Efek Neuroprotektif Ekstrak Daun Glochidion Zeylanicum Terhadap Toksisitas Terinduksi H2O2/Glutamat pada Sel Saraf Kultur Dan Toksisitas Terinduksi A pada Caenorhabditis Elegans 2

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

3.3.Efek Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap Stres Oksidatif yang Diinduksi Glutamat pada Sel Neuronal (HT22 dan Neuro-2a) yang Dikultur

Untuk menyelidiki apakah GZM bertindak melawan kerusakan oksidatif, tingkat ROS intraseluler diperiksa. Bukti toksisitas yang diinduksi glutamat dalam sel HT22 dan Neuro-2a ditunjukkan oleh peningkatan produksi ROS intraseluler (1.7-1.9-kali lipat) (Gambar 4a,b). Produksi ROS intraseluler yang diinduksi glutamat jelas berkurang dengan pengobatan bersama dengan ekstrak GZM (Gambar 4a, b). Kami lebih lanjut menyelidiki enzim antioksidan endogen untuk mendukung efek perlindungan ekstrak GZM pada paparan glutamat. Ekspresi enzim antioksidan, termasuk glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroksidase (GPx), katalase (CAT), dan superoksida dismutase (SOD) diukur. Dalam penelitian kami sebelumnya, konsentrasi tertinggi ekstrak GZM 10 ug/mL） dilaporkan menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat secara in vitro dan in vivo [11]. Sesuai dengan laporan tersebut, konsentrasi tertinggi ekstrak GZM (10 ug/mL) menunjukkan perlindungan saraf yang kuat pada sel HT22 dan Neuro-2a (Gambar 2-4). Lebih lanjut, ekstrak GZM (10 ug/mL) meningkatkan ekspresi gen enzim antioksidan, termasuk SOD1, SOD2, GPx, GST, dan GSTa2, baik dalam sel HT22 maupun Neuro-2a, kecuali untuk CAT (Gambar 4c,d ). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak GZM melindungi terhadap sitotoksisitas yang diinduksi glutamat/H2O2-dengan menekan produksi ROS intraseluler dan induksi ekspresi enzim antioksidan.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

3.4. Pengaruh Ekstrak GZM pada Ekspresi Jalur SIRT1/Nrf2

Untuk menentukan mekanisme yang mendasari efek neuroprotektif dari ekstrak GZM, kami menyelidiki tingkat ekspresi SIRTl dan Nrf2. Kami menemukan bahwa neuron yang diobati dengan GZM secara signifikan meningkatkan kadar protein SIRTl dan Nrf2 (Gambar 5a, b). Lebih lanjut, pengobatan GZM berpotensi memodulasi jalur pensinyalan SIRT1 / Nrf2 yang diatur gen antioksidan NQO1, GCLM, EAAT3, dan SIRT1 (Gambar 5c, d). Temuan menunjukkan bahwa ekstrak GZM menambah jalur pensinyalan SIRT1 / Nrf2 untuk mempromosikan pertahanan seluler terhadap penghinaan toksik.

3.5.Efek Ekstrak GZM pada Aktivitas Pertumbuhan Neurit di Sel Neuro-2a

Untuk mempelajari diferensiasi neuron, sel Neuro-2a digunakan sebagai perwakilan[18]. Sesuai dengan penelitian sebelumnya, kekurangan serum (DMEM dilengkapi dengan 1 persen FBS) diinduksi hasil neurit di Neuro-2a [18]. Neuro-2sel yang diobati dengan ekstrak GZM menghasilkan peningkatan neuritogenesis. Sel Neuro-2a yang diberi ekstrak GZM meningkatkan panjang neurit (30,92 um) dan jumlah sel yang mengandung neurit (52,35 persen ) bila dibandingkan dengan kontrol (1 persen FBS) (panjang neurit, 16,30 um; bantalan neurit sel, 22,26 persen )(Gambar 6a,bg).

cistanche dapat anti-penuaan

Untuk lebih memastikan terjadinya aktivitas pertumbuhan neurit, ekspresi penanda pertumbuhan neurit, protein terkait pertumbuhan 43 (GAP-43) [19], dan Teneurin-4 (Sepuluh-4) [20] ditentukan. Ekstrak GZM secara signifikan meningkatkan GAP-43 dan Sepuluh-4 ekspresi baik pada tingkat mRNA dan protein dalam sel Neuro-2a bila dibandingkan dengan kontrol DMSO (1 persen FBS )(Gambar 6c-f) menunjukkan efek neuritogenesis dari ekstrak GZM.

3.6. Efek Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap Kelumpuhan yang Diinduksi A pada C.elegans

Untuk menguji lebih lanjut efek neuroprotektif ekstrak GZM in vivo, digunakan strain transgenik C. elegans yang mengekspresikan A. Kami pertama kali menyelidiki efek ekstrak GZM terhadap kelumpuhan yang diinduksi A pada cacing transgenik CL4176 dan CL2006. Dalam penelitian kami sebelumnya, ekstrak GZM menunjukkan resistensi terhadap stres oksidatif dan sifat perpanjangan umur di C. elegans pada konsentrasi non-toksik 1-5 ug/mL）【11】. Strain kontrol CL802 (tidak mengekspresikan A ) tidak menunjukkan kelumpuhan, meskipun pengobatan (data tidak ditampilkan) pada konsentrasi yang diuji (1-5 ug/mL).cistanche wirkungKami menemukan bahwa cacing CL4176 yang diobati dengan ekstrak GZM telah secara nyata menunjukkan penundaan PT50 (waktu yang dibutuhkan 50 persen nematoda untuk dilumpuhkan) bila dibandingkan dengan kontrol DMSO (Gambar 7a) (Tabel S1, Bahan Tambahan). Demikian pula, ekstrak GZM juga menunjukkan keterlambatan dalam kelumpuhan yang diinduksi A dari cacing transgenik CL2006 selama masa dewasa (Gambar 7b). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak GZM melindungi C.elegans dari kerusakan akibat A.

3.7.Efek Neuroprotektif Ekstrak GZM terhadap Cacat yang Diinduksi A pada Perilaku Kemotaksis pada C.elegans

Untuk mendukung efek neuroprotektif ekstrak GZM di C.elegans, uji kemotaksis dengan cacing transgenik CL2122 dan CL2355 dilakukan. Cacing CL235 transgenik ditemukan mengekspresikan A 1-42 dalam sel saraf, yang mengakibatkan cacat pada sensitivitas kemotaksis 21】. Karena ekstrak GZM pada konsentrasi 1-5 ug/mL tertunda kelumpuhan di CL4176 cacing transgenik, 5 ug/mL ekstrak GZM dipilih untuk semua percobaan berikutnya. Untuk menentukan efek potensial ekstrak GZM pada perilaku kemotaksis, kami menggunakan diacetyl sebagai atraktan. Hasilnya dinyatakan sebagai indeks kemotaksis dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan. Pertama, kami menemukan bahwa perlakuan ekstrak GZM tidak mempengaruhi perilaku kemotaksis mutan CL2122 (regangan kontrol transgenik) (Gambar 7d). Cacing CL2355 yang diobati dengan ekstrak GZM menunjukkan respons kemosensori yang meningkat secara signifikan terhadap atraktan (diacetyl) dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati (Gambar 7c), menunjukkan bahwa ekstrak GZM memiliki potensi untuk meningkatkan perilaku kemotaksis pada C.elegans terhadap A .bioflavonoid jerukSecara keseluruhan, efek ekstrak GZM pada perilaku C. elegans yang bergantung pada A dapat memberikan kesempatan untuk menguraikan perlindungan saraf yang dimediasi ekstrak GZM terhadap AD.

4. Diskusi

Penyakit Alzheimer (AD) adalah kondisi neurodegeneratif yang lazim ditemukan pada populasi lanjut usia di seluruh dunia [1]. Saat ini, tidak ada pengobatan yang memuaskan untuk berbagai kondisi patologis yang terkait dengan AD. Stres oksidatif secara intensif berkorelasi dengan penyakit neurodegeneratif, khususnya AD [3].manfaat cynomoriumProduk alami yang mengandung antioksidan kuat dapat digunakan sebagai pengobatan alternatif atau untuk pencegahan penyakit neurodegeneratif. Dalam penelitian ini, kami mengeksplorasi efek ekstrak GZM pada neurodegenerasi. Ini adalah laporan pertama yang menjelaskan efek neuroprotektif dari ekstrak daun GZ in vitro (sel saraf berbudaya HT22 dan Neuro-2a) dan in vivo (C.elegans).

Toksisitas neuron akibat stres oksidatif dianggap sebagai salah satu faktor utama yang terkait dengan perkembangan penyakit neurodegeneratif, termasuk AD [3]. Tingkat glutamat yang tinggi mengaktifkan produksi ROS, yang menyebabkan neurotoksisitas, kerusakan sel saraf, dan akhirnya, kematian sel saraf [4,6]. Selain itu, hidrogen peroksida (H2O2) adalah mediator penting umum dari stres oksidatif dalam sel saraf [22]. Oleh karena itu, glutamat dan H2O2 digunakan sebagai agen neurotoksik untuk menginduksi kematian sel saraf dalam penelitian ini. Untuk mempelajari efek neuroprotektif terhadap toksisitas glutamat, sel HT22 neuron hipokampus tikus yang kekurangan reseptor glutamat ionotropik digunakan [6]. Selain itu, sel neuroblastoma tikus Neuro-2a banyak digunakan sebagai perwakilan dalam studi pertumbuhan neurit dan diferensiasi neuron [23]. Pertama, efek neuroprotektif ekstrak GZM terhadap toksisitas yang diinduksi H-Oz/glutamat ditentukan menggunakan sel HT22 dan Neuro-2a. Kami menemukan bahwa ekstrak GZM memberikan efek neuroprotektif yang kuat terhadap sitotoksisitas yang diinduksi glutamat/H2O2-dalam sel HT22 dan Neuro-2a.

Stres oksidatif pada paparan glutamat dapat menjadi alasan degradasi struktural, kerusakan DNA, dan disfungsi mitokondria, yang memainkan peran penting dalam kematian sel saraf [6]. Dalam penelitian kami, kelangsungan hidup sel yang diobati dengan glutamat saja sangat rendah (sekitar 50 persen lebih rendah) dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati. Selain itu, peningkatan penting dalam tingkat ROS intraseluler terdeteksi pada sel HT22 (1,7-kali lipat) dan Neuro-2a (1,9 kali lipat) pada pengobatan glutamat bila dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. Akibatnya, sitotoksisitas yang diinduksi glutamat dalam sel neuron (HT22 dan Neuro-2a) memang ditemukan terkait dengan peningkatan ROS intraseluler yang menguatkan dengan laporan sebelumnya [24]. Enzim antioksidan endogen, CAT, SOD, GST, dan GPx memainkan peran penting dalam perlindungan saraf dengan mencegah kerusakan sel yang dimediasi ROS [25-27]Kami menemukan bahwa ekstrak GZM dapat melawan sitotoksisitas yang diinduksi H-Oz/glutamat dengan menekan intraseluler Produksi ROS dan peningkatan ekspresi gen antioksidan sesuai dengan laporan sebelumnya, di mana ekstrak GZ merangsang ekspresi Sod-3 dan Gst-4 di C.elegans [11].

Faktor transkripsi NRF2 (faktor inti eritroid 2-faktor terkait 2) adalah respons mekanisme seluler utama terhadap stres oksidatif dan kerusakan sel [28-31]. Jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2 adalah jalur pensinyalan penting untuk menyeimbangkan stres oksidatif, yang secara aktif terlibat dalam berbagai penyakit neurodegeneratif [25,26]. SIRT1 mengelola faktor transkripsi, termasuk Nrf2, yang bertindak sebagai pengatur utama sistem pertahanan antioksidan. Nrf2 mengikat elemen respon antioksidan (ARE), yang mengarah ke peningkatan ekspresi enzim detoksifikasi (fase II) (GPx, GSTol, dan GSTa2) dan gen antioksidan (SOD, CAT, NQO1, GCLM, dan EAAT3) [25,26] Sesuai dengan laporan, ekspresi protein SIRT1 dan Nrf2 serta gen antioksidan, termasuk NQO1, GCLM, EAAT3, dan SIRT1, diregulasi pada pengobatan GZM. Selanjutnya, dengan ekspresi enzim antioksidan endogen, SOD, GPx, GSTol, dan GSTa2 juga meningkat secara signifikan, yang mungkin disebabkan oleh aktivasi Nrf2/ARE. Hasilnya sesuai dengan penelitian kami sebelumnya, di mana ekstrak GZleaf ditunjukkan untuk memberikan sifat ketahanan stres oksidatif pada C. elegans melalui mekanisme yang bergantung pada SKN-1/Nrf-2 [11]. Secara kolektif, temuan kami menunjukkan bahwa sifat pertahanan antioksidan dari ekstrak GZM dalam sel saraf yang dikultur (HT22 dan Neuro-2a) melibatkan jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2. NRF2 telah terbukti mempengaruhi arah metabolisme glutamat yang diturunkan dari glutamin, termasuk generasi glutathione antioksidan (GSH) untuk mempertahankan homeostasis redoks [13]. Dalam penelitian ini, pertama-tama kami fokus pada sifat antioksidan ekstrak GZM melalui jalur pensinyalan SIRT1 / Nrf2, yang merupakan pertahanan antioksidan yang terkenal. Kami menemukan bahwa ekstrak GZM menambah jalur pensinyalan SIRT1 / Nrf2 untuk mempromosikan pertahanan seluler terhadap penghinaan toksik. Namun demikian, penyelidikan efek ekstrak GZM pada jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2 di bawah kondisi toksisitas yang diinduksi glutamat adalah topik yang menarik untuk mengkonfirmasi sifat antioksidan ekstrak GZM melalui jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2.

Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan (stres oksidatif) telah terlibat dalam perkembangan penyakit neurodegeneratif [1,3]. Selama dekade terakhir, senyawa polifenol telah dieksplorasi secara ekstensif dalam efek neuroprotektif karena sifat antioksidannya [13,32-35].metode ekstraksi flavonoid pdfSelain itu, senyawa antioksidan tidak langsung [36] (sistem antioksidan moderat dan jalur terkait, tetapi tidak interaksi langsung dengan spesies reaktif) seperti asam dokosaheksaenoat (DHA)[37], Vitamin K[38], dan asam sinapic [39] telah muncul di pengobatan alternatif penyakit neurodegeneratif. Mengingat hal di atas, temuan kami didukung bahwa efek menguntungkan GZM pada efek neuroprotektif mungkin bergantung pada aktivitas antioksidannya.

Neuritogenesis atau pertumbuhan neurit memainkan peran penting dalam perkembangan saraf [32].eceng gondok gurunSifat pertumbuhan neurit dari ekstrak GZM ditentukan menggunakan sel Neuro-2a. Ekstrak GZM terbukti mengerahkan aktivitas pertumbuhan neurit karena meningkatkan panjang neurit dan jumlah sel yang mengandung neurit. Selain itu, fenomena ini lebih lanjut dikonfirmasi oleh peningkatan ekspresi penanda pertumbuhan neurit GAP-43 dan Sepuluh-4. Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa polifenol, termasuk asam galat [32,34], cate-chin [ 13,40,41] dan quercetin[33,42,43], meningkatkan aktivitas pertumbuhan neurit. Kehadiran senyawa fenolik serta asam galat, katekin, dan quercetin dalam ekstrak GZM mungkin bertanggung jawab atas perilaku yang diamati (Gambar Tambahan S1) [1,12].

Plak A dan protein tau adalah ciri khas AD yang terkenal [4,45]. Produksi dan deposisi A abnormal memainkan peran penting dalam patogenesis AD [44].C.el egans adalah organisme model yang berguna untuk memahami neurodegenerasi terkait usia [47]Cacing ini memiliki sistem saraf dasar yang hanya berisi 302 neuron yang memetakan secara komprehensif konektivitas saraf [47]. Selain itu, cacing transgenik menunjukkan akumulasi karbonil protein dan ROS, mirip dengan patologi AD [48]. Dengan demikian, kami memanfaatkan korelasi yang mapan antara ekspresi A dan gejala yang tampak, termasuk kelumpuhan dan perilaku kemotaksis, dalam model C.elegans transgenik. Fenotipe kelumpuhan pada strain A yang mengekspresikan (dalam otot) CL4176 dan CL2006 pertama kali diselidiki. Ekstrak GZM menunda onset yang diinduksi A dan kelumpuhan usia pada cacing CL4176 dan CL2006 transgenik, masing-masing. Untuk menghubungkan toksisitas A dengan fungsi neurologis, perilaku kemotaksis dari A yang mengekspresikan regangan (dalam neuron) CL2355 dieksplorasi. Ekstrak GZM ditemukan menunjukkan perbaikan dalam defek perilaku kemotaksis pada cacing CL2355 transgenik terhadap A . Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak GZM melindungi fungsi otot dan neurologis di C elegans dari toksisitas yang diinduksi A. Beragam penelitian telah melaporkan bahwa faktor transkripsi DAF-16 dan SKN-1 memainkan peran penting dalam deposisi A pada nematoda[47,48]. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami membuktikan bahwa ekstrak daun GZM dapat merangsang ketahanan stres oksidatif melalui jalur pensinyalan DAF-16/FoxO dan SKN-1/Nrf-2, yang mengarah pada peningkatan umur dan kesehatan C. elegans [11]. Kami berspekulasi bahwa DAF-16/FoxO dan SKN-1/Nrf-2 mungkin memainkan peran dalam perlindungan yang dimediasi ekstrak GZM terhadap toksisitas A.

Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa antioksidan fenolik dapat melindungi terhadap neurotoksisitas yang disebabkan oleh glutamat, peptida A, dan stres oksidatif, yang terutama bergantung pada jalur pensinyalan Nrf2/ARE [13,17,49-52]. Ekstrak GZM mengandung senyawa fenolik termasuk asam galat, katekin, dan quercetin (Gambar Tambahan S1)[1,12]. Dengan demikian, efek neuroprotektif yang dimediasi oleh jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2 dapat dihasilkan dari adanya senyawa bioaktif dalam ekstrak GZM. Studi lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi keterlibatan efek neuroprotektif dan mengeksplorasi lebih banyak target yang mungkin dari ekstrak GZM.

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, efek neuroprotektif dari ekstrak GZM terhadap toksisitas yang diinduksi H202/glutamat/A dan sifat pertumbuhan neurit ditunjukkan dalam penelitian ini. Ekstrak GZM melindungi terhadap toksisitas oksidatif yang diinduksi H4O2/glutamat dengan menghambat akumulasi ROS intraseluler dan meningkatkan enzim antioksidan endogen melalui jalur pensinyalan SIRT1/Nrf2. Selain itu, ekstrak GZM melindungi terhadap toksisitas yang diinduksi A pada C. elegans. Selain efek neuroprotektifnya, ekstrak GZM menunjukkan efek menguntungkan dalam mempromosikan aktivitas pertumbuhan neurit. Antioksidan yang saling terkait dalam proses mengatasi toksisitas akibat stres oksidatif dan aktivitas pemicu pertumbuhan neurit telah menjadi target utama terapi neuroprotektif. Ekstrak GZM menunjukkan sifat neuroprotektif yang tidak hanya melindungi terhadap toksisitas yang diinduksi H202/glutamat/A tetapi juga meningkatkan aktivitas pertumbuhan neurit. Efek neuroprotektif ekstrak GZM berhasil dikonfirmasi dalam sel saraf (HT22 dan Neuro-2a) yang dikultur dan model C. elegans. Penelitian ini mengkonfirmasi, untuk pertama kalinya, efek neuroprotektif yang menguntungkan dari ekstrak GZM, menunjukkan bahwa G.zeylanicum mungkin menjadi kandidat neuroprotektan untuk pencegahan dan pengobatan DA dan gangguan neurodegeneratif lainnya yang terkait dengan stres oksidatif. Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan pada organisme model yang lebih kompleks untuk menerangi komponen aktif ekstrak GZM dan jalur mekanistik yang terlibat dalam perlindungan saraf untuk mendukung potensi terapeutik ekstrak tumbuhan untuk pengobatan alternatif atau tambahan penyakit neurodegeneratif.

Artikel ini disarikan dari Biology 2021, 10, 800. https://doi.org/10.3390/biology10080800 https://www.mdpi.com/journal/biology