Efek Neuroprotektif Ekstrak Bu-Shen-Huo-Xue Terhadap Apoptosis yang Diinduksi Glukosa Tinggi pada Sel PC12

Untuk informasi lebih lanjut:{0}}

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Studio Penelitian Integrasi Pengobatan Tradisional dan Barat, Rumah Sakit Pertama, Universitas Peking, Beijing, Cina.

2Laboratorium Kunci Negara untuk Obat Alami dan Biomimetik, Sekolah Ilmu Farmasi, Universitas Peking, Beijing, Cina.

Highlight

Neurotoksisitas yang diinduksi glukosa (HG) yang tinggi terlibat dalam patologipenderita diabetesensefalopati (DE). Dalam penelitian kami, ekstrak Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), formula poliherbal, menunjukkanpelindung sarafaktivitas pada sel PC12 yang diinduksi HG dan mekanisme yang mungkin dapat dikaitkan dengan penekanan generasi spesies oksigen reaktif (ROS) serta jalur pensinyalan caspase yang dimediasi mitokondria dan JNK / p38 MAPK. Studi ini memberikan agen yang menjanjikan untuk pengobatan DE dalam aplikasi klinis.

Klik untuk manfaat ekstrak cistanche dan Cistanche untuk ginjal

Bentengadalah ramuan tonik terkenal yang dapat menyehatkan dan melindungiginjal. Dalam teori pengobatan tradisional Tiongkok,Bentengadalah ramuan terbaik untukginjal.Bentengkaya akan echinacoside, acteoside, dan flavonoids. Bahan-bahan efektif ini dalamBentengdapat mengurangiginjalapoptosis sel dan peningkatanginjalproliferasi sel. Karena itu,Bentengadalahsuplemen ginjal alami.

Abstrak

Tujuan: Untuk menyelidiki efek neuroprotektif ekstrak Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), formula poliherbal, terhadap neurotoksisitas yang diinduksi Glukosa Tinggi (HG) dalam sel PC12. Metode: Uji viabilitas sel, uji Lactate Dehydrogenase (LDH), deteksi Reactive Oxygen Species (ROS), Hoechst 33258, pewarnaan ganda Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB), dan uji Potensi Membran Mitokondria (MMP). Selain itu, Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP, cytochrome c, dan Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) dideteksi oleh western blot. Hasil: Ekstrak BSHX meningkatkan viabilitas sel dan menurunkan kebocoran LDH dengan cara yang bergantung pada konsentrasi dalam sel PC12 yang diinduksi HG. Selain itu, ekstrak BSHX menurunkan tingkat ROS intraseluler, meningkatkan potensial membran mitokondria, mengatur ekspresi Bax dan Bcl-2, dan menghambat pelepasan sitokrom c dari mitokondria. Selanjutnya, ekstrak BSHX melemahkan aktivasi caspase-3 dan PARP dan menghambat fosforilasi c-Jun N-terminal kinase (JNK) dan p38 MAPKs. Kesimpulan: Ekstrak BSHX menunjukkan efek neuroprotektif yang signifikan pada apoptosis yang diinduksi HG pada sel PC12. Efek ini mungkin terkait dengan penekanan generasi ROS serta caspase yang dimediasi mitokondria dan jalur pensinyalan JNK / p38 MAPK.

Kata kunci:ensefalopati diabetik, pengobatan tradisional Cina, ekstrak Bu-Shen-Huo-Xue,pelindung saraf, glukosa tinggi

Singkatan: AO: acridine orange; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Ensefalopati Diabetik; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: Dimetil Sulfoksida; EB: Etidium Bromida; ERK: Protein Kinase yang Diatur Ekstraseluler; HG: Glukosa Tinggi; JNK: c-Jun N-terminal Kinase; LDH: Laktat Dehidrogenase; MAPK: Protein Kinase yang Diaktifkan Mitogen; MWP: Resep Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium Bromide; PBS: Saline Penyangga Fosfat; PBST: Saline Penyangga Fosfat, 0,1 persen Tween 20; ROS: Spesies Oksigen Reaktif; DMT2: Diabetes Mellitus Tipe 2; TCM: Pengobatan Tradisional Tiongkok

Latar belakang

Dalam beberapa tahun terakhir, Diabetic Encephalopathy (DE), komplikasi Diabetes Mellitus (DM) yang terjadi pada Sistem Saraf Pusat (SSP), telah mendapat perhatian luas. DE dapat dikaitkan dengan beberapa faktor risiko seperti usia, durasi, dan kontrol glikemik diabetes [1, 2]. Manifestasi klinis DE adalah perubahan morfologi dan fisiologis di otak dan disfungsi kognitif yang dihasilkan. Hiperglikemia, stres oksidatif, dan peradangan kronis mungkin menjadi penyebab patogen penting DE [3]. Meskipun semakin banyak percobaan telah menunjukkan bahwa hiperglikemia berkelanjutan jangka panjang dapat mempercepat penuaan otak, patogenesis DE yang tepat belum diselidiki.

Apoptosis adalah kematian sel terprogram yang dikendalikan oleh gen untuk menjaga stabilitas lingkungan mikro. Protein yang terlibat dalam apoptosis termasuk keluarga Bcl-2, caspases, p53, dll. Keluarga Bcl-2 dibagi menjadi dua kategori, satu yang mendorong kematian sel, seperti Bax, dan yang lainnya menolak apoptosis, seperti Bcl-2. Mereka dapat mengatur apoptosis melalui jalur pensinyalan caspase, yang merupakan reaksi amplifikasi kaskade dari substrat hidrolisis terbatas caspase yang ireversibel [4-6]. Selain itu, penelitian telah menunjukkan bahwa apoptosis yang diinduksi Glukosa Tinggi (HG) dikaitkan dengan disfungsi mitokondria, kerusakan DNA, dan produksi Reactive Oxygen Species (ROS) yang berlebihan [7]. Sebuah studi pada tikus diabetes menunjukkan bahwa Adenosin 5'-monophosphate (AMP)-activated Protein Kinase (AMPK), energi intraseluler dan reseptor stres, dapat menghambat apoptosis yang dimediasi ROS. Selain itu, semakin banyak bukti telah menunjukkan bahwa penghambatan Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) dapat bermanfaat untuk penghambatan apoptosis neuron. Laporan lain menunjukkan bahwa c-Jun N-terminal Kinase (JNK), Extracellular Regulated Protein Kinases (ERK), jalur pensinyalan p38 MAPK berpotensi mengatur apoptosis neuron [8,9].

Berdasarkan teori pengobatan tradisional Tiongkok,ginjaldefisiensi esensi dan stasis darah dianggap sebagai patogenesis dasar DE. Oleh karena itu, strategi nutrisiginjaldan mengaktifkan darah umumnya digunakan dalam aplikasi klinis untuk DE. Studi sebelumnya dapat mengkonfirmasi bahwa modifikasi resep Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), resep yang bertujuan untuk menutrisiginjal, dapat meningkatkan gangguan kognitif dan melindungi neuron dengan mengurangi toksisitas A [10, 11]. Resep Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), di mana lintah ditambahkan berdasarkan MWP, diformulasikan secara khusus untukmemeliharaginjaldan mengaktifkan darah. Studi baru-baru ini menunjukkan bahwa resep BSHX dapat meningkatkan sindrom penurunan memori pasien DM, menunjukkan sifat neuroprotektif yang kuat [12]. Namun, mekanisme farmakologis rinci untuk BSHX masih belum jelas. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengamati efek perlindungan ekstrak BSHX pada sel PC12 yang diinduksi HG dan mengeksplorasi mekanisme molekuler potensial.

Metode

Bahan dan reagen

Semua herbal dibeli dari Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, China) dan disahkan oleh Dr. PF Tu, ahli farmakognostik, menurut Chinese Pharmacopoeia (Komisi Farmakope RRC, 2010). 3- [4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) berasal dari Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Kit uji laktat dehidrogenase (LDH) dibeli dari Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng. (Nanjing, Jiangsu, Tiongkok). Kit pewarnaan ganda Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) dan Hoechst 33258 diperoleh dari Solar Co., Ltd. (Beijing, China). Kit uji potensi membran mitokondria dengan JC-1, 2, 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) dibeli dari Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, China). Antibodi primer untuk caspase-3, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP, cytochrome C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK, dan -tubulin diperoleh dari Cell signaling Technology (Boston, MA, USA).

Persiapan ekstrak BSHX

BSHX terdiri dari tujuh komponen obat (Tabel 1). Untuk sediaan ekstrak BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) dan Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) dicampur dengan perbandingan 8:8:4:1:2:1:8 dan direndam dalam air suling dengan volume 10 kali (v/b) selama 30 menit , kemudian dididihkan selama 1 jam dan dididihkan lagi selama 1 jam dalam volume total 5 kali (v/b) air suling. Supernatan digabungkan dan dikeringkan dengan liofilisasi. Ekstrak kering akhir adalah 25 persen (b/b) dari berat herbal mentah dan spesimen voucher disimpan di Pusat Penelitian Modern untuk Pengobatan Tradisional Cina, Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Peking, Beijing, Cina.

Budaya sel

Tikus pheochromocytoma cell lines (PC12 cells) diperoleh dari Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, China) dan ditanam di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Beijing, China) ditambah dengan 10 persen serum janin sapi (Biowest, Prancis ) dan 1 persen Penicillin-Streptomycin (100×, Macgene, Beijing, China) dalam inkubator yang dilembabkan yang mengandung 95 persen udara dan 5 persen CO2 pada 37 derajat .

Perlakuan sampel

Dalam uji pendahuluan, sel PC12 diperlakukan dengan ekstrak BSHX (20, 50, 100 mg/L) saja selama 48 jam untuk mengevaluasi sitotoksisitas. Untuk analisis efek neuroprotektif ekstrak BSHX terhadap neurotoksisitas yang diinduksi glukosa (HG) tinggi, sel PC12 diobati bersama dengan ekstrak BSHX (20, 50, 100 mg/L) dan HG (75 mM) selama 48 jam, diikuti dengan uji MTT untuk viabilitas sel. Semua pengujian lainnya dilakukan dalam kondisi yang sama dengan kisaran konsentrasi ekstrak BSHX dari 20 hingga 100 mg/L.

Uji viabilitas sel

Sel PC12 diunggulkan ke dalam 96-piring sumur dengan kepadatan 3,5 × 103 sel per sumur. Setelah inkubasi dengan ekstrak BSHX (dengan atau tanpa HG) selama 48 jam, supernatan dibuang dan larutan MTT (0,5 mg/mL) ditambahkan. Setelah inkubasi pada suhu 37 derajat selama 4 jam, larutan MTT dihilangkan dan sel-sel dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) selama 5 menit dikocok. Densitas optik (OD) diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat mikro. Viabilitas sel ( persen )=[OD (pengobatan) – OD (kosong)]/ [OD (kontrol tanpa perlakuan) – OD (kosong)] × 100 persen .

uji LDH

Sel PC12 dikultur dan distimulasi untuk pengobatan ekstrak HG dan BSHX seperti yang dijelaskan sebelumnya. Kemudian, LDH yang dilepaskan dari sel dideteksi menggunakan kit LDH komersial sesuai dengan instruksi pabrik. Absorbansi diukur pada 450 nm. LDH (U/L)=[OD (perlakuan) – OD (kosong)] / [OD (standar) – OD (kosong)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Pewarnaan Hoechst 33258 dan pewarnaan AO/EB

Untuk pewarnaan Hoechst 33258, sel-sel difiksasi dengan paraformaldehida 4 persen selama 30 menit. Kemudian sel dicuci dengan Phosphate Buffer Saline (PBS) 3 kali dan diinkubasi dengan larutan kerja Hoechst 33258 (1 ug/mL) dalam gelap selama 30 menit pada suhu kamar. Gambar diambil menggunakan mikroskop fluoresensi (IX73, Olympus, Jepang) di bawah panjang gelombang eksitasi 352 nm/panjang gelombang emisi 461 nm. Untuk pewarnaan AO/EB, keluarkan media dari 96-pelat sumur dan tambahkan campuran AO/EB (campuran 100 ug/mL AO dan 100 ug/mL EB) selama 5 menit dalam gelap pada suhu kamar. Kemudian sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali. Sel-sel divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi di bawah panjang gelombang eksitasi 490 nm/panjang gelombang emisi 530 nm untuk pewarnaan AO dan panjang gelombang eksitasi 520 nm/panjang gelombang emisi 590 nm untuk pewarnaan EB.

Deteksi ROS intraseluler

Untuk deteksi ROS intraseluler, sel PC12 diunggulkan ke dalam 6-pelat sumur dengan kepadatan 5 × 105 dan dikenai perlakuan ekstrak HG dan BSHX selama 24 jam. Setelah inkubasi 24 jam, sel PC12 dicuci dengan media elang modifikasi Dulbecco bebas serum selama 3 kali dan ditambahkan ke 10μΜ 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), yang dioksidasi menjadi fluorescent 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF) oleh hidroperoksida, pada 37 derajat selama 30 menit dalam gelap. Kemudian, sel dicuci dengan PBS dingin sebanyak 3 kali dan disuspensikan kembali dalam PBS. Tingkat intraseluler ROS dideteksi dengan mengukur intensitas fluoresensi rata-rata dengan flow cytometry (BD FACSCaliburTM, USA). Panjang gelombang eksitasi/emisi berada pada 488/525 nm. Minimal 10,000 peristiwa dihitung per sampel. Nilai dinyatakan sebagai absorbansi rata-rata yang dinormalisasi ke persentase nilai kontrol.

Uji potensial membran mitokondria

Depolarisasi mitokondria dinilai menggunakan kit uji JC-1 komersial. Setelah diperlakukan dengan ekstrak HG dan BSHX, sel diinkubasi dengan larutan kerja JC-1 (1 ×) pada suhu 37 derajat selama 15 menit dalam gelap. Kemudian, buang supernatannya dan cuci sel 2 kali dengan larutan buffer JC-1 (1 ×). Sel-sel divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi di bawah panjang gelombang eksitasi 460 nm/panjang gelombang emisi 530 nm untuk monomer JC-1 (terdeteksi dalam sel dengan mitokondria terdepolarisasi), dan panjang gelombang eksitasi 520 nm/panjang gelombang emisi 590 nm untuk JC{{13 }} polimer (ada dalam mitokondria terpolarisasi). Sel-sel dengan fluoresensi hijau (monomer) dianggap memiliki mitokondria yang terdepolarisasi; sel-sel dengan fluoresensi merah (polimer) dianggap memiliki mitokondria normal.

Analisis Western blot

Sel PC12 dikumpulkan dan dilisiskan dalam buffer RIPA dingin dengan inhibitor protease koktail 1x. Supernatan dikumpulkan dengan sentrifugasi kecepatan tinggi pada 12,000 rpm selama 10 menit pada 4 derajat. Konsentrasi protein ditentukan dengan uji Bradford. Fraksi yang diperkaya sitosol dan mitokondria diisolasi dengan Kit Isolasi Mitokondria (Pierce, Rockford, USA) untuk analisis sitokrom c. Untuk protein lain, lisat sel total dipisahkan oleh SDS-PAGE (10 persen -15 persen ) dan dipindahkan ke membran Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Membran polivinilidena fluorida kemudian diblokir dengan 5 persen susu tanpa lemak dan diinkubasi dengan antibodi primer yang ditunjukkan pada suhu 4 derajat selama semalam. Membran dicuci dengan PBST (fosfat buffer saline, 0,1 persen Tween 20) tiga kali dan diinkubasi dengan antibodi sekunder pada suhu kamar selama 2 jam. Kemudian, membran dicuci dengan PBST tiga kali lagi dan divisualisasikan menggunakan substrat chemiluminescent yang disempurnakan, dan dipindai dengan Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

Analisis statistik

Semua nilai dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Signifikansi perbedaan antara nilai rata-rata ditentukan oleh analisis varians satu arah (ANOVA) menggunakan Paket Statistik untuk Ilmu Sosial (perangkat lunak SPSS 16.0). P < 0.05="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" kontrol="" dianggap="" signifikan="" secara="">

Hasil

Ekstrak BSHX melindungi sel PC12 terhadap cedera sel yang diinduksi HG

Untuk menyelidiki apakah ekstrak BSHX dapat melindungi sel PC12 dari gangguan HG, kami memperlakukan sel PC12 dengan kisaran konsentrasi ekstrak BSHX (20, 50, dan 100 mg/L) selama 48 jam dalam kondisi HG (75 mM). Menilai viabilitas sel menggunakan uji MTT menunjukkan bahwa penghinaan HG menyebabkan penurunan signifikan dalam viabilitas sel PC12 (viabilitas sel sekitar 56,9 ± 6,7 persen) dan bahwa pengobatan ekstrak BSHX secara signifikan mencegah kematian sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Viabilitas sel meningkat menjadi 87,8 ± 9,2 persen ketika sel-sel diperlakukan bersama dengan ekstrak BSHX (100 mg/L) (Gambar.1A). Laktat Dehidrogenase (LDH) dilepaskan dari sel yang rusak dan oleh karena itu juga dapat digunakan sebagai indikator toksisitas sel. Konsisten dengan hasil uji MTT, kami menemukan bahwa gangguan HG secara signifikan meningkatkan pelepasan LDH dari sel PC12 dan bahwa pengobatan ekstrak BSHX mencegah pelepasan LDH dengan cara yang bergantung pada konsentrasi (Gambar 1B), Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak BSHX meningkatkan viabilitas sel dalam sel PC12 yang diinduksi HG.

Ekstrak BSHX menghambat apoptosis sel PC12 melalui jalur yang bergantung pada caspase-9/3-

Untuk menentukan pengaruh ekstrak BSHX pada apoptosis sel, kami menggunakan pewarna DNA Hoechst 33258 sebagai uji sensitif untuk apoptosis. Inti sel normal yang diwarnai dengan Hoechst 33258 menunjukkan fluoresensi biru seragam, sedangkan sel apoptosis yang piknosis awan kromatin inti menunjukkan partikel fluoresen hiperkromatik dan padat. Persentase apoptosis dihitung menurut jumlah sel apoptosis vs jumlah total sel. Data kami mengungkapkan bahwa penghinaan HG (75 mM) secara dramatis meningkatkan proporsi sel apoptosis (51,7 ± 4,3 persen) dan pengobatan ekstrak BSHX secara signifikan melindungi terhadap apoptosis yang diinduksi HG dalam sel PC12 (Gambar.2A). Hasil ini selanjutnya didukung oleh analisis pewarnaan ganda AO/EB. AO memasuki sel normal dan apoptosis dan memancarkan fluoresensi hijau sedangkan EB hanya memasuki sel apoptosis dan memancarkan fluoresensi merah [13]. Uji AO/EB menunjukkan bahwa persentase sel apoptosis meningkat secara signifikan setelah gangguan HG (75 mM) (47,8.7 ± 2,6 persen) dan menurun pada pengobatan ekstrak BSHX pada sel PC12 (Gambar.2B), menunjukkan bahwa ekstrak BSHX dapat secara efektif menghambat apoptosis sel PC12 yang diinduksi oleh HG.

Kemudian, kami menyelidiki efek ekstrak BSHX pada jalur caspase-3/PARP, jalur penting untuk apoptosis terkait mitokondria [14]. Western blot mengungkapkan bahwa penghinaan HG (75 mM) secara signifikan meningkatkan ekspresi bentuk aktif caspase-3 dan PARP dan menurunkan ekspresi total caspase-3 dan PARP dalam sel PC12, dan efek ini secara nyata terbalik oleh pengobatan ekstrak BSHX (Gambar.2C), menunjukkan bahwa ekstrak BSHX secara efektif melindungi sel PC12 terhadap apoptosis melalui regulasi jalur caspase yang bergantung pada mitokondria-3/PARP.

Ekstrak BSHX menghambat produksi ROS intraseluler dalam sel PC12 yang diinduksi HG

Karena HG dapat meningkatkan pembentukan ROS intraseluler [15], kami menguji tingkat ROS intraseluler untuk menentukan apakah ekstrak BSHX dapat menghambat pembentukan ROS. Ada peningkatan 3,23-kali lipat dalam intensitas fluoresensi rata-rata yang diamati pada sel PC12 yang terpapar 75 mM HG selama 48 jam dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya, pengobatan bersama dengan ekstrak BSHX secara signifikan menurunkan intensitas fluoresensi rata-rata menjadi sekitar 0.76-, 0.{{10}}, dan 0.{ {12}}kali lipat dari kelompok model, masing-masing, menunjukkan bahwa ekstrak BSHX dapat menghambat produksi ROS yang diinduksi oleh HG (Gambar.3A, B).

Ekstrak BSHX mempertahankan homeostasis mitokondria dalam sel PC12 yang diinduksi HG dengan mengatur ekspresi Bax dan Bcl-2

Potensi membran mitokondria merupakan parameter penting dari fungsi mitokondria yang digunakan sebagai indikator kesehatan sel. JC-1 adalah pewarna kationik lipofilik yang dapat secara selektif masuk ke dalam mitokondria dan secara reversibel berubah warna dari hijau menjadi merah saat potensial membran meningkat. Dalam sel sehat dengan potensi membran mitokondria tinggi, JC-1 secara spontan membentuk kompleks yang dikenal sebagai agregat-J dengan fluoresensi merah intens. Di sisi lain, dalam sel apoptosis dengan potensial membran mitokondria rendah, JC-1 tetap dalam bentuk monomer, yang hanya menunjukkan fluoresensi hijau [16, 17]. Rasio fluoresensi hijau dengan fluoresensi merah karenanya dapat mencerminkan depolarisasi mitokondria. Dalam penelitian kami, jumlah sel dengan mitokondria terdepolarisasi (fluoresensi hijau) meningkat secara signifikan setelah HG (75 mM) selama 48 jam, dan peningkatan ini dibalikkan oleh perlakuan ekstrak BSHX dengan cara yang bergantung pada konsentrasi (Gambar.4A).

Kami selanjutnya mendeteksi distribusi mitokondria dan sitoplasma sitokrom c, pemain kunci dalam jalur apoptosis yang bergantung pada aktivasi caspase. Kami menemukan bahwa penghinaan HG (75 mM) selama 48 jam menginduksi translokasi dramatis sitokrom c dari mitokondria ke sitoplasma, dan relokasi ini secara signifikan dicegah dengan pengobatan ekstrak BSHX (Gambar.4B), menunjukkan bahwa ekstrak BSHX dapat menghambat pelepasan sitokrom c dari mitokondria.

Lebih lanjut, protein keluarga Bcl-2 adalah pengatur penting dari berbagai jalur apoptosis. Bcl-2 dapat menghambat apoptosis sel yang disebabkan oleh berbagai faktor sitotoksik dan merupakan penghambat pelepasan sitokrom c dari mitokondria ke sitoplasma. Namun, Bax, sebagai anggota keluarga Bcl-2, merupakan faktor pro-apoptosis. Ketika apoptosis diinduksi, Bax bermigrasi dari sitoplasma ke mitokondria dan menghancurkan integritas mitokondria [5, 18]. Dalam penelitian kami, tingkat protein Bcl-2 diturunkan regulasinya dan Bax diregulasi oleh HG (75 mM) selama 48 jam, efek ini bergantung pada konsentrasi dibalik oleh ekstrak BSHX (Gambar.4C). Semua hasil di atas menunjukkan bahwa ekstrak BSHX melindungi sel PC12 terhadap depolarisasi mitokondria yang diinduksi HG dengan mengatur ekspresi Bax dan Bcl-2.

Pengaruh ekstrak BSHX pada apoptosis sel melalui jalur pensinyalan JNK/p38 MAPK

Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa peningkatan produksi ROS telah dikaitkan dengan aktivasi jalur MAPK, untuk memicu apoptosis sel9 [19, 20]. Jadi kami menyelidiki efek ekstrak BSHX pada jalur pensinyalan Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) untuk menentukan apakah ekstrak BSHX dapat melemahkan apoptosis yang diinduksi HG. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, penghinaan HG (75 mM) selama 48 jam meningkatkan fosforilasi c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) dan p38 dalam sel PC12, yang secara signifikan dihambat oleh ekstrak BSHX dalam konsentrasi- cara tergantung. Namun, hasil serupa tidak diamati dengan MAPK Extracellular Regulated Protein Kinase (ERK). Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak BSHX dapat menghambat apoptosis sel yang diinduksi HG melalui jalur pensinyalan JNK/p38 MAPK.

Diskusi

Ensefalopati diabetik (DE) adalah komplikasi umum dari diabetes mellitus tipe 2 (T2DM). Hal ini dapat menyebabkan gangguan kognitif otak dan merupakan faktor risiko penting kematian dan kecacatan pada pasien diabetes mellitus tipe 2 di seluruh dunia [3]. Dengan demikian, sangat penting untuk mempelajari mekanisme DE serta strategi pencegahan dan pengobatannya.

Di Cina, obat-obatan tradisional Cina (TCM) telah digunakan untuk pengobatan DM selama bertahun-tahun dan telah menunjukkan efek kuratif. Beberapa studi klinis menunjukkan bahwa TCM berdasarkan ginjal bergizi dan mengaktifkan strategi darah dapat menurunkan regulasi glukosa darah, meningkatkan sirkulasi, dan meningkatkan disfungsi kognitif otak. Resep BSHX adalah perwakilan dari TCM ini. Studi klinis awal kami menunjukkan bahwa resep BSHX dapat secara efektif memperbaiki glukosa darah, homosistein (HCY), dan protein C-reaktif sensitivitas tinggi (hs-CPR) dalam serum, dan meningkatkan fungsi kognitif pasien diabetes dengan gangguan kognitif ringan (MCI) [12]. Namun, ada kekurangan bukti untuk membuktikan efisiensi dan mekanisme farmakologis sejauh ini.

Dalam penelitian ini, kami menemukan ekstrak BSHX dapat melemahkan pengurangan viabilitas sel yang disebabkan oleh HG, yang diukur dengan uji MTT, LDH. Untuk mengeksplorasi lebih lanjut efek perlindungan ekstrak BSHX pada viabilitas sel, kami mempelajari apoptosis dengan analisis pewarnaan Hoechst 33258 dan AO/EB. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak BSHX secara signifikan dapat menurunkan apoptosis yang diinduksi oleh HG. Sebagai penanda apoptosis, caspase-3 dan PARP meningkat secara signifikan setelah pengobatan dengan HG tetapi aktivasi faktor pro-apoptosis ini dihambat oleh ekstrak BSHX dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Hasil di atas menunjukkan bahwa ekstrak BSHX memiliki efek perlindungan pada kerusakan sel PC12 yang disebabkan oleh HG.

ROS terbentuk selama proses fosforilasi oksidatif sel, dan peningkatan produksinya atau kerusakan sistem antioksidan dapat menyebabkan stres oksidatif pada sel [21]. Studi telah menunjukkan bahwa glukosa tinggi dapat menimbulkan akumulasi ROS intraseluler dan akhirnya jalur sinyal apoptosis aktif. Dan mekanisme umum komplikasi diabetes adalah stres oksidatif [22, 23]. Hasil kami menunjukkan bahwa glukosa yang tinggi dapat menyebabkan peningkatan ROS pada sel PC12, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya [24]. Diperkirakan bahwa toksisitas glukosa tinggi ke sel dapat dicapai melalui apoptosis yang diinduksi ROS. Mitokondria adalah situs utama produksi ROS intraseluler dan organ target utama untuk serangan ROS juga [25]. Dalam kondisi patologis, peningkatan ROS yang cepat dapat mengakibatkan disfungsi mitokondria, potensial membran mitokondria runtuh dan akhirnya menyebabkan apoptosis sel [26]. Jadi kami mendeteksi integritas mitokondria. Hasil kami menunjukkan bahwa glukosa yang tinggi secara signifikan menurunkan potensi membran mitokondria, meningkatkan rasio Bax/Bcl-2 yang mengontrol peralihan pori transisi permeabilitas mitokondria (MPTP), dan mendorong kebocoran sitokrom c, sedangkan ekstrak BSHX dapat membalikkan perubahan ini. Ini menunjukkan bahwa neuroprotektif ekstrak BSHX terhadap sel PC12 yang diinduksi HG dapat dihasilkan dari pemeliharaan integritas mitokondria.

Jalur pensinyalan MAPK juga memainkan peran penting dalam apoptosis sel. JNK, ERK, dan p38 MAPK adalah anggota keluarga MAPK yang paling banyak dipelajari. Cara kerja utama mereka adalah memfosforilasi situs spesifik mereka, sehingga mengatur apoptosis sel [8, 27, 28]. Selain itu, penelitian telah menunjukkan bahwa produksi ROS yang berlebihan dapat memicu fosforilasi p38MAPK [29-31], dan ROS dapat menginduksi atau memediasi aktivasi jalur MAPK [32]. Beberapa rangsangan seluler yang menginduksi produksi ROS juga secara paralel dapat mengaktifkan jalur MAPK di beberapa jenis sel [32, 33]. Mekanisme potensial untuk aktivasi MAPK oleh ROS mungkin termasuk inaktivasi dan degradasi fosfatase MAPK yang mempertahankan jalur dalam keadaan tidak aktif [19]. Di sisi lain, untuk mengkonfirmasi lebih lanjut apakah jalur MAPK diaktifkan oleh generasi ROS, sel-sel diperlakukan sebelumnya dengan antioksidan (misalnya NAC, pemulung ROS) untuk mencegah akumulasi ROS. Dan hasilnya menunjukkan bahwa aktivasi MAPK hampir terhambat setelah stimulasi sel dengan rangsangan seluler [32, 33], menunjukkan keterlibatan inaktivasi ROS dari jalur MAPK. Selain itu, penelitian menunjukkan bahwa ketika sel diobati dengan inhibitor JNK SP600125 spesifik, apoptosis yang diinduksi oleh Cardiotoxin III dapat diblokir [34]. Penelitian kami sebelumnya menemukan bahwa modifikasi resep Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) dapat menghambat aktivasi ERK/p38 MAPK dalam mikroglia BV2 yang diaktifkan A [10]. Namun, dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ekstrak BSHX dapat menghambat fosforilasi JNK dan p38 MAPK dan kami tidak mencapai hasil yang sama dengan p-ERK. Kami berspekulasi bahwa lintah memainkan peran yang berbeda dalam ekstrak BSHX. Hasilnya menunjukkan bahwa mekanisme perlindungan lain dari ekstrak BSHX terhadap apoptosis pada sel PC12 yang diinduksi HG mungkin melalui regulasi jalur pensinyalan JNK/p38 MAPK.

Kesimpulan

Ekstrak BSHX, formula poliherbal, menunjukkan efek neuroprotektif pada sel PC12 terhadap penghinaan HG. Ekstrak BSHX secara efektif menghambat apoptosis sel PC12 yang diinduksi HG melalui penurunan generasi ROS intraseluler, menjaga integritas membran mitokondria, dan memblokir jalur pensinyalan caspase-3 dan JNK/p38 MAPK (Gambar 6). Secara kolektif, temuan kami menunjukkan bahwa ekstrak BSHX adalah agen yang menjanjikan untuk pengobatan DE dalam aplikasi klinis.

Kontribusi penulis

Menyusun dan merancang eksperimen: Zeng KW, Wang XM. Melakukan percobaan: Zhao SY. Menganalisis data: Zhao SY, Zeng KW, dan Wang XM. Reagen/bahan/alat analisis yang dikontribusikan: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW, dan Wang XM. Menulis ayahnya: Zhao SY.

Referensi

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, dkk. Otak diabetes dan kognisi. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamid SA. Cedera otak dengan diabetes mellitus: bukti, mekanisme dan implikasi pengobatan. Pakar Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, dkk. Teori "Memori Metabolik" dan Pengobatan Dini Hiperglikemia dalam Pencegahan Komplikasi Diabetes. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Potensi membran mitokondria (Δψm) dalam apoptosis; Sebuah pembaharuan. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Menghubungkan dinamika mitokondria dan peristiwa hidup atau mati melalui protein keluarga Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, dkk. Mitokondria dan kematian sel. Aspek mekanistik dan masalah metodologis. Februari J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, dkk. 1,25-(OH)2D3 menghambat apoptosis yang diinduksi glukosa tinggi dan produksi ROS dalam sel mesotel peritoneum manusia melalui jalur MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, dkk. Pretreatment faktor pertumbuhan saraf melemahkan oksigen dan kekurangan glukosa yang diinduksi c-Jun amino-terminal kinase 1 dan kinase p38 dan p38 yang diaktifkan oleh stres dan memberikan perlindungan saraf dalam model pheochromocytoma PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, dkk. Keterlibatan caspase-3 dan p38 mitogen-activated protein kinase dalam apoptosis yang diinduksi kobalt klorida dalam sel PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Lagu FJ, Chen JF, dkk. Efek Antineuroinflamasi dari Resep Wu-Zi-Yan-Zong yang Dimodifikasi dalam Mikroglia BV2 Terstimulasi -Amyloid melalui Jalur Pensinyalan NF-κB dan ERK/p38 MAPK. Kompl Berbasis Bukti Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, dkk. Resep Wu-Zi-Yan-Zong yang dimodifikasi, formula poliherbal tradisional Tiongkok, menekan proses peradangan saraf yang diinduksi lipopolisakarida pada astrosit tikus melalui jalur pensinyalan NF-κB dan JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, dkk. Pengaruh Resep Bushen Huoxue pada Pengobatan Gangguan Kognisi Ringan Diabetes Tipe 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popovi S, Risti P, dkk. Analisis apoptosis yang diinduksi cycloheximide pada leukosit manusia: Mikroskop fluoresensi menggunakan annexin V/propidium iodide versus acridine orange/ethidium bromide. Biol Sel. Pada tahun 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, dkk. Caspases Menghubungkan Sinyal Kematian Sel dengan Homeostasis Organisme. Kekebalan 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nitric oxide: faktor kunci di balik disfungsi sel progenitor endotel pada tipe diabetes mellitus-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, dkk. JC-1: Panjang gelombang eksitasi alternatif memfasilitasi sitometri potensial membran mitokondria. Kematian Sel Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, dkk. Probe potensial membran mitokondria dan gradien proton: panduan penggunaan praktis. Biotek 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Bagaimana protein BCL-2 menginduksi permeabilisasi membran luar mitokondria? Tren Sel Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, dkk. Protein kinase yang diaktifkan oleh mitogen dan spesies oksigen reaktif: bagaimana ROS dapat mengaktifkan jalur MAPK? Transduksi Sinyal J 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, dkk. Ester heterosiklik aromatik dari podophyllotoxin mengerahkan aktivitas anti-MDR dalam sel leukemia K562/ADR manusia melalui jalur pensinyalan ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, AR Putih, Koistinaho J, dkk. Menargetkan Glikogen Sintase Kinase-3 untuk Manfaat Terapi terhadap Stres Oksidatif pada Penyakit Alzheimer: Keterlibatan Jalur Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, dkk. Peran Stres Oksidatif pada Neuropati Diabetik: Pembangkitan Spesies Radikal Bebas dalam Reaksi Glikasi dan Polimorfisme Gen Pengkodean Enzim Antioksidan terhadap Kerentanan Genetik Neuropati Diabetik pada Populasi Pasien Diabetes Tipe I. Biokimia Sel Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, dkk. Kematian sel, spesies oksigen reaktif (ROS) dan komplikasi diabetes. Kematian Sel Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, dkk. Ginkgolide B menghambat apoptosis pada sel endotel vena umbilikalis manusia yang distimulasi glukosa tinggi. Buletin Farmakologi Tiongkok 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, dkk. Peran Merusak Superoksida Dismutase di Ruang Intermembran Mitokondria. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Lantai KB. Protein kinase yang diaktifkan mitogen: jalur pensinyalan baru yang berfungsi dalam respons seluler terhadap stres lingkungan. J Exp Bio 2003, 206:1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, dkk. MiR-125b bertindak sebagai onkogen dalam sel glioblastoma dan menghambat apoptosis sel melalui jalur p53 dan p38MAPK-independen. Brit J Kanker 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, dkk. Produk akhir glikasi lanjutan menginduksi apoptosis sel epitel kornea manusia melalui generasi spesies oksigen reaktif dan aktivasi jalur JNK dan p38 MAPK. Plus Satu 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, dkk. Ghrelin menghambat apoptosis pada sel neuron hipotalamus selama kekurangan oksigen-glukosa. Endokrinologi 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A mengubah protein pengatur siklus sel dan menginduksi apoptosis melalui aktivasi p38MAPK yang bergantung pada spesies oksigen reaktif dalam lini sel kanker payudara manusia MCF-7. Biologi Tumor 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, dkk. Cedera Oksidatif yang diinduksi ROS yang terlibat dalam Patogenesis Keratitis Jamur melalui Aktivasi p38 MAPK. Rep Sci 2017, 7: 10421.

32. McCubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Aktivasi yang diinduksi spesies oksigen reaktif dari jalur pensinyalan MAP kinase. Sinyal Redoks Antioksidan 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Pensinyalan redoks dan jalur MAP kinase. Biofaktor 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxin III menginduksi apoptosis c-jun N-terminal kinase-dependent di HL-60 sel leukemia manusia. Fungsi Biokimia Sel 2008, 26: 111-118.