Jalur Molekuler Terkait Dengan Promosi Umur Panjang Dan Peningkatan Kognitif Cistanche Tubulosa di Drosophila

untuk informasi lebih lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Wei-Yong Lin dkk

Abstrak:

Latar belakang:Proses penuaan, termasuk disfungsi fisik dan gangguan memori terkait usia (AMI), dianggap berkorelasi dengan kerusakan oksidatif kumulatif dan jalur pensinyalan insulin/IGF-1. Tujuan: Penelitian ini adalah untuk menjelaskan in vivo efek pada penundaan penuaan dan perbaikan AMI dan mekanisme molekuler yang mendasariCistanche tubulosa(CT), ramuan yang digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok untuk meningkatkan fungsi seksual dan mengobati disfungsi ginjal

Metode:Lalat, dirawat dan tidak diobati dengan CT(Cistanche tubulosa), diamati untuk umur, ketahanan terhadap stres oksidatif dengan H2O2 atau paraquat, uji kelaparan, perilaku kognitif dengan T-maze, dan tingkat transkrip gen target dengan RT-PCR kuantitatif.

Hasil:Mengelola CT(Cistanche tubulosa)memperpanjang umur rata-rata dan maksimum dan meningkatkan resistensi terhadap stres oksidatif pada lalat. CT(Cistanche tubulosa)suplementasi juga meningkatkan pembentukan memori pada lalat muda dan menekan penuaan AMI. Beberapa gen dan jalur pensinyalan, termasuk target mekanistik rapamycin (mTOR) dan jaringan Notch, telah diidentifikasi sebagai penyebab efek farmakologis ini dan perubahan ekspresi gen reseptor glutamat.

Kesimpulan:Hasil kami menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)suplementasi dapat berkontribusi untuk memperlambat penuaan fenotipe dan mengurangi penurunan kognitif-perilaku pada lalat, menunjukkan penerapan potensial untuk meningkatkan kesehatan manusia dan mengurangi kerentanan terhadap gangguan yang berkaitan dengan usia.

Kata kunci:penuaan,Cistanche tubulosa,Perilaku kognitif, Herb

Klik untuk produk batang Cistanche

pengantar

Seiring bertambahnya populasi usia lanjut di seluruh dunia, memfasilitasi kesehatan dan umur panjang merupakan masalah kesehatan masyarakat yang semakin penting bagi sains, masyarakat, dan bidang perawatan medis. Proses penuaan telah diusulkan sebagai dikendalikan oleh mekanisme yang kompleks, didorong oleh interaksi yang luas dari faktor genetik dan lingkungan. Karena kerusakan bertahap pada tingkat sel dan jaringan, usia merupakan faktor risiko dan sangat berkorelasi dengan kerentanan terhadap penyakit kronis seperti kanker serta penyakit kardiovaskular dan neurodegeneratif (Kenyon, 2005). Penuaan juga mengurangi aktivitas sinaptik, sintesis protein baru, dan fungsi kognitif. Perubahan fungsional ini berkontribusi pada gangguan memori terkait usia (AMI) (Burke dan Barnes, 2010; Schimanski dan Barnes, 2010). Oleh karena itu, mengembangkan obat untuk menunda patologi terkait usia dan penuaan kognitif mungkin bermanfaat bagi kualitas hidup manusia. Dalam penelitian ini, kami menggunakan Drosophila melanogaster, yang merupakan organisme ideal untuk studi penuaan in vivo karena umurnya yang pendek, untuk mengevaluasi kemanjuran obat dan mengeksplorasi mekanisme molekuler yang mendasari perbaikan penuaan dan AMI.

jamucistanche, juga dikenal dengan nama Cina Rou CongRong, adalah tanaman parasit yang terutama didistribusikan di gurun Cina Barat Laut. Dua spesies Cistanche, Cistanche deserticolaY. C.Ma danBentengtubulosa(Schrenk) Wight termasuk dalam Chinese Pharmacopoeia (edisi 2005) karena bahan kimia dan aktivitas farmakologinya yang serupa. Ekstrak batangnya telah digunakan secara luas selama ribuan tahun sebagai obat tonik, terutama untuk mengobati berbagai gejala, termasuk fungsi ginjal yang kurang, impotensi, infertilitas, dan untuk memfasilitasi katarsis, seperti yang dijelaskan dalam buku-buku kedokteran Tiongkok kuno. Banyak konstituen kimia, termasuk minyak esensial, glikosida fenilethanoid (PhGs), iridoid, lignan, dan sakarida, telah diisolasi dariBentengspesies, dan dua komponen PhG utama, acteoside, andechinacoside biasanya dipilih sebagai penanda untuk evaluasi kualitas Herba cistanche karena tindakan farmakologisnya yang signifikan (Wang et al., 2012).

Cistanche tubulosaEkstrak (CT) memiliki berbagai fungsi biologis yang meliputi modulasi aktivitas kekebalan tubuh, meningkatkan fungsi seksual, meningkatkan pertumbuhan rambut, dan manfaat lain pada antioksidan, hepatoprotektor, aktivitas antiosteoporosis, dan anti-tumor (Li et al., 2016; Seok et al., 2015). ; Wang dkk., 2012). Selain itu, penelitian in vitro, mengungkapkan bahwa Herbalcistancheekstrak dapat melindungi neuron mirip dopamin dari H2O2-yang diinduksi kerusakan oksidatif dan secara signifikan meningkatkan tingkat faktor pertumbuhan saraf dan faktor neurotropik yang diturunkan dari otak (Lin et al., 2013). Echincoside mencegah kematian neuron dopamin pada model tikus dengan lesi MPTP dari penyakit Parkinson (Zhao et al., 2010). Selain itu, CT(Cistanche tubulosa)ekstrak memperbaiki disfungsi kognitif melalui penurunan deposisi amiloid dan meningkatkan kadar asetilkolin dan dopamin pada model tikus penyakit Alzheimer (AD) (Wu et al., 2014). Meskipun efek terapi Herbacistanchemasih diperlukan untuk mengkonfirmasi, ukuran kecil, uji klinis non-plasebo-terkontrol pada CT(Cistanche tubulosa)ekstrak glikosida menunjukkan bahwa obat tersebut memiliki potensi untuk mengobati pasien dengan DA ringan sampai sedang dan dengan efek samping yang relatif ringan, bahkan setelah pemberian jangka panjang (Guo et al., 2013). Data ini menunjukkan bahwa ekstrak glikosida dalam Herbalcistanchememiliki efek neuroprotektif dan anti-demensia. Meskipun berbagai manfaat CT(Cistanche tubulosa), mekanisme molekuler dan efeknya pada penundaan penuaan dan perbaikan AMI belum dijelaskan. Dalam penelitian ini, efek CT(Cistanche tubulosa)pada perpanjangan umur yang signifikan meningkatkan resistensi terhadap stres lingkungan, dan disfungsi kognitif terkait usia yang ditekan diperiksa untuk menentukan kemungkinan utilitas klinis CT(Cistanche tubulosa)dalam memperlambat proses penuaan.

Bahan dan metode

Obat alami

Identifikasi asalCistanche tubulosa(Schrenk) Wight(Orobanchaceae) (CT) telah diverifikasi di Ko Da PharmaceuticalCo. Ltd. (Taoyuan, Taiwan), di mana spesimen voucher (10.603.205) telah disimpan dan obat herbal konsentrat CT diproduksi. Secara singkat, batang CT yang berdaging kering diekstraksi dalam 12-lipat air matang selama 1 jam diikuti dengan penyaringan. Filtrat dikumpulkan dan dimasukkan ke vakum dan konsentrasi tekanan rendah selama 1 jam untuk mendapatkan ekstrak. Ekstrak CT dicampur dengan pati dengan perbandingan 1:1 (b/b) dan dilakukan granulasi semprot untuk mendapatkan bubuk CT.

Pemeliharaan stok terbang dan pengukuran umur

Garis lalat tipe liar yang digunakan dalam penelitian ini adalah dari CantonS, diperoleh dari Bloomington Drosophila Stock Center. Lalat dibesarkan dan dipelihara dalam media standar tepung jagung pada 25 derajat dalam kelembaban relatif 50–60 persen di bawah siklus terang-gelap 12-h. Lalat dewasa yang muncul dikumpulkan dalam waktu 24 jam dan dipisahkan berdasarkan jenis kelamin. Dari awal dewasa, lalat dilengkapi dengan CT. CT(Cistanche tubulosa)bubuk dilarutkan dalam air dan ditambahkan ke media tepung jagung pada konsentrasi 5,4,10,8, dan 21,6 mg/ml, yang sebanding dengan dosis harian efektif untuk pemberian oral manusia. Dalam analisis umur, dua puluh hingga tiga puluh lalat dibesarkan dalam botol makanan dengan atau tanpa CT(Cistanche tubulosa); setidaknya 250 lalat dilakukan untuk setiap perlakuan. Botol makanan diganti setiap 3 hingga 4 hari, dan lalat mati dihitung pada saat itu

Tes ketahanan stres

Lalat dewasa dikumpulkan, dan kemudian diberi perlakuan awal dengan diet kontrol tanpa CT(Cistanche tubulosa)dan diet eksperimental yang dilengkapi dengan 5.4, 10.8, dan 21.6 mg/ml CT selama 20 hari pada 25 derajat. Untuk analisis kelaparan, lalat disimpan dalam botol dengan kertas basah saja dan dievaluasi staminanya terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh kelaparan. Untuk uji stres oksidatif, lalat dipindahkan ke vial bebas makanan yang berisi kertas saring dengan hidrogen peroksida (H2O2) (Sigma Aldrich) dalam larutan glukosa 5 persen untuk mengukur resistensi lalat terhadap H2O2-radikal hidroksil yang diinduksi (OH ) stres. Demikian pula, lalat dipindahkan ke botol berisi kertas saring jenuh dengan 10 mM paraquat (Sigma-Aldrich), yang menghasilkan anion superoksida (O2 ) yang menyebabkan kerusakan oksidatif pada hewan. Lalat dinilai untuk kematian setidaknya tiga kali sehari sampai semuanya mati. Setidaknya 250 lalat per perlakuan dilakukan. Untuk memanjat seperti katakanlah, lalat yang terpapar paraquat selama 0 dan 16 jam ditempatkan dalam botol plastik dan disadap dengan lembut ke bawah. Jumlah lalat di bagian atas botol dihitung setelah 18 detik memanjat.

Penilaian fekunditas

Baik jantan dan betina perawan diberi makan 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)selama 20 hari menjabat sebagai kelompok eksperimen. Sepuluh betina percobaan dikawinkan dengan pejantan perawan dalam jumlah yang sama, yang berumur 9-hari dan belum menerima CT. Demikian pula, jantan eksperimental dikawinkan dengan betina perawan dalam kondisi yang sama. Lalat betina yang dikawinkan kemudian dipindahkan ke vial baru untuk bertelur selama 24 jam, dan total telur yang diletakkan di dalam vial dihitung secara manual. Indeks fekunditas dihitung sebagai rata-rata produksi telur harian per betina. Setidaknya lima botol per perawatan dilakukan, dan total lalat n=50-80.

Pembelajaran asosiatif penciuman dan memori

Lalat dikumpulkan setelah eclosion dan pra-perawatan dengan 5,4, 10,8, dan 21,6 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)menjabat sebagai kelompok eksperimen, dan lalat kontrol belum menerima CT(Cistanche tubulosa)selama 5 dan 20 hari pada 25 derajat . Sebuah percobaan pelatihan tunggal dilakukan menurut penelitian sebelumnya (Dubnau et al., 2001). Secara singkat, sekitar 100 lalat terpapar secara berurutan pada dua bau, baik 3-oktanol (OCT, Sigma-Aldrich) atau4-metil sikloheksanol (MCH, Sigma-Aldrich). Lalat yang terkena bau pertama (stimulus terkondisi, CS plus ) dipasangkan dengan kejutan listrik 80 V dan kemudian menerima bau kedua (CS-) tanpa kejutan. Kemampuan belajar ditentukan segera setelah pelatihan dan kemampuan 3- dan {{ 12}}h memori telah melakukan prosedur pengujian setelah pelatihan selama 3 dan 24 jam, masing-masing. Untuk melakukan tes, lalat yang terlatih dijebak ke dalam titik pilihan T-maze di mana mereka terpapar OCT dan MCH secara bersamaan. Indeks kinerja (PI) dihitung untuk mewakili penghindaran bau yang dikondisikan. PI nol menunjukkan distribusi 50:50, dan API 100 menunjukkan distribusi 0,100 jauh dari CS plus bau.

Pengukuran tingkat transkrip melalui PCR kuantitatif real-time (qPCR)

Lalat dikumpulkan setelah eclosion dan pra-perawatan dengan 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)selama 20 hari pada 25 derajat menjabat sebagai kelompok eksperimen, dan lalat kontrol tidak menerima CT. Total RNA diekstraksi menggunakan RNeasy Mini kit (Qiagen), dan cDNA disintesis dari RNA total melalui reaksi reverse transcription dengan menggunakan High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Thermo Fisher Scientific). Tingkat transkrip gen target diukur melalui reaksi berantai polimerase kuantitatif waktu nyata (Sistem PCR Waktu Nyata ViiATM 7 Terapan) dengan menggunakan FastStart SYBR Green Master (Roche) sesuai dengan instruksi pabrik. Kelimpahan transkrip relatif dinormalisasi menggunakan metode ambang siklus komparatif dengan gen ahousekeeping, RpLP0, sebagai standar internal. Perbedaan ekspresi relatif dalam gen target dari kelompok eksperimen dinormalisasi dengan kelompok kontrol dan disajikan sebagai perubahan lipat. Primer untuk gen target tercantum dalam Tabel Tambahan 1.

Konstruksi dan analisis jaringan

Untuk menganalisis interpretasi fungsional dan proses biologis yang dimediasi oleh gen yang diekspresikan secara berbeda yang kami identifikasi, Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) digunakan untuk membubuhi keterangan dan menganalisis pengayaan jalur Kyoto Encyclopedia of Gens and Genome (KEGG) dan Gene Ontologi untuk gen ini (Jiao et al., 2012). Untuk menganalisis interaksi langsung dan tidak langsung dari gen yang diekspresikan secara berbeda, daftar gen juga diunggah ke Search Tool for theRetrieval of Interacting Gens/Proteins (STRING) untuk mengambil informasi interaksi dan menghasilkan jaringan interaksi protein (Franceschini et al., 2013).

Analisis statistik

Semua percobaan dilakukan dengan setidaknya tiga ulangan independen, dan analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak SigmaStat v3.5 (Systat Software, Inc., IL). Data untuk perpanjangan umur dan tantangan stres oksidatif dilakukan dengan jumlah total lalat berkisar antara 250–350, dan uji log-rank dinilai untuk analisis yang berbeda. Perbandingan kelompok untuk penilaian fekunditas dan uji kognitif dievaluasi dengan analisis varians satu arah (ANOVA), diikuti dengan uji post-hoc Dunnett. Perbandingan eksperimental lainnya dibuat dengan melakukan uji-t Student dibandingkan dengan kelompok kontrol. Data direpresentasikan sebagai mean ± SEM, dan nilai p <0,05 dianggap="">

Hasil

Suplementasi CT (Cistanche Tubulosa) meningkatkan umur lalat

Untuk memeriksa apakah CT(Cistanche tubulosa)suplementasi dapat memperpanjang umur lalat, lalat dilengkapi dengan 5,4, 10,8, dan 21,6 mg/ml CT segera setelah eclosion pada 25 derajat selama prosedur eksperimental. Data kami menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)suplementasi dapat memperpanjang umur lalat jantan dan betina. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1A, umur lalat jantan diperpanjang dengan semua dosis CT(Cistanche tubulosa). Rerata umur kelompok yang diberi suplemen CT 5,4.10.8, dan 21.6 mg/ml secara signifikan meningkat masing-masing sebesar 18,9 persen, 10,3 persen, dan 9,9 persen. CT(Cistanche tubulosa)juga secara signifikan meningkatkan masa hidup maksimum semua kelompok CT dibandingkan dengan kelompok kontrol dari 88 menjadi 102, 98, dan 102 hari setelah pengobatan dengan 5,4, 10,8, dan 21,6 mg/ml CT(Cistanche tubulosa), masing-masing. Pada wanita, CT(Cistanche tubulosa)secara signifikan meningkatkan umur rata-rata kelompok CT dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 1B). Umur rata-rata meningkat hingga 18,8 persen dengan 5,4 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)dan 5,5 persen dan 6,7 persen dengan 10,8 dan 21,6 mg/ml CT, masing-masing. Kami juga mengamati bahwa umur maksimum secara signifikan diperpanjang dari 91 hari (kontrol) menjadi 109, 98, dan 102 hari setelah pengobatan dengan 5,4, 10,8, dan 21,6 mg/ml CT.(Cistanche tubulosa), masing-masing; besarnya peningkatan maksimum dalam rentang hidup maksimum adalah 19,8 persen pada 5,4 mg/ml CT(Cistanche tubulosa). Hasil kami menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)suplementasi diet secara signifikan memperpanjang umur lalat jantan dan betina. Kurkumin (10 M) digunakan sebagai kontrol positif dan efektif dalam perpanjangan umur, seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan 1.

Suplementasi CT meningkatkan resistensi terhadap kelaparan dan stres oksidatif

Perpanjangan umur sering dikaitkan dengan peningkatan resistensi terhadap stres oksidatif selama proses penuaan. Kami menilai apakah CT(Cistanche tubulosa)suplementasi meningkatkan resistensi terhadap stres oksidatif. Lalat jantan dan betina diberi perlakuan sebelumnya dengan dosis CT yang berbeda(Cistanche tubulosa)selama 20 hari dan dievaluasi untuk kelangsungan hidup mereka setelah kelaparan (Gbr. 2A). Waktu kelangsungan hidup rata-rata dan umur maksimum dari kedua jenis kelamin, dibandingkan dengan kelompok kontrol, menunjukkan peningkatan yang signifikan pada kelompok CT 5,4 dan 10,8 mg/ml tetapi tidak pada kelompok 21 0,6 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)kelompok. Lalat yang diberi perlakuan sebelumnya juga dievaluasi kelangsungan hidupnya setelah ditantang dengan H2O2 dan paraquat, yang menghasilkan spesies oksigen reaktif (ROS) untuk memicu penuaan seluler dan kematian sel. Kami menemukan bahwa CT(Cistanche tubulosa)melindungi lalat jantan dan betina dari toksisitas H2O2 dan memperpanjang umur rata-rata dan maksimumnya (Gbr. 2B, p < 0.01 dan 0,001, pada CT 5,4 dan 10,8 mg/ml(Cistanche tubulosa), masing-masing). Tren serupa menunjukkan peningkatan resistensi terhadap tantangan paraquat juga diamati. Laki-laki yang diberi makan dengan semua dosis CT, dan perempuan, terutama yang dilengkapi dengan 5,4 mg/ml CT(Cistanche tubulosa) (Cistanche tubulosa), bertahan lebih lama daripada kontrol (Gbr. 3A, p < 0.001).="" mengenai="" kemampuan="" memanjat,="" lalat="" jantan="" dan="" betina="" diberikan="" 10,8="" mg/ml="">(Cistanche tubulosa)menunjukkan disfungsi alat gerak yang diinduksi paraquat yang dilemahkan pada 16 jam setelah paraquatchallenge (Gbr. 3B, semua p < 0.05).="" hasil="" ini="" mengungkapkan="" bahwa="" suplementasi="" ct="" meningkatkan="" resistensi="" terhadap="" beberapa="" stres="" oksidatif,="" menunjukkan="" bahwa="">(Cistanche tubulosa)Perpanjangan umur yang diinduksi dikaitkan dengan peningkatan pertahanan antioksidan.

Pengaruh CT (Cistanche Tubulosa) pada kapasitas reproduksi

Karena teori penuaan menunjukkan bahwa proses penuaan berdampak negatif pada reproduksi, kami memeriksa apakah CT(Cistanche tubulosa)mempengaruhi kebugaran reproduksi dengan menganalisis kemampuan bertelur lalat dewasa. Lalat dewasa dikumpulkan setelah eclosion, dipisahkan berdasarkan jenis kelamin, dan diberikan 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)selama 20 hari. Lalat jantan atau betina perawan diberikan CT(Cistanche tubulosa)dikawinkan dengan 9-lalat berumur sehari yang tidak diberikan CT(Cistanche tubulosa). Kami mengamati peningkatan tergantung dosis dalam jumlah telur yang diletakkan per betina, yaitu 30,3 persen dan 57,2 persen lalat mati yang diobati dengan 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa), masing-masing, dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 4, p < 0.05).="" data="" ini="" menunjukkan="" bahwa="">(Cistanche tubulosa)suplementasi dapat memfasilitasi kapasitas reproduksi wanita usia lanjut tetapi kemungkinan tidak pada pria usia lanjut.

Suplementasi CT (Cistanche Tubulosa) meningkatkan kemampuan kognitif

Kami menentukan apakah CT(Cistanche tubulosa)suplementasi memiliki efek menguntungkan pada kemampuan belajar dan memori, satu siklus pelatihan asosiatif penciuman dilakukan. Kami mengevaluasi kinerja pembelajaran serta memori 3- dan 24-h, yang masing-masing dianggap sebagai memori jangka menengah dan memori jangka panjang. Pertama, lalat dilengkapi dengan berbagai dosis CT(Cistanche tubulosa)selama 5 hari. Kemampuan belajar serupa pada kelompok CT dan kontrol (Gbr. 5A). Mengenai 3-h memori, 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)kelompok cenderung memiliki indeks kinerja (PI) yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol (Gbr. 5B, 51,5 ± 3,2 versus 42,6 ± 2,1), meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan. Selain itu, 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)secara signifikan meningkatkan memori {{0}}h lalat dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 5C, PI=41.6 ± 3.6 dan 45,9 ± 3.0 versus 29,6 ± 2,9, masing-masing , p < 0.05="" dan="" 0,01).="" hasil="" ini="" menunjukkan="" bahwa="" suplementasi="" ct="" meningkatkan="" pembentukan="" memori="" pada="" lalat="" muda.="" kedua,="" sementara="">(Cistanche tubulosa)suplementasi meningkatkan umur panjang dan ketahanan oksidatif lalat, kami selanjutnya menentukan apakah suplementasi juga dapat meningkatkan perilaku kognitif pada lalat tua. Lalat diberikan makanan standar dengan atau tanpa 5.4, 10.8, dan 21.6 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)selama 20 hari untuk meniru penuaan; lalat yang dilengkapi dengan dosis CT . ini(Cistanche tubulosa)memiliki PI pembelajaran yang secara signifikan lebih tinggi (67,6 ± 1,9, 72,5 ± 0.5, dan 75,2 ± 1,3, masing-masing) daripada kontrol (58.0 ± 2.0; Gambar 5D , p < 0.001), menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)memiliki efek menguntungkan dalam menunda penurunan pembelajaran terkait usia. Hasil serupa juga mengungkapkan bahwa CT 5,4 mg/ml(Cistanche tubulosa)kelompok memiliki retensi memori yang lebih efisien dalam {{0}}h (Gbr. 5E, 47,5 ± 1,9 versus kontrol37.{{10}} ± 2,9, p <0,05) dan="" 24-="" h="" tes="" memori="" (gbr.="" 5f,="" 31,8="" ±="" 3,8="" versus="" kontrol="" 19,3="" ±="" 2,4,="" p=""><0,01). hasil="" ini="" menunjukkan="" bahwa="">(Cistanche tubulosa)suplementasi tidak hanya meningkatkan pembentukan memori pada lalat muda, tetapi juga menunda gangguan perilaku kognitif dan mempertahankan kemampuan belajar dan memori yang lebih efisien seiring bertambahnya usia.

Jalur molekuler yang terkait dengan promosi umur panjang dan peningkatan kognitif suplementasi CT

CT(Cistanche tubulosa)suplementasi baik menekan AMI dan memperpanjang umur. Oleh karena itu, kami beralasan bahwa AMI dan gen terkait umur panjang mungkin ditentukan dengan menilai ekspresi diferensial antara kontrol dan kelompok CT 5,4 dan 10,8 mg/ml melalui qPCR. Perubahan ekspresi gen dari lalat yang diobati dengan CT dibandingkan dengan kelompok kontrol ditunjukkan pada Gambar. 6A. Ekspresi beberapa gen target yang diregulasi, termasuk Sirt6, Sir2, Sod, p38b, dan Sirt2, mungkin terlibat dalam proses penuaan. Transkrip tingkat S6k, raptor, Psn, Rpd3, dan N juga meningkat, menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)suplementasi mengubah transduksi sinyal jalur TOR dan Notch. Selain itu, suplementasi CT secara signifikan mempengaruhi ekspresi mRNA Nmdar1, Nmdar2, dan SkpA. Untuk menyoroti interaksi protein yang relevan dengan CT yang memperpanjang umur dan meningkatkan pembelajaran dan memori, jaringan interaksi protein berbasis literatur dari gen yang disaring qPCR telah dibuat (Gbr. 6B). Setiap simpul mewakili satu protein, sedangkan setiap tepi menunjukkan satu interaksi berbasis literatur. Node dikelompokkan sesuai dengan jalur KEGG dan proses biologis ontologi gen (GOBP). Seperti ditunjukkan pada Gambar. 6B, interaksi reseptor ligan neuroaktif GOBP, yang memengaruhi pembelajaran dan memori, dan GOBP penuaan lainnya, yang berkorelasi dengan umur, keduanya terhubung dengan jalur pensinyalan Notch. Selain itu, GOBP penuaan dipengaruhi oleh jalur pensinyalan mTOR. Pentingnya ekspresi berlebih gen yang diinduksi CT pada GOBP dan jalur ini dijelaskan di bagian Diskusi.

Gambar 6. Analisis jaringan gen yang diekspresikan secara berbeda. Lalat yang diberi perlakuan sebelumnya dengan 5,4 dan 10,8 mg/ml CT(Cistanche tubulosa)dan diet kontrol pada 25 derajat selama 20 hari dikumpulkan untuk mengukur ekspresi gen diferensial. ( A ) Tingkat transkrip relatif gen target ke kontrol diukur melalui qPCR. n=4 untuk setiap grup. (B) Gen yang diregulasi terlibat dalam transduksi sinyal sel dan jaringan interaksinya. Node mewakili gen. Gen dengan ekspresi berlebih dilingkari dengan warna hijau. Tepi mewakili interaksi antara produk gen. Jenis interaksi dilambangkan dengan warna yang berbeda pada gambar. (Untuk interpretasi referensi warna dalam legenda gambar ini, pembaca dirujuk ke versi web artikel ini.)

Diskusi

Ketidakseimbangan antara pembentukan dan eliminasi radikal bebas oleh sistem pertahanan antioksidan endogen dapat menyebabkan kerusakan oksidatif pada jaringan seiring bertambahnya usia; dengan demikian, radikal bebas berspekulasi memainkan peran penting dalam penuaan (Dato et al., 2013). Di sini, kami menunjukkan bahwa CT(Cistanche tubulosa)suplementasi pada lalat memperpanjang umur dan menghasilkan toleransi yang tinggi terhadap kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh H2O2 dan paraquat pada kedua jenis kelamin. Studi, berkorelasi dengan CT(Cistanche tubulosa)dan antipenuaan, kurang dieksplorasi, tetapi ekstrak dari C. deserticola, dapat memperpanjang masa hidup pada tikus yang rentan terhadap penuaan 8 (SAM-P8) (Zhang et al., 2014) dan echinacoside, salah satu senyawa utama yang ada di CT , memiliki efek menguntungkan pada perpanjangan umur dan toleransi stres pada C. elegans (Wang et al., 2015).

Penelitian pada hewan terbaru menunjukkan bahwa echinacosida memiliki efek protektif terhadap toksisitas testis yang diinduksi bisphenol A dan meningkatkan biosintesis testosteron dengan induksi enzim steroidgenik testis, termasuk CYP11A1, 3 -HSD, dan CYP17A1 (Jiang et al., 2016). CT(Cistanche tubulosa)ekstrak etanol juga meningkatkan viabilitas dan kualitas sperma pada tikus (Wang et al., 2016). Meskipun korelasi antara CT(Cistanche tubulosa)dan estrogen masih perlu dieksplorasi, satu penelitian melaporkan bahwa echinacosida secara signifikan meningkatkan ekspresi reseptor estrogen, mirip dengan kelompok yang diobati dengan estradiol pada tikus yang diovariektomi (Li et al., 2013). Karena kapasitas reproduksi terjadi berkorelasi negatif dengan usia (Kenyon, 2005), kami meneliti apakah CT memiliki manfaat pada lalat tua. Kebugaran reproduksi dipengaruhi oleh CT(Cistanche tubulosa)hanya diamati pada wanita, menunjukkan bahwa lalat betina mungkin lebih responsif terhadap CT(Cistanche tubulosa)suplementasi. Hasil ini mengungkapkan bahwa CT mungkin memiliki efek seperti hormon seks dan menunda penuaan reproduksi, konsisten dengan penggunaan klinis CT.(Cistanche tubulosa)untuk mengobati disfungsi seksual pada manusia.

Acteoside dapat menjelaskan efek perlindungan untuk mengurangi apoptosis neuron dan kehilangan memori pada model tikus tua yang diinduksi oleh kombinasi D-galaktosa dan AlCl3, menunjukkan bahwa CT mungkin memiliki potensi untuk memiliki sifat neuroprotektif dan peningkatan memori (Gao et al., 2015; Peng et al., 2015). Data kami menunjukkan bahwa pembentukan memori meningkat pada lalat muda yang dilengkapi CT. Oleh karena itu, kami menilai apakah CT(Cistanche tubulosa)suplemen bermanfaat untuk retensi memori pada penuaan karena fungsi kognitif diketahui menurun pada penuaan normal. Hasil kami mengungkapkan bahwa beberapa jenis AMI, termasuk pembelajaran, 3- dan 24-hmemory, dapat diperbaiki dengan CT(Cistanche tubulosa)suplementasi selama 20 hari. Menurut hasil yang disebutkan di atas, CT(Cistanche tubulosa)suplementasi mungkin memiliki efek menguntungkan pada umur panjang dan peningkatan pembentukan memori serta cukup menunda AMI.

Menggunakan model hewan memfasilitasi identifikasi mekanisme potensial dan ketergantungan jalur CT(Cistanche tubulosa)untuk memperlambat penuaan otak dan menunda AMI pada tingkat sel. Kami fokus pada mekanisme molekuler yang mendasari penuaan, transmisi neuron, dan stres oksidatif dan beralasan bahwa gen terkait AMI dan umur panjang dapat diidentifikasi dengan memeriksa ekspresi diferensial antara kelompok kontrol dan CT melalui qPCR. Jalur pensinyalan Notch sangat dilestarikan di antara spesies dari Drosophila hingga manusia; itu diekspresikan dalam sistem saraf pusat dewasa untuk plastisitas saraf dan mengatur diferensiasi saraf bersama dengan penghambatannya selama pengembangan (Presente et al., 2001). Tikus yang membawa mutasi heterozigot Notch kurang dalam pembelajaran spasial dan memori (Costa et al., 2003). Presenilin (Psn) diperlukan untuk mengaktifkan pembelahan Notch ke dalam domain intraseluler Notch dan knockout Psn menyebabkan penurunan plastisitas sinaptik dan pembentukan memori (Saura et al., 2004). Data kami mengungkapkan peningkatan regulasi Notch dan Psn yang bergantung pada dosis di CT(Cistanche tubulosa)lalat yang ditambahkan, dengan tingkat ekspresi mati rasa yang tidak berubah, yang menyiratkan jalur pensinyalan Notch sebagai mekanisme yang kuat untuk peningkatan memori dengan suplementasi CT. Selain pensinyalan Notch, reseptor N-metil-D-aspartat (NMDAR), saluran ion yang digerakkan oleh glutamat dan D-serin di neuron, mengontrol plastisitas sinaptik dan fungsi memori (Furukawa et al., 2005). Genom Drosophila berisi dua Subunit NMDAR, Nmdar1 dan Nmdar2, dan keduanya sangat penting dalam fungsi memori. Nmdar1 knockdown di Drosophila merusak pembelajaran dan memori (Xia et al., 2005), sedangkan ekspresi berlebih Nmdar2 pada tikus meningkatkan pembelajaran dan memori (Tang et al., 2001). Data kami menunjukkan peningkatan tergantung dosis dalam regulasi Nmdar1 dan Nmdar2 pada lalat yang dilengkapi CT, menunjukkan mekanisme potensial lain dari peningkatan memori oleh CT(Cistanche tubulosa)suplementasi.

Kelas O dari jalur forkhead box transcription factor (FoxO) dilestarikan di antara spesies dan penting dalam metabolisme, toleransi stres, dan perpanjangan umur (Lehtinen et al., 2006). Modifikasi pascatranslasi, termasuk fosforilasi, asetilasi, dan ubiquitylation, mengatur aktivitas FoxOs (van der Horst dan Burgering, 2007). Pengatur informasi diam 2 (Sir2; homolog pada mamalia dikenal sebagai SIRT1) mengatur aktivitas FoxO melalui deasetilasi dan mempengaruhi umur hewan terkait dengan jalur insulin-like growth factor (IGF) (Lemieux et al., 2005). Sirt6 mendefosforilasi FoxO untuk menyebabkan perpanjangan umur pada tikus jantan (Kanfi et al., 2012). Data kami mengungkapkan peningkatan regulasi Sir2 dan Sirt6 pada lalat yang dilengkapi CT, menyiratkan bahwa regulasi FoxO oleh Shirts mungkin merupakan mekanisme ampuh perpanjangan umur oleh CT(Cistanche tubulosa)suplementasi. Radikal bebas yang dihasilkan selama proses metabolisme menyebabkan kerusakan DNA dan protein, sehingga menyebabkan umur yang lebih pendek. Sir2 juga merupakan gen respon stres oksidatif (Whitaker et al., 2013), dan overexpressed superoxide dismutase (SOD), yang mengubah O2− menjadi H2O2 dan akhirnya menjadi H2O dengan menggunakan katalase dan glutathione peroxidase, telah dilaporkan memperpanjang umur lalat ( Le Bourg, 2001). Data kami mengungkapkan peningkatan regulasi Sod dan Sir2 yang bergantung pada dosis pada lalat yang dilengkapi CT, menunjukkan bahwa jalur antioksidan mungkin merupakan mekanisme ampuh perpanjangan umur oleh CT(Cistanche tubulosa)suplementasi.

Jalur kunci lain dalam penuaan diatur oleh kompleks mTOR mTORC1 dan mTORC2, keduanya mempromosikan organisme dalam cara konservatif evolusioner. Sinyal dari reseptor insulin mengaktifkan mTORC1 melalui jalur phosphoinositide3-kinase-Akt untuk mempromosikan sintesis protein dan peradangan dan untuk menghambat autophagy dan glikolisis dengan menggunakan protein hilir yang berbeda (Johnson et al., 2013). Sintesis protein diaktifkan oleh protein ribosom S6 kinase (S6K), yang membentuk loop umpan balik negatif untuk menghambat pensinyalan reseptor insulin (Hands et al., 2009). Target penghambatan mTORC1 adalah protein serupa Drosophila (sima), yang homolognya pada mamalia dikenal sebagai faktor 1 alfa yang diinduksi hipoksia (HIF1). HIF1 memainkan peran protektif terhadap kerusakan yang bergantung pada usia pada pembuluh darah dan neuron motorik (Oosthuyse et al., 2001; Rivard et al., 2000). Data kami mengungkapkan tingkat ekspresi subunit kompleks mTOR yang tidak berubah, termasuk Tor, rictor, dan raptor, sedangkan CT(Cistanche tubulosa)suplementasi S6K dan sima yang diregulasi tergantung dosis, menyiratkan peran pelindung CT(Cistanche tubulosa)terhadap aktivitas mTOR.

Kesimpulan

Meskipun beberapa jalur yang terlibat diidentifikasi, umur panjang dan kecerdasan tinggi disumbangkan oleh CT(Cistanche tubulosa)Intervensi mungkin merupakan sifat apoligenik yang dipengaruhi oleh interaksi beberapa gen, dan faktor genetik lain yang belum kami jelaskan juga dapat memodulasi proses penuaan. Untuk orang tua, mempertahankan kebugaran fisik dan kemampuan kognitif yang diinginkan untuk menunda atau mencegah demensia dan penyakit kronis harus menjadi perolehan penting dari studi tentang penuaan. Karena CT(Cistanche tubulosa), yang dikenal sebagai "ginseng gurun," memiliki efek kuratif yang nyata pada penguatan yang ginjal, yang memelihara semua organ dan mengisi kembali esensi vital dalam pengobatan tradisional Tiongkok, kami percaya bahwa penelitian kami memberikan bukti yang mendukung pengobatan klinis CT(Cistanche tubulosa)dan mungkin memberikan wawasan yang berharga untuk mengembangkan obat baru atau bahan tambahan makanan untuk tidak hanya menunda penuaan dan penyakit terkait usia tetapi juga untuk meningkatkan kualitas hidup manusia.

Konflik kepentingan

Para penulis menyatakan bahwa mereka tidak memiliki konflik kepentingan.

Ucapan Terima Kasih

Pekerjaan ini didukung oleh China Medical University(CMU103-S-25); Rumah Sakit Universitas Kedokteran China (DMR-101-065,DMR-103-099); Kementerian Sains dan Teknologi di Taiwan(NSC 102-2632-B-039-001-MY3, PALING 104-2632-B-039-002), dan sebagian oleh Pusat Penelitian dan Uji Klinis Kementerian Kesehatan dan Kesejahteraan Taiwan Keunggulan (MOHW105-TDU-B-212-133019).

Bahan pelengkap

Materi tambahan yang terkait dengan artikel ini dapat ditemukan, dalam versi online, di doi:10.1016/j.phymed.2017.01.006.

Dari: 'Jalur molekuler yang terkait dengan promosi umur panjang dan peningkatan kognitifCistanche tubulosadi Drosophila' olehWei-Yong Lin dkk

--W.-Y. Lin dkk. / Fitomedicine 26 (2017) 37–44

Referensi

Burke, SN, Barnes, CA, 2010. Sinapsis tua dan dinamika sirkuit hipokampus. Tren Neurosci. 33, 153-161.

Costa, RM, Honjo, T., Silva, AJ, 2003. Belajar dan defisit memori pada tikus mutan Notch. Curr. Biol. 13, 1348–1354.

Dato, S., Crocco, P., D'Aquila, P., de Rango, F., Bellizzi, D., Rose, G., Passarino, G., 2013.Menjelajahi peran variabilitas genetik dan gaya hidup dalam oksidatif respon stres untuk penuaan yang sehat dan umur panjang. Int. J. Mol. Sci. 14, 16443-16472.

Dubnau, J., Grady, L., Kitamoto, T., Tully, T., 2001. Gangguan neurotransmisi di tubuh jamur Drosophila menghalangi pengambilan tetapi bukan perolehan memori. Alam 411, 476–480.

Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonovic, M., Roth, A., Lin, J., Minguez, P., Bork, P., von Mering, C. , Jensen, LJ, 2013. STRING v9.1: jaringan interaksi protein-protein, dengan peningkatan cakupan dan integrasi. Asam Nukleat Res. 41, D808–D815.

Furukawa, H., Singh, SK, Mancusso, R., Gouaux, E., 2005. Pengaturan dan fungsi subunit pada reseptor NMDA. Alam 438, 185-192.
Gao, L., Peng, XM, Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Peningkatan memori Acteoside (Verbascoside) dalam Model Tikus Tua yang diinduksi oleh kombinasi D-gal dan AlCl3. fitoterapi. Res. 29, 1131-1136.
Guo, Q., Zhou, Y., Wang, CJ, Huang, YM, Lee, YT, Su, MH, Lu, J., 2013. Sebuah label terbuka, studi terkontrol non-plasebo padaCistanche tubulosakapsul glikosida (Memoregain((R))) untuk mengobati penyakit Alzheimer sedang. Saya. J. Alzheimer Dis. Demen lainnya. 28, 363–370.
Tangan, SL, Bangga, CG, Wyttenbach, A., 2009. Peran mTOR dalam penuaan: sintesis protein atau autophagy? Penuaan (Albany NY) 1, 586–597.
Jiang, Z., Wang, J., Li, X., Zhang, X., 2016. Echincoside andCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight memperbaiki kerusakan testis dan sperma yang diinduksi bisphenol A pada tikus melalui enzim steroidogenik yang diatur sumbu gonad. J. Ethnopharmacol 193, 321–328.
Jiao, X., Sherman, BT, Huang da, W., Stephens, R., Baseler, MW, Lane, HC, Lempicki, RA, 2012. DAVID-WS: layanan web stateful untuk memfasilitasi analisis daftar gen/protein. Bioinformatika 28, 1805–1806.
Johnson, SC, Rabinovitch, PS, Kaeberlein, M., 2013. mTOR adalah modulator utama penuaan dan penyakit terkait usia. Alam 493, 338–345.
Kanfi, Y., Naiman, S., Amir, G., Peshti, V., Zinman, G., Nahum, L., Bar-Joseph, Z., Cohen, HY, 2012. Sirtuin SIRT6 mengatur umur pada pria tikus. Alam 483, 218–221.
Kenyon, C., 2005. Plastisitas penuaan: wawasan dari mutan berumur panjang. Sel 120, 449–460.
Le Bourg, E., 2001. Stres oksidatif, penuaan, dan umur panjang di Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 498, 183–186.
Lehtinen, MK, Yuan, Z., Boag, PR, Yang, Y., Villen, J., Becker, EB, DiBacco, S., de la Iglesia, N., Gygi, S., Blackwell, TK, Bonni, A., 2006. Jalur pensinyalan MST-FOXO yang dilestarikan memediasi respons stres oksidatif dan memperpanjang rentang hidup. Sel 125, 987–1001.
Lemieux, ME, Yang, X., Jardine, K., He, X., Jacobsen, KX, Staines, WA, Harper, ME, McBurney, MW, 2005. Sirt1 deacetylase memodulasi jalur pensinyalan faktor pertumbuhan seperti insulin di mamalia. mekanisme Penuaan Dev. 126, 1097–1105.
Li, F., Yang, X., Yang, Y., Guo, C., Zhang, C., Yang, Z., Li, P., 2013. Aktivitas antiosteoporotic echinacoside pada tikus yang diovariektomi. Fitomedika 20, 549–557.
Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J., Tzeng, CM, 2016. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): salah satu hadiah farmasi terbaik dari pengobatan tradisional Tiongkok. Farmakol depan. 7, 41.
Lin, S., Ye, S., Huang, J., Tian, ​​Y., Xu, Y., Wu, M., Wang, J., Wu, S., Cai, J., 2013. Bagaimana bahasa Cina obat-obatan yang menguatkan ginjal menghambat apoptosis neuron dopaminergik? Regenerasi saraf. Res. 8, 2820-2826.

Oosthuyse, B., Bulan, L., Storkebaum, E., Beck, H., Nuyens, D., Brusselmans, K., Van Dorpe, J., Hellings, P., Gorselink, M., Heymans, S. , Theilmeier, G., Dewerchin, M., Laudenbach, V., Vermylen, P., Raat, H., Acker, T., Vleminckx, V., Van Den Bosch, L., Cashman, N., Fujisawa, H., Drost, MR, Sciot, R., Bruyninckx, F., Hicklin, DJ, Ince, C., Gressens, P., Lupu, F., Plate, KH, Robberecht, W., Herbert, JM, Collen , D., Carmeliet, P., 2001. Penghapusan elemen hipoksia-respon dalam promotor faktor pertumbuhan endotel vaskular menyebabkan degenerasi neuron motorik. Nat. gen. 28, 131-138.

Peng, XM, Gao, L., Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Mekanisme peningkatan memori Acteoside (Verbascoside) pada Model Mouse Senescent yang diinduksi oleh kombinasi D-gal dan AlCl3. Phytother, Res. 29, 1137-1144.
Presente, A., Andres, A., Nye, JS, 2001. Persyaratan Notch di masa dewasa untuk fungsi neurologis dan umur panjang. Laporan saraf 12, 3321-3325.
Rivard, A., Berthou-Soulie, L., Principe, N., Kearney, M., Curry, C., Branellec, D., Semenza, GL, Isner, JM, 2000. Cacat bergantung usia pada pertumbuhan endotel vaskular ekspresi faktor dikaitkan dengan penurunan aktivitas faktor 1 yang diinduksi hipoksia. J.Biol. Kimia 275, 29643–29647.
Saura, CA, Choi, SY, Beglopoulos, V., Malkani, S., Zhang, D., Rao, Shankaranarayana, Chattarji, BS, Kelleher, S., 3rd, RJ, Kandel, ER, Duff, K., Kirkwood , A., Shen, J., 2004. Hilangnya fungsi presenilin menyebabkan gangguan memori dan plastisitas sinaptik diikuti oleh neurodegenerasi yang bergantung pada usia. Neuron 42, 23-36.
Schimanski, LA, Barnes, CA, 2010. Sintesis protein saraf selama penuaan: efek pada plastisitas dan memori. Neurosci Penuaan Depan. 2. Seok, J., Kim, TS, Kwon, HJ, Lee, SP, Kang, MH, Kim, BJ, Kim, MN, 2015. KhasiatCistanche Tubulosadan suplemen ekstrak Laminaria Japonica (MK-R7) dalam mencegah kerontokan rambut berpola dan meningkatkan kesehatan kulit kepala. klinik nutrisi Res. 4, 124-131.
Tang, YP, Wang, H., Feng, R., Kyin, M., Tsien, JZ, 2001. Efek diferensial pengayaan pada pembelajaran dan fungsi memori pada tikus transgenik NR2B. Neurofarmakologi 41, 779-790.
van der Horst, A, Burgering, BM, 2007. Menekankan peran protein FoxO dalam umur dan penyakit. Nat. Pdt Mol. Sel. Biol. 8, 440–450.
Wang, T., Chen, C., Yang, M., Deng, B., Kirby, GM, Zhang, X., 2016.Cistanche tubulosaekstrak etanol memediasi kadar hormon seks tikus dengan induksi enzim steroidogenik testis. Farmasi. Biol. 54, 481–487.
Wang, T., Zhang, X., Xie, W., 2012.Deserticola CistancheYC Ma, "Ginseng gurun": ulasan. Saya. J.Cin. Med. 40, 1123-1141.
Wang, X., Zhang, J., Lu, L., Zhou, L., 2015. Efek umur panjang echinacosida di Caenorhabditis elegans dimediasi melalui daf-16. Biosci. Bioteknologi. Biokimia. 79, 1676–1683.
Whitaker, R., Faulkner, S., Miyokawa, R., Burhenn, L., Henriksen, M., Wood, JG, Helfand, SL, 2013. Peningkatan ekspresi Drosophila Sir2 memperpanjang rentang hidup dengan cara yang bergantung pada dosis. Penuaan (Albany NY) 5, 682–691.
Wu, CR, Lin, HC, Su, MH, 2014. Pembalikan oleh ekstrak air dariCistanche tubulosadari defisit perilaku pada model tikus seperti penyakit Alzheimer: relevansi untuk deposisi amiloid dan fungsi neurotransmitter pusat. Komplemen BMC. Alternatif Med. 14, 202.
Xia, S., Miyashita, T., Fu, TF, Lin, WY, Wu, CL, Pyzocha, L., Lin, IR, Saitoe, M., Tully, T., Chiang, AS, 2005. Reseptor NMDA menengahi pembelajaran penciuman dan memori di Drosophila. Curr. Biol. 15, 603–615.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., Wu, H., Han, L., Ohno, T., Uotsu, N., Yamaguchi, K., Ma, Z., Tu, P., 2014. Ekstrak Cistanche deserticola dapat Melawan Imunosenescence dan memperpanjang masa hidup di Senescence-Accelerated Mouse
Tikus Rawan 8 (SAM-P8). jelas. Komplemen Berbasis. Alternatif Med. 2014, 601383.
Zhao, Q., Gao, J., Li, W., Cai, D., 2010. Efek neurotropik dan penyelamatan saraf dari Echincoside dalam model tikus MPTP subakut penyakit Parkinson. Otak Res. 1346, 224–236.