90 detik.

Setelah itu, 25 uL 2,2'-azobis(2-amidinopropane)(AAPH,240 mM dalam PBS) yang baru disiapkan diperkenalkan oleh injektor on-board. Peluruhan fluoresensi kemudian diambil hingga 90 menit menggunakan panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama. Evaluasi dilakukan untuk area di bawah kurva untuk sampel (fluoresensi versus waktu) dikurangi area di bawah kurva untuk blanko dan dibandingkan dengan kurva standar 25-400 M Trolox）. Nilai ORAC yang terkait dengan Trolox dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut:

3.8.Uji Penghambatan Elastase

Aktivitas penghambatan elastase ditentukan menurut teknik yang dijelaskan oleh Krause et al.[110], dengan sedikit modifikasi oleh Ndlovu et al. [75]. Sumur sampel berisi 25 L 0,1 M buffer HEPES pH7,5）, 25 L ekstrak herba 100 ug/mL）, dan 25 L enzim elastase 1 ug/mL）. Sumur kosong hanya berisi 75 L buffer HEPES dan sumur kontrol negatif berisi 50 L buffer HEPES dan 25 L enzim elastase. Sumur kontrol positif mengandung 25 L buffer HEPES, 25 L N-metoksi suksinil-Ala-Ala-Pro-Chloro（10 ug/mL）, dan 25μL enzim elastase. Sumur kontrol pelarut mengandung 25 L buffer HEPES, 25 L metanol 10 persen, dan 25 L enzim elastase. Kontrol kosong untuk ekstrak herbal untuk kontrol warna setiap ekstrak yang diuji） mengandung 150 L buffer HEPES dan 25 uL ekstrak herbal. Pelat sumur mikro kemudian diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah ini, 100μL substrat N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide, 1 mM) ditambahkan. Kemudian pelat diinkubasi selama 40 menit tambahan pada 25 derajat. Setelah inkubasi, absorbansi dibaca menggunakan spektrofotometer (pembaca lempeng mikro Biotek EL800) pada 405 nm. Persentase penghambatan ekstrak herba dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut:

dimana A kontrol adalah absorbansi buffer dengan elastase dan pelarut dan Atest adalah absorbansi buffer, elastase, dan ekstrak herba atau N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Uji Penghambatan Kolagenase

Aktivitas penghambatan kolagenase dilakukan mengikuti metode Van-Wart dan Steinbrink [111] (1981) dengan modifikasi oleh Madrone et al. [92]. Pengujian diimplementasikan dalam buffer TES 50 mM (pH7.4 dengan 0.36 mM CaCl2). Enzim kolagenase dari Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) dibuat pada konsentrasi 0.8 unit/mL (dilarutkan dalam larutan buffer stock TES). Substrat sintetis N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) disiapkan pada konsentrasi 2 mM dalam larutan buffer stock TES. Total volume 150 L untuk campuran reaksi akhir mengandung 46,3 L TESbuffer, 60 L FALGPA 0,8 mM FALGPA konsentrasi akhir）, 18,7 L enzim kolagenase 0,1 unit/mL konsentrasi akhir）, dan 25μL ekstrak herba 100 ug/mL）. Ekstrak herbal dan enzim dalam buffer TES diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit sebelum menambahkan substrat untuk memulai reaksi kimia. Kontrol negatif dilakukan dengan buffer TES. Setelah menambahkan substrat, absorbansi segera dibaca pada 340 nm menggunakan spektrofotometer (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) di 96 pelat mikrotiter sumur dan terus diukur untuk yang lain 20 menit Kontrol positif dilakukan dengan menggunakan epigallocatechin gallate (EGCG) pada 12,5 ug/mL. Persentase penghambatan sampel dihitung menggunakan persamaan sebagai berikut:

dimana A kontrol adalah absorbansi buffer TES dan Atest adalah absorbansi buffer TES, enzim kolagenase, dan ekstrak tumbuhan atau FALGPA.

3.10.Pembuatan Profil Metabolit Menggunakan 'Pengukuran H-NMR

Profil metabolit menggunakan H-NMR dari herba terpilih dilakukan berdasarkan protokol yang dijelaskan oleh Kim et al. [47] dengan sedikit modifikasi. Ekstrak herba mentah (25mg) dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi mL. Campuran buffer methanol-d4 dan KHPO4 dalam Dao (pH 6.0)mengandung 0.1 persen trimetil silypropionic acid sodium salt (TSP) ditambahkan ke sampel herba dengan volume total { {10}}.7mL pada rasio (1:1). Tabung mikrosentrifugasi yang berisi ekstrak herba kemudian divorteks selama 1 menit pada suhu kamar diikuti dengan ultrasonikasi selama 15 menit. Kemudian, campuran disentrifugasi selama 10 menit pada 5678g untuk memisahkan supernatan dari bahan yang tidak dapat larut. Selanjutnya, supernatan bening 0,6 mL dimasukkan ke dalam tabung NMR dan dikenai analisis 'H-NMR. Analisis 'H-NMR dilakukan melalui spektrometer NMR Varian INOVA 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) yang beroperasi pada frekuensi 499,887 MHz dan spektrum direkam pada 26 derajat . Setiap spektrum tunggal terdiri 64 scan dengan waktu akuisisi 3,53 menit dan lebar 20 ppm. Data dianalisis menggunakan perangkat lunak Chenomx (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Kanada) untuk melakukan pentahapan dan koreksi baseline dengan pengaturan yang konsisten. Analisis data multivariat dilakukan dengan menggunakan software SIMCA (versi 13.0, Umetrics, Umea, Swedia). 3.11. Pengelompokan 'H-NMR Spectra

Bucketing spektrum H-NMR diimplementasikan dengan menggunakan perangkat lunak Chenomx(v.6.2, Edmonton, AB, Canada). Semua spektrum dikumpulkan dari0.5-10.0 wilayah pprn dengan parameter yang sama. Parameter tersebut meliputi lebar spektral 0.04 yang diperoleh total 245 wilayah terintegrasi untuk setiap spektrum NMR. Pergeseran kimia untuk air dan sisa metanol-d pada 4.70-4.90 dan 3.27-3.35 masing-masing dihilangkan. Data binned seragam kemudian menjadi sasaran analisis data multivariat (MVDA).

3.12. Kuantifikasi Relatif Metabolit

Metabolit yang teridentifikasi diperiksa untuk kuantifikasi relatifnya yang dihitung berdasarkan rata-rata area puncak sinyal setelah binning spektrum LH-NMR.

3.13. Analisis statistik

Semua hasil dari enam ulangan dinyatakan sebagai rata-rata ± standar deviasi. Untuk pengukuran aktivitas pembersihan radikal, penghambatan aktivitas elastase dan kolagenase, dan kuantifikasi relatif metabolit, analisis statistik dilakukan menggunakan Minitab 16 (Versi 16, Minitab Inc., State College, PA, USA). Analisis varians (ANOVA) diterapkan untuk menguji perbedaan yang signifikan antara mean dengan p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Kesimpulan

Penerapan analisis H-NMR yang digabungkan dengan MVDA berhasil dalam menyelidiki variasi metabolit tumbuhan yang dipilih. Plot skor PCA menunjukkan pemisahan herbal yang berbeda menurut kelompoknya. Studi ini mengungkapkan bahwa P. minus memiliki efek pembersihan radikal tertinggi melalui uji DPPH dan ABTS dan menunjukkan aktivitas anti-penuaan tertinggi. Dua biplot analisis PLS selanjutnya memvalidasi hasil ini, karena hubungan yang kuat ditemukan antara metabolit yang diidentifikasi dalam P. minus dan bioaktivitas yang diuji. Metabolit aktif yang diyakini berkontribusi pada aktivitas pembersihan radikal dan sifat anti-penuaan P.minus termasuk quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, turunan myricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin, dan apigenin. Oleh karena itu, dapat diasumsikan bahwa metabolit ini bertanggung jawab atas efek pembersihan radikal yang kuat dan sifat anti-penuaan yang tinggi dari P. minus. Metabolit ini terutama berasal dari golongan flavonoid, khususnya flavonol. Oleh karena itu, dapat disarankan bahwa metabolit dari P. minus dapat menjadi pembasmi radikal bebas dan penghambat enzim penuaan yang menjanjikan yang dapat digunakan untuk menunda gejala penuaan dan untuk pengobatan penyakit kronis terkait penuaan. Temuan ini akan membantu untuk menetapkan potensi P. minus sebagai sumber alami agen anti-penuaan yang potensial dan sebagai pembasmi radikal bebas alami.

Artikel ini disarikan dari Molecules 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules