Evolusi Molekuler Protein Peningkat Bakterisida/Permeabilitas (BPIFA1) yang Mengatur Respons Kekebalan Tubuh Bawaan pada Mamalia Bagian 1

Abstrak:

Protein peningkat bakterisidal/permeabilitas, faktor utama sistem kekebalan bawaan mamalia, berpartisipasi dalam perlindungan kekebalan alami terhadap bakteri yang menyerang. BPIFA1 secara aktif berkontribusi pada pertahanan inang melalui berbagai mekanisme, seperti antibakteri, surfaktan, kontrol cairan permukaan jalan napas, dan aktivitas imunomodulator. Namun, sejarah evolusi dan kekuatan seleksi pada gen BPIFA1 pada mamalia selama evolusi adaptif kurang dipahami. Studi ini meneliti gen BPIFA1 manusia dibandingkan dengan spesies mamalia lain untuk memperkirakan tekanan selektif yang berasal dari evolusi adaptif. Untuk menilai apakah seleksi positif terjadi atau tidak, kami menggunakan beberapa tes kemungkinan yang berbeda (M1 vs M2 dan M7 vs M8).

Proporsi situs yang dipilih secara positif signifikan, dengan nilai log kemungkinan 93,63 untuk protein BPIFA1. Server Seleksi digunakan pada kumpulan data yang sama untuk mengonfirmasi ulang seleksi positif untuk lokasi tertentu dengan menggunakan model Kombinasi Mekanistik-Empiris, sehingga memberikan bukti tambahan yang mendukung temuan seleksi positif. Ada bukti yang meyakinkan untuk sinyal seleksi positif pada gen BPIFA1 spesies mamalia, yang lebih signifikan untuk tanda seleksi dan pembuatan sinyal.

Protein BPIFA1, juga dikenal sebagai LPLUNC1 atau Nasopharyngeal Carcinoma-associated Gene 6 (NAG6), adalah protein yang sangat diekspresikan di saluran napas bagian atas dan rongga mulut. Protein BPIFA1 terkait erat dengan kekebalan.

Penelitian telah menunjukkan bahwa protein BPIFA1 memiliki efek antibakteri dan imunomodulator. Protein BPIFA1 dapat mengikat Escherichia coli invasif dan menghancurkan membran selnya, sehingga memainkan peran antibakteri. Selain itu, protein BPIFA1 memainkan peran imunomodulator dengan mengaktifkan jalur Toll-like receptor (TLR) 4 dan TLR2, mendorong respons inflamasi, apoptosis, dan aktivasi sel imun.

Hubungan antara protein BPIFA1 dan penyakit pernapasan juga telah dipelajari secara ekstensif. Misalnya, penelitian telah menunjukkan bahwa tingkat ekspresi protein BPIFA1 pada penyakit pernapasan seperti asma bronkial dan penyakit paru obstruktif kronik (PPOK) terkait erat dengan tingkat keparahan penyakit. Terutama dalam kondisi infeksi, tingkat ekspresi protein BPIFA1 dapat meningkat secara signifikan, sehingga berpartisipasi dalam pengaturan respon imun sistem pernapasan dan keseimbangan flora.

Oleh karena itu, peran protein BPIFA1 dalam sistem kekebalan tubuh tidak dapat diabaikan, dan hubungannya dengan penyakit pernapasan dan infeksi memerlukan studi mendalam lebih lanjut. Oleh karena itu, kita perlu memberikan perhatian khusus untuk meningkatkan kekebalan tubuh kita. Cistanche memiliki efek signifikan dalam meningkatkan kekebalan tubuh. Polisakarida dalam daging dapat mengatur respon imun sistem kekebalan tubuh manusia, meningkatkan kemampuan stres sel imun, dan memperkuat sel imun. efek bakterisida.

Klik untuk mengetahui makanan utuh cistanche

Kami melakukan tes probabilitas membandingkan berbagai model berdasarkan rasio dN/dS untuk mengenali kodon spesifik di bawah tekanan seleksi positif. Kami mengidentifikasi situs yang dipilih secara positif dalam domain LBP-BPI dari protein BPIFA1 dalam genom mamalia, termasuk domain pengikat lipid dengan tingkat selektivitas yang sangat tinggi untuk DPPC. BPIFA1 mengaktifkan sistem kekebalan bawaan saluran napas bagian atas sebagai respons terhadap banyak sinyal genetik dalam genom mamalia. Temuan ini menyoroti kemajuan evolusioner dalam efek imunoregulasi yang memainkan peran penting dalam pertahanan antibakteri dan antivirus spesies mamalia.

Kata kunci:

BPIFA1; bakterisida; sistem imun; evolusi molekuler; seleksi positif.

1. Perkenalan

Protein peningkat permeabilitas bakterisida (BPI) adalah protein antimikroba yang sangat efektif yang mengikat dan menetralkan lipopolisakarida yang dilepaskan dari membran luar bakteri [1]. Gen BPI fold-containing family A member 1 (BPIFA1) diketahui memiliki efek pada sistem imun lokal, dan efek ini berpotensi mempengaruhi pertumbuhan dan invasi mikroorganisme [2]. Salah satu mekanisme potensial yang mendasari hubungan ini adalah kemampuan BPIFA1 untuk meningkatkan penyerapan bakteri oleh sel fagosit dan kemampuannya untuk menghancurkannya [3].

Meskipun mereka memiliki kemiripan urutan yang minimal, BPI memiliki dua domain yang mengadopsi lipatan struktural yang sama [1,4]. Bakteri Gram-negatif yang menginvasi menghasilkan respons inang yang terintegrasi yang difasilitasi oleh adanya protein pengikat lipopolisakarida (LBP). LBP adalah protein pengikat endotoksin yang terkait erat dan terkoordinasi dengan BPI [5]. BPIFA1 mengontrol mikrobiota mukosa dan pensinyalan interferon awal. SPLUNC1 (sebelumnya dikenal sebagai BPIFA1) adalah anggota keluarga yang mengandung lipatan protein dengan aktivitas antibakteri, surfaktan, dan imunomodulator, yang semuanya berkontribusi pada perlindungan inang. Sistem pernapasan adalah situs utama ekspresinya [6]. SPLUNC1, homolog manusia dari gen tikus PLUNC, menunjukkan pola ekspresi yang sama di saluran udara bagian atas dan daerah nasofaring sebagai homolog tikusnya. Tindakan antibakteri terhadap bakteri Gram-negatif ditampilkan oleh protein antimikroba yang dikodekan [5]. Pada kanker paru non-sel kecil, ini mungkin berfungsi sebagai penanda molekuler potensial untuk menemukan mikrometastasis. Beberapa varian transkrip telah ditemukan sebagai hasil penyambungan alternatif dari wilayah 3' yang tidak diterjemahkan; namun, sifat lengkap dari hanya tiga varian transkrip ini yang dipahami [7].

Baik tikus maupun manusia memiliki tingkat ekspresi gen BPIFA1 yang signifikan di bagian atas trakea, tetapi ekspresi ini berkurang dengan jarak dari trakea, mencapai minimum pada percabangan bronkus batang utama dan menjadi tidak terdeteksi di pinggiran paru-paru. [8]. Studi ekspresi gen yang ekstensif pada tikus dan manusia gagal mendeteksi BPIFA1 di jaringan paru perifer [9]. Kecuali untuk tingkat ekspresi mRNA BPIFA1 yang sangat rendah pada timus tikus, jantung tikus, dan mukosa penciuman, BPIFA1 tidak diekspresikan pada organ atau jaringan di luar sistem pernapasan hewan pengerat [10]. Tidak ada indikasi bahwa mRNA BPIFA1 hadir di salah satu jaringan manusia berikut ini: jantung, hati, otak, lambung, usus kecil, plasenta, otot rangka, pankreas, limpa, kelenjar getah bening normal, limfosit perifer, prostat, testis, atau ovarium [11].

Ekspresi mRNA BPIFA1 mengikuti pola distribusi yang sangat sebanding dalam jaringan embrionik dan dewasa. Pola ini diamati pada kedua jenis jaringan [1]. Overekspresi BPIFA1 pada tikus transgenik menghasilkan makrofag alveolar dengan peningkatan opsonisasi dan fagositosis karbon nanotube dalam model peradangan saluran napas terkontrol [12]. Selain itu, nanobakteri Gram-negatif komensal ditunjukkan untuk melokalisasi dengan BPIFA1 dalam sel epitel jaringan kanker nasofaring [13]. Sampel diambil dari pasien yang sebelumnya teridentifikasi menderita karsinoma nasofaring. Temuan studi terbaru menunjukkan bahwa interaksi antara BPIFA1 dan LPS non-bakteri dapat mengurangi respon inflamasi tubuh yang disebabkan oleh LPS non-bakteri. [1].

Kisaran efek antibakterinya dan pelestarian strukturnya pada vertebrata yang bernapas di udara menyiratkan bahwa BPIFA1 telah berevolusi untuk memberikan kapasitas pelindung inang yang penting [14]. Namun, karena lokasinya di saluran udara proksimal dan levelnya yang tinggi pada kondisi basal, BPIFA1 mungkin sangat diperlukan. Ini karena efektor antimikroba berlimpah pada hewan [15]. Akibatnya, BPIFA1 tampaknya memiliki efek paling signifikan dalam menghindari infeksi dan membersihkannya sebelum invasi patogen. Infeksi bakteri pada sistem pernapasan dapat dicegah berkat fungsi-fungsi tersebut, yang dapat menandakan aktivasi kekebalan dan peningkatan pengaturan fungsi saluran napas lainnya [15].

Perubahan adaptif sebagai respons terhadap tuntutan lingkungan dianggap dibatasi oleh faktor biofisik, tetapi aspek struktural situs yang mengandung perubahan adaptif tidak dapat diprediksi oleh teori evolusi mana pun [16]. Hal ini karena kendala biofisik membatasi jenis substitusi yang diperbolehkan agar fungsi protein dapat dipertahankan [17]. Seleksi positif mungkin lebih umum pada bagian protein di mana mutasi diharapkan memiliki efek yang lebih rendah daripada bagian lain dari protein, meskipun hal ini belum terbukti (misalnya, situs regulasi alosterik) [18]. Namun, wilayah fungsional diharapkan tetap dipertahankan secara substansial selama evolusi, meskipun perubahan adaptif dikaitkan dengan fiksasi cepat dari mutasi yang menguntungkan [19]. Evolusi molekuler dari urutan protein secara signifikan dipengaruhi oleh proses seleksi alam.

Perkembangan terkini dalam pengurutan genom dan metode inferensi yang andal pada tingkat filogenetik dan populasi telah memungkinkan dilakukannya penilaian yang cepat dan kuat terhadap tingkat evolusi dan adaptasi yang didorong oleh seleksi alam [20]. Pada tingkat filogenetik dan populasi, sejumlah besar pekerjaan telah dilakukan untuk membangun metode inferensi. Selanjutnya, meningkatnya aksesibilitas data struktural dan fungsional protein telah memungkinkan peneliti untuk menguji dampak kendala struktural dan fungsional pada evolusi dan adaptasi sekuens protein [16]. Karena batasan yang ditentukan oleh struktur dan fungsinya, tingkat evolusi dan adaptasi berbeda untuk berbagai protein dan situs dalam protein yang sama [19].

Sebagian besar fungsi sel terkait erat dengan jaringan pengatur ekspresi gen yang memungkinkan organisme untuk mentolerir tingkat infeksi yang lebih tinggi atau mengurangi efek dari infeksi tersebut [21]. Sebagian besar komponen yang membentuk fisiologi seluler terkait erat dengan sistem pengaturan ekspresi gen ini, yang seringkali merupakan adaptasi evolusi lama [22]. Mekanisme ini telah menarik minat yang besar dalam penelitian yang telah menggunakan sekumpulan spesies model terbatas yang informasi genetiknya tersedia [23]. Namun, sedikit yang diketahui tentang mekanisme yang mengarah pada evolusi sistem ini atau bagaimana mereka beradaptasi dengan pengaturan lingkungan yang beragam seiring perkembangan kemajuan.

Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki asal usul evolusi gen BPIFA1 untuk mengungkap fitur fisiokimianya dan menerapkan genomik komparatif untuk memberikan penilaian gen tersebut pada berbagai spesies mamalia. Kami melakukan studi komparatif mendalam tentang gen bakterisida/peningkat permeabilitas protein (BPIFA1), yang mengatur respons imun bawaan pada mamalia, untuk lebih memahami cara kerja gen ini. Ada kemungkinan tekanan selektif akan berpengaruh signifikan terhadap evolusi adaptasi. Dalam studi ini, kami menyelidiki sejarah gen-gen ini dalam berbagai spesies vertebrata, serta bagaimana keragaman genetik dan seleksi alam memengaruhi perkembangan keluarga gen ini dari waktu ke waktu.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Pengambilan dan Analisis Urutan

Urutan asam amino dan kode nukleotida gen BPIFA1 pada 34 spesies mamalia, termasuk manusia sebagai spesies referensi dalam penelitian ini, dikumpulkan dari GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, diakses pada 20 September 2021), dan diselaraskan menggunakan alat Clustal Omega di perangkat lunak MEGA 6 [24]. Metode kemungkinan maksimum digunakan dalam perangkat lunak MEGA 6 untuk menghasilkan pohon filogenetik untuk gen BPIFA1. Pohon ini dibangun berdasarkan hubungan evolusioner antar gen. Tes bootstrap menghitung jumlah rata-rata penggantian per situs dan rata-rata panjang cabang dengan menggunakan metode kemungkinan maksimum dengan 1000 pengulangan untuk menentukan pengelompokan taksonomi. Metode ini digunakan untuk memilih topologi untuk nilai kemungkinan log yang lebih maju [25,26]. Nama spesies dan nomor aksesi yang digunakan untuk mempelajari gen BPIFA1 disediakan dalam Tabel Tambahan S1.

2.2. Analisis Seleksi

Pendekatan kemungkinan maksimum digunakan untuk membandingkan rasio dN/dS untuk setiap situs kodon untuk mengidentifikasi kodon spesifik dalam sekuens gen BPIFA1 mamalia yang mengalami seleksi positif [27,28]. CODEML dieksekusi di PAML [29] dan server web DATA MONKEY (https://www.datamonkey.org, diakses pada 29 September 2021) [30] digunakan untuk analisis, dan hasilnya ditetapkan menggunakan rasio substitusi kodon yang jauh lebih tinggi dari 1 untuk kodon di bawah seleksi positif. Langkah awal penelitian ini adalah menentukan terjadi atau tidaknya seleksi positif dengan menggunakan uji maximum likelihood ratio.

Analisis ini menentukan keberadaan situs dengan rasio dN/dS lebih besar dari satu. Dalam penelitian ini, kami membandingkan model diskrit (generik) yang menjalankan fungsi ini dengan model nol yang melarang kemunculan situs dengan nilai lebih besar dari 1 [31]. Analisis dibandingkan menggunakan distribusi log kemungkinan (2∆l) dengan df=4. Hipotesis nol (M7) menegaskan bahwa distribusi dibatasi oleh nilai 0 dan 1. Model alternatif (M8) dengan dua parameter, omega (ω) dan beta ( ), memungkinkan penurunan nilai dari dataset, yang mungkin lebih besar dari 1 [27]. Analisis menggunakan kemungkinan efek tetap (FEL), penghitungan leluhur kemungkinan tunggal (SLAC), dan kemungkinan efek acak (REL) semuanya menemukan bahwa gen BPIFA1 tunduk pada seleksi positif ketika nilai global untuk divergensi sinonim dan non-sinonim di setiap lokasi dibandingkan. [32].

Tahap kedua adalah memanfaatkan estimasi probabilitas maksimum untuk menemukan posisi asam amino yang menjadi subjek seleksi positif sepanjang evolusi. Teorema Bayes, yang memprediksi probabilitas posterior dari lokasi yang tunduk pada seleksi positif, digunakan untuk mencapai tujuan ini. Seleksi positif diamati beroperasi di lokasi asam amino dengan probabilitas posterior mulai dari 95 persen hingga 99 persen [33]. Residu asam amino dengan probabilitas tinggi bahwa nilainya lebih besar dari satu menjadi sasaran prosedur selektif. Model Swiss dan Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, diakses pada 28 September 2021) adalah aplikasi berbasis web yang menampilkan lokasi asam amino terpilih pada struktur protein [34].

Kami memperkirakan lokasi konservasi evolusi asam nukleat dan asam amino dalam protein menggunakan alat ConSurf (http://consurftest.tau.ac.il, diakses pada 28 September 2021), yang didasarkan pada hubungan filogenetik antar sekuens [ 35]. Urutan kodon yang disejajarkan dari BPIFA1 diperiksa dalam Selecton versi 2.2 (http://secton.tau.ac.il, diakses pada 28 September 2021), yang memungkinkan penentuan rasio yang bervariasi dari berbagai kodon di dalam sekuens yang disejajarkan. Rasio ini diukur menggunakan pendekatan inferensi Bayesian melalui berbagai uji kemungkinan. Ini dilakukan untuk mengkonfirmasi kodon yang dipilih secara positif [36]. Selain itu, hasil Seleksi ditampilkan dalam berbagai warna untuk menunjukkan berbagai kriteria seleksi.

2.3. Analisis Rekombinasi

Untuk menemukan bukti rekombinasi, kami melakukan prosedur pemilihan model berdasarkan kemungkinan statistik yang dapat menyaring banyak penjajaran urutan untuk mencari breakpoint dan menemukan kemungkinan DNA rekombinan. Teknik ini menggunakan algoritme genetika untuk mencari keberpihakan beberapa sekuens untuk breakpoint rekombinasi untuk mencapai tujuannya. Pendekatan GARD sederhana untuk dipahami, mudah dikembangkan, dan sangat dapat diparalelkan. Eksperimen simulasi ekstensif telah menunjukkan bahwa metode ini mengalahkan alat lain saat ini di hampir semua kasus, terutama dalam hal akurasi.

Untuk menyelidiki bukti rekombinasi, urutan nukleotida pertama dinilai untuk mengidentifikasi haplotipe (Na) dan memperkirakan situs polimorfik (S), jumlah rata-rata perbedaan nukleotida (K), dan keragaman nukleotida (π) menggunakan perangkat lunak DnaSP 5.10 [37 ]. Deteksi breakpoint dan penilaian sinyal rekombinan dalam urutan nukleotida dilakukan dengan menggunakan alat GARD online dari webserver Datamonkey [38]. Selain itu, menggunakan GARD untuk menyaring urutan untuk rekombinasi memastikan bahwa metode yang berfokus pada identifikasi seleksi positif memiliki fitur statistik yang dapat diterima.

2.4. Analisis Interaksi Protein-Protein

Banyak minat telah diarahkan untuk menyelidiki bagaimana interaksi protein-protein diawetkan dari satu spesies ke spesies lainnya. Karena ada beberapa kendala dalam identifikasi eksperimental dan konfirmasi data interaksi, akan menarik untuk memahami PPI yang ditransfer dari spesies yang telah dibuktikan pada spesies lain [39]. Bank data STRING adalah sumber daya bioinformatika gratis yang berisi informasi yang menjelaskan bagaimana protein berinteraksi satu sama lain sebagai bagian dari beberapa jalur. Jumlah garis yang menghubungkan setiap simpul protein dan nilai keantaraan digunakan untuk mengidentifikasi simpul perantara, mewakili protein yang memainkan peran biologis penting dan terkait erat satu sama lain. Pembuatan jaringan dilakukan menggunakan STRING dan perangkat lunak Cytoscape (http://www.cytoscape.org, diakses pada 29 September 2021) digunakan untuk menampilkan jaringan [40]. Dengan mengidentifikasi interaksi protein-protein BPIFA1 di antara protein imun dan analisis koekspresi menggunakan STRING versi 9.1 (http://www.string-db.org, diakses pada 29 September 2021), kami dapat menentukan lebih jauh bagaimana fungsi BPIFA1 pada tingkat molekuler.

2.5. Analisis Struktural Protein BPIFA1

Dalam analisis ini, kami membangun struktur kristal protein BPIFA1 manusia menggunakan pemodelan homologi dengan alat online, seperti model Swiss (http://swissmodel.expasy.org, diakses pada 29 September 2021) [41], I-TESSAR [42], dan Phyre2 (http://www.sbg.bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, diakses pada 29 September 2021) [43]. Metode gradien konjugat dan medan gaya Amber dalam perangkat lunak UCSF Chimera 1.10.1 digunakan untuk mengurangi protein target yang dirakit. Selain itu, server web ProSA digunakan untuk mengevaluasi sifat stereokimia dari struktur yang diharapkan [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com