NGF Memodulasi Metabolisme Kolesterol Dan Merangsang Sekresi ApoE di Sel Glial Memberikan Perlindungan Saraf Terhadap Stres Oksidatif Bagian 1

Abstrak:

Kolesterol memainkan peran penting di otak, di mana aktivitas astrositik khususnya mengatur metabolisme. Memang benar, neuron dewasa menekan biosintesis kolesterol dan mengimpor sterol ini melalui partikel kaya ApoE yang disekresikan dari astrosit. Bukti terbaru menunjukkan faktor pertumbuhan saraf (NGF) dapat mengerahkan aktivitas neurotropik dengan mempengaruhi metabolisme sel.

Neuron adalah unit dasar yang membentuk otak manusia. Melalui hubungan antar neuron, mereka membentuk korteks serebral kita, yang membawa semua pengetahuan dan ingatan kita. Oleh karena itu, neuron erat kaitannya dengan kemampuan memori.

Fungsi utama neuron adalah mengirimkan informasi. Setiap neuron mempunyai sinaps yang menghubungkan dendrit dan akson neuron lain. Ketika sebuah neuron menerima sinyal, ia meneruskan sinyal tersebut ke neuron yang terhubung dengannya. Pemberian sinyal ini, yang disebut transmisi saraf, merupakan salah satu proses kunci dalam pembentukan, penyimpanan, dan pengambilan memori.

Untuk menjaga otak kita tetap sehat, kita dapat meningkatkan berfungsinya neuron kita melalui olahraga. Latihan fisik meningkatkan sirkulasi darah dan suplai oksigen ke otak, sehingga meningkatkan jumlah dan koneksi neuron. Pada saat yang sama, beragam aktivitas sosial dan pembelajaran dapat membentuk neuron baru di area otak baru dan meningkatkan plastisitas otak.

Ketika kita memiliki lebih banyak neuron aktif, ingatan kita menjadi lebih kuat. Sinkronisasi antar neuron di korteks serebral menjadi lebih merata sehingga memudahkan kita menyimpan dan mengambil informasi, sehingga meningkatkan kemampuan kognitif kita. Selain itu, jumlah neuron yang banyak dan koneksi antar neuron juga akan meningkatkan kecepatan reaksi dan kemampuan mengambil keputusan.

Oleh karena itu, menjaga kesehatan neuron dan meningkatkan daya ingat adalah hal yang harus dilakukan secara bersamaan. Kita dapat meningkatkan daya ingat kita dengan meningkatkan kesehatan neuron dengan berfokus pada latihan fisik, berbagai aktivitas sosial dan pembelajaran, serta kebiasaan makan. Mari kita bekerja sama untuk mendukung kesehatan otak kita! Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat daging cincang berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam karboksilat, polisakarida, flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak melalui berbagai saluran.

Klik tahu cara meningkatkan fungsi otak

Namun demikian, efek NGF pada homeostasis kolesterol glial masih belum dapat dijelaskan. Proyek ini bertujuan untuk menilai apakah NGF dapat mempengaruhi metabolisme kolesterol dalam sel glial. Garis sel yang diturunkan dari astrosit U373 digunakan sebagai model eksperimental untuk mencapai tujuan ini. Analisis Immunoblot dan ELISA menunjukkan bahwa protein dan enzim yang termasuk dalam jaringan metabolisme kolesterol meningkat setelah pengobatan NGF dalam sel glial. Selain itu, NGF secara signifikan meningkatkan sekresi ApoE dan jumlah kolesterol ekstraseluler dalam media kultur.

Eksperimen kultur bersama dan media yang dikondisikan U373-menunjukkan bahwa pengobatan NGF secara efisien menangkal sitotoksisitas yang dimediasi rotenon dalam sel saraf N1E-115. Sebaliknya, perlindungan saraf yang dimediasi oleh pengobatan NGF ditekan ketika N1E-115 dikultur bersama dengan sel U373 yang dibungkam ApoE. Data ini menunjukkan bahwa NGF mengontrol homeostasis kolesterol dalam sel glial. Lebih penting lagi, NGF memberikan perlindungan saraf terhadap stres oksidatif, yang kemungkinan terkait dengan induksi sekresi ApoE glial.

Kata kunci:

ApoE; astrosit; kolesterol; diferensiasi; faktor pertumbuhan saraf; metabolisme; saraf; spesies oksigen reaktif; rotenon.

1. Perkenalan

Otak ditandai dengan jumlah kolesterol tertinggi di seluruh tubuh [1]. Konsentrasi sterol yang luar biasa ini dalam sistem saraf pusat (SSP) dibenarkan oleh fakta bahwa kolesterol terlibat dalam beberapa proses biologis mendasar. Sebagai catatan, sejumlah besar kolesterol diintegrasikan ke dalam membran plasma astrosit dan neuron, di mana kolesterol menentukan morfologi seluler yang tepat dan berfungsinya reseptor membran serta neurotransmisi sinaptik dengan benar [2].
Kolesterol juga penting untuk membentuk membran baru yang diperlukan untuk pertumbuhan neurit, sinaptogenesis, dan pelepasan neurotransmitter, sehingga penting dalam diferensiasi dan pematangan neuron [3-7].

Intinya, semua kolesterol di otak berasal dari biosintesis de novo in situ. Secara khusus, penghalang darah-otak (BBB) ​​mencegah pengambilan kolesterol yang berasal dari lipoprotein yang diangkut melalui sirkulasi sistemik [8]. Oleh karena itu, sel-sel saraf mengembangkan jaringan pengatur yang patut dicontoh untuk secara mandiri mengelola permintaan mereka sendiri akan lipid ini. Sebuah model yang diterima dengan baik menetapkan bahwa setelah embriogenesis, selama periode pascakelahiran, biosintesis kolesterol menurun drastis di neuron, dengan upaya untuk menghemat energi yang digunakan untuk menghasilkan potensial aksi.

Oleh karena itu, astrosit memenuhi kebutuhan kolesterol yang lemah pada saraf, yang sintesisnya menjadi sangat jelas [1,9,10]. Pengiriman kolesterol yang diproduksi oleh astrosit ke neuron menyiratkan mekanisme transportasi horizontal yang elegan, yang melibatkan protein dan partikel penting. Secara khusus, ekspor kolesterol dimulai di astrosit, di mana kolesterol yang baru disintesis dimasukkan ke dalam partikel lipoprotein baru yang mengandung apolipoprotein E (ApoE). Bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa lipidasi partikel kaya ApoE dimediasi oleh transporter ATP-binding cassette A1 (ABCA1) (11). Selanjutnya, setelah dilepaskan ke ruang ekstraseluler, lipoprotein yang mengandung ApoE diambil oleh neuron melalui endositosis yang dimediasi oleh reseptor lipoprotein densitas rendah (LDLr) dan protein terkait LDLr 1 (LRP1) [12].

Menurut peran penting kolesterol yang diturunkan dari astrosit dalam homeostasis saraf, temuan eksperimental menunjukkan bahwa kolesterol yang terkandung dalam lipoprotein kaya ApoE secara signifikan meningkatkan diferensiasi dendrit dan fungsi sinaptik [13,14]. Media terkondisi Accordinastrocy dari astrosit penyakit Huntington (HD), yang hanya mengeluarkan sejumlah kecil kolesterol yang terikat ApoE-lipoprotein, sangat mempengaruhi pertumbuhan neurit dan aktivitas sinaptik pada neuron HD [15].

Tindakan neurotropik dari partikel yang mengandung ApoE yang diturunkan dari astrosit selanjutnya ditopang oleh dampak defisiensi ApoE, yang secara nyata menghambat neurogenesis dewasa di hipokampus [16]. Crosstalk astrosit-neuron kolesterol juga penting dalam perlindungan saraf terhadap stres oksidatif. Misalnya, beberapa laporan menunjukkan bahwa ApoE menghambat kerusakan oksidatif dan apoptosis yang disebabkan oleh paparan hidrogen peroksida [17,18].

Dari pengamatan ini, pemeliharaan homeostasis kolesterol di otak diperlukan untuk menjamin berfungsinya sel-sel saraf, dan jalur metabolisme yang mendasari pengaturan lipid ini harus dikontrol dengan baik untuk menjaga terjadinya beberapa proses neurofisiologis.

Dalam beberapa tahun terakhir, neurotropin telah muncul sebagai pemain penting dalam metabolisme sel [2,19-22]. Neurotropin termasuk dalam keluarga kecil faktor pertumbuhan yang memiliki peran yang tidak dapat disangkal dalam perkembangan saraf, kelangsungan hidup, dan plastisitas [23]. Baru-baru ini, molekul pemberi sinyal ini juga telah dikenal sebagai modulator penting dalam metabolisme sel, termasuk metabolisme kolesterol [2,22].

Bukti eksperimental menyoroti bahwa faktor pertumbuhan saraf (NGF), anggota prototipe keluarga neurotropin, merangsang biosintesis kolesterol dalam sel saraf dan hepatosit [24,25]. Menariknya, peristiwa ini melibatkan, setidaknya sebagian, reseptor neurotropin afinitas rendah p75NTR, yang memunculkan aktivasi protein pengikat elemen pengatur sterol 2 (SREBP-2) dan, pada gilirannya, menginduksi transkripsi protein terkait kolesterol. gen [25]. Aktivitas NGF pada metabolisme kolesterol tidak terbatas pada biosintesis, karena NGF juga meningkatkan penyerapan kolesterol dengan meningkatkan ekspresi LDLr di neuron [26].

Meskipun terdapat informasi ini, pengetahuan tentang kemungkinan kontribusi NGF dalam regulasi homeostatis kolesterol masih sangat terbatas. Khususnya, masih kurangnya penelitian sistematis yang menilai peran NGF dalam regulasi metabolisme kolesterol dalam sel astrositik. Mengingat bahwa kolesterol yang diproduksi oleh astrosit sangat penting untuk menjamin fisiologi saraf, penting untuk memahami apakah dapat mempengaruhi metabolisme kolesterol dalam sel glial serta transportasi kolesterol antar sel, yang peraturan khususnya sangat penting untuk menjamin kesehatan otak.

Berdasarkan penelitian ini, tujuannya adalah untuk mengeksplorasi keterlibatan prospektif NGF dalam modulasi metabolisme kolesterol dalam sel glial, serta dampaknya terhadap diferensiasi saraf dan kelangsungan hidup saraf dalam kondisi stres oksidatif.

2. Hasil

2.1. U373 Express Baik Reseptor NGF TrkA dan p75NTR

NGF awalnya diidentifikasi sebagai faktor pertumbuhan dengan tropisme spesifik untuk sel saraf. Namun, akumulasi bukti menunjukkan bahwa neurotropin ini juga menginduksi efek biologis pada beberapa sel dan jaringan non-neuronal [22]. Aktivitas NGF dipastikan dengan pengikatannya pada reseptor afinitas tinggi TrkAd dan reseptor afinitas rendah p75NTR [2].

Jadi, kami awalnya memastikan apakah sel U373 mengekspresikan reseptor NGF. Khususnya, U373 adalah garis sel astrositoma yang banyak digunakan sebagai model kultur sel astrosit, karena beberapa laporan menunjukkan bahwa mereka mewakili sifat morfologi, metabolik, dan fungsional astrosit [27-29]. Menurut data yang dipublikasikan [30], analisis imunofluoresensi menunjukkan bahwa sel U373 mengekspresikan TrkA dan p75NTR pada tingkat yang cukup besar (Gambar S1A). Hasil ini juga dikonfirmasi oleh analisis Western blot, yang menunjukkan bahwa sel U373 memiliki potensi untuk sepenuhnya responsif terhadap NGF.

Karena pemberian NGF dapat mempengaruhi tingkat ekspresi reseptornya, berpotensi mengubah keseimbangan antara jalur pensinyalan yang ditimbulkan oleh TrkA dan/atau p75NTR [31-33], ekspresi kedua reseptor juga diperiksa setelah 48 jam pengobatan NGF. Namun, tidak ada perubahan yang diamati pada jumlah protein TrkA dan p75NTR setelah stimulasi dengan neurotropin (Gambar S1B).

2.3. NGF Meningkatkan Sekresi Kolesterol sebesar U373 ke dalam Media Kultur

Hasil yang diperoleh mendorong kami untuk mempelajari apakah efek yang dimediasi oleh NGF dapat mencerminkan modulasi kandungan kolesterol. Pewarnaan Minyak Merah O dilakukan untuk memvisualisasikan lipid netral, termasuk ester kolesterol. Ukuran dan jumlah tetesan lipid yang ditemukan pada sel U373 serupa dengan yang dilaporkan pada astrosit primer [34,35].

Namun, tidak ada perubahan yang diamati pada pengobatan NGF (Gambar 2A dan S2A, B). Demikian pula, tidak ada perubahan yang terdeteksi pada jumlah kolesterol bebas, dievaluasi dengan pewarnaan filipin (Gambar 2B dan S2C). Kurangnya efek signifikan terhadap kadar kolesterol intraseluler selanjutnya ditopang oleh uji enzimatik kolesterol, yang menyoroti bahwa NGF tidak mengubah kandungan kolesterol total, kolesterol bebas, dan kolesterol ester (Gambar 2C).

Sebaliknya, jumlah kolesterol (bebas, ester, dan total) meningkat secara nyata pada media kultur NGF yang diberi perlakuan U373-(Gambar 2D). Ketika dievaluasi secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa NGF mendorong ekstrusi kolesterol dengan meningkatkan penghabisan partikel yang mengandung ApoE yang dimediasi ABCA1-.

Gambar 1. NGF memodulasi ekspresi protein utama yang terlibat dalam homeostasis kolesterol dalam sel U373 dan meningkatkan sekresi ApoE n dalam media kultur U373. (A – G) Perwakilan Western blot dan analisis densitometri SREBP-1, SREBP-2, HMGCR, LDLr, NPC1, ABCA1, dan ApoE dalam sel U373 yang diobati dengan kendaraan (Ctrl) dan NGF (100 ng /mL) selama 48 jam. n=6 eksperimen berbeda.

Aktin dan vinculin digunakan sebagai kontrol pemuatan. (H) Kuantifikasi tingkat ApoE (µg/mL) dengan uji ELISA dalam media kultur U373 yang diberi perlakuan kendaraan dan NGF. n=3 percobaan yang berbeda. Data mewakili rata-rata ± SD. Analisis statistik dinilai dengan tes Studet-tes tunggal yang tidak berpasangan. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

2.4. p75NTR Sebagian Terlibat dalam Efek yang Dimediasi NGF pada Jaringan Protein Kolesterol

Temuan eksperimental menunjukkan bahwa NGF mempengaruhi metabolisme kolesterol dalam sel hati melalui aktivasi reseptor afinitas rendah p75NTR [25]. Untuk menguji apakah jalur pensinyalan ini juga dapat dipertahankan dalam sel astrositik, kami memperlakukan U373 dengan LM11A-31, sebuah ligan kecil yang bertindak sebagai modulator p75NTR spesifik. Senyawa ini tidak mengaktifkan TrkA tetapi, mirip dengan NGF, memunculkan induksi jalur pensinyalan hilir p75NTR [36]. LM11A-31 meniru peningkatan HMGCR yang dimediasi NGF (Gambar 3A).

Namun, tidak ada perubahan yang diamati pada protein lain yang terlibat dalam metabolisme kolesterol (Gambar 3B – D), maupun pada jumlah ApoE ekstraseluler (Gambar 3E) dan kolesterol (total, bebas, dan ester) yang dilepaskan ke media kultur (Gambar 3F). ). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi HMGCR yang diinduksi NGF dimediasi oleh aktivitas p75NTR, sedangkan efek pada NPC1, ABCA1, sekresi ApoE, dan ekstrusi kolesterol kemungkinan besar bergantung pada jalur transduksi lain, mungkin melibatkan TrkA.

Gambar 2. Efek NGF pada lipid netral dan kandungan kolesterol. (A) Sel U373 diobati dengan kendaraan (Ctrl) atau NGF (100 ng/mL) selama 48 jam dan kemudian diwarnai dengan Minyak Merah O untuk memvisualisasikan kandungan lipid netral intraseluler. n=3 percobaan yang berbeda. (B) Gambar representatif pewarnaan filipin dilakukan pada sel U373 yang diobati dengan kendaraan (Ctrl) dan NGF (100 ng/mL) selama 48 jam. n=3 percobaan yang berbeda. (C) Kuantifikasi kadar kolesterol intraseluler (kolesterol total, kolesterol bebas, dan ester kolesterol) dalam sel U373 yang diobati dengan kendaraan dan NGF. n=3 percobaan yang berbeda. (D) Kuantifikasi kolesterol (kolesterol total, kolesterol bebas, dan ester kolesterol) dalam media kultur sel U373 yang diberi perlakuan dengan kendaraan (Ctrl) dan NGF (100 ng/mL) selama 48 jam. n=3 percobaan yang berbeda. Data mewakili rata-rata ± SD. Analisis statistik dilakukan dengan menyanyikan uji-t Student yang tidak berpasangan. ** P<0.01.

Gambar 3. Pengaruh modulasi p75NTR oleh LM11A-31 pada metabolisme dan sekresi kolesterol. (A – D) Perwakilan Western blot dan analisis densitometri HMGCR, ABCA1, NPC1, dan ApoE dalam sel U373 yang diobati dengan kendaraan (Ctrl) dan LM11A-31 (0.1 µM) selama 48 jam. n=4 percobaan yang berbeda.

Vinculin berfungsi sebagai protein rumah tangga untuk menormalkan pemuatan protein. (E) Kuantifikasi jumlah ApoE (µg/mL) dengan uji ELISA dalam media kultur dari sel U373 yang diberi perlakuan kendaraan dan LM11A-31-. n=3 percobaan yang berbeda. (F) Kuantifikasi kolesterol (kolesterol total, kolesterol bebas, dan ester kolesterol) dalam media kultur sel U373 yang diberi kendaraan (Ctrl) dan LM11A-31 (0.1 µM) selama 48 jam. n=3 eksperimen berbeda. Data mewakili rata-rata ± SD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan tes Studet tidak berpasangan tunggal. *** hal < 0.001.

For more information:1950477648nn@gmail.com