MicroRNA dalam Perkembangan dan Penyakit Ginjal Ⅱ

Perkembangan ginjal

Ituginjal mamalia(atau metanefros) adalah organ vital yang memainkan peran penting dalamekskresi sisa metabolisme,pengaturan volume cairan ekstraseluler, Danpemeliharaan elektrolitDanhomeostatis asam-basa. Apalagi ginjal menghasilkan hormon penting, sepertieritropoietin, kalsitriol,renin, Danprostaglandin(48). Kapasitas fungsional ginjal berkorelasi dengan jumlah nefron berfungsi yang terbentuk selama perkembangan ginjal sebelum kelahiran, disebut juga nefron endowment. Setiap ginjal manusia rata-rata mengandung 1,000,000 nefron, meskipun jumlah ini sangat bervariasi, dengan perkiraan berkisar antara 200,000 hingga 2,000,{{8 }} nefron (49, 50). Denganpenuaan,hilangnya cadangan nefron fungsionalterjadi seiring waktu (51, 52); oleh karena itu, rendahnya kemampuan nefron saat lahir dikaitkan dengan peningkatan risiko terjadinya hipertensi dan penyakit ginjal kronis (CKD) di kemudian hari (53-55). Selain itu, CAKUT, yang menyebabkan penurunan cadangan nefron dan fungsi nefron, merupakan penyebab utama gagal ginjal pada anak-anak, yang mengakibatkan morbiditas dan mortalitas yang signifikan terkait dengan transplantasi dan dialisis (56, 57). Dengan demikian, pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme seluler dan molekuler yang mendasari pembentukan jumlah nefron dan pembentukan nefron normal memberikan wawasan tentang cara baru untuk memprediksi, mencegah, dan mengobati penyakit ginjal pada masa kanak-kanak.

BERAPA LAMA CISTANCHE BEKERJA UNTUK PASIEN PENYAKIT GINJAL?

Perkembangan ginjal metanefrosdimulai sekitar hari embrio ke 10,5 (E10.5) pada tikus dan sekitar minggu kelima kehamilan pada manusia (58). Menanggapi sinyal induktif dari mesenkim metanefros, tunas ureter memanjang dari ujung ekor saluran Wolffian dan menginvasi ke mesenkim yang berdekatan (Gambar 2). Secara bersamaan, morfogen yang berasal dari tunas ureter menginduksi kondensasi mesenkim metanefros untuk membentuk tutup mesenkim (juga disebut nenek moyang nefron) di sekitar ujung tunas ureter. Ketika nefrogenesis berlangsung, tunas ureter mengalami putaran percabangan, pemanjangan, dan diferensiasi berturut-turut untuk menghasilkan saluran pengumpul ginjal. Subpopulasi nenek moyang nefron mengalami transisi mesenkim-epitel untuk membentuk vesikel ginjal, yang setelah polarisasi dan pemanjangan menjadi struktur tubuh berbentuk koma dan S. Akhirnya, bagian distal badan berbentuk S menyatu dengan saluran pengumpul untuk membentuk nefron fungsional (59-61). Tubuh berbentuk S mengalami diferensiasi lebih lanjut untuk membentuk jenis sel nefron yang matang, selain saluran pengumpul. Sel progenitor stroma Foxd1+ berdekatan dengan progenitor nefron di zona kortikal luar atau zona nefrogenik dari ginjal yang sedang berkembang (Gambar 2) (62). Sinyal dari stroma kortikal diperkirakan menghambat ekspansi sel progenitor nefron dan menstimulasi diferensiasinya, karena ablasi stroma ginjal mengakibatkan gangguan diferensiasi progenitor nefron (63). Sel progenitor Foxd1+ memunculkan semua sel stroma di ginjal metanefros, termasuk sel interstisial kortikal dan meduler ginjal, perisit, fibroblas perivaskular, sel mesangial, dan sel otot polos pembuluh darah (64, 65). Gangguan pada setiap langkah proses ini dapat menyebabkan CAKUT, penyebab utama CKD pada masa kanak-kanak (66, 67).

Nefron matang terdiri dari glomerulus yang bertindak sebagai unit filtrasi dan kompartemen sorpsi belakang tubular yang dibagi lagi menjadi tubulus berbelit-belit proksimal, lengkung Henle, tubulus berbelit-belit distal, dan saluran pengumpul (Gambar 2). Penghalang filtrasi glomerulus (yang terdiri dari endotelium berfenestrasi, membran basal glomerulus, prosesus kaki, dan celah diafragma podosit) memungkinkan filtrasi plasma dan zat terlarut kecil, sekaligus secara selektif menahan protein seperti albumin dan imunoglobulin dalam darah (68, 69). Sementara itu, kompartemen reabsorpsi tubular bertanggung jawab untuk menjaga homeostasis air, reabsorpsi zat terlarut (termasuk natrium, kalium, kalsium, fosfor, magnesium, glukosa, dan banyak lainnya), serta ekskresi asam dan limbah lainnya.

MiRNA di ginjal yang sedang berkembang

Dalam penelitian pada tikus transgenik bersyarat, miRNA telah muncul sebagai pengatur penting morfogenesis ginjal dalam berbagai garis keturunan sel. Studi awal yang mengevaluasi peran fungsional miRNA dalam perkembangan ginjal memanfaatkan penghapusan bersyarat Dicer (70) pada garis keturunan ginjal yang berbeda. Namun, Pemain Dadu juga diketahui memiliki peran yang tidak bergantung pada miRNA (71), yang mempersulit interpretasi model ini. Penghapusan bersyarat dari Dicer pada mesenkim metanefros awal atau progenitor nefron menghasilkan peningkatan apoptosis progenitor nefron, peningkatan kadar protein Bim proapoptosis, dan penghentian dini nefrogenesis (72-75) (Tabel 1). Menariknya, hilangnya ekspresi Bim pada pro genitor nefron yang kekurangan pemain dadu menurunkan apoptosis dan mengembalikan sebagian pembentukan nefron. Dua miRNA yang diekspresikan dalam nenek moyang nefron, miR-17 dan miR-106, diidentifikasi sebagai penekan ekspresi BIM (76). Bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa miRNA mengontrol keseimbangan antara kelangsungan hidup dan apoptosis pada nenek moyang nefron untuk memastikan pembentukan jumlah nefron yang tepat selama nefrogenesis.

Gambar 2. Ilustrasi skema tahapan perkembangan ginjal metanefros. Sinyal dari tunas ureter memicu kondensasi mesenkim metanefros membentuk penutup nenek moyang nefron (cap mesenkim) di sekitar ujung tunas ureter. Mesenkim penutup mengalami transisi mesenkim-epitel untuk membentuk vesikel ginjal, yang berkembang secara berurutan menjadi badan berbentuk koma dan S. Struktur ini terhubung ke tangkai tunas ureter, yang menimbulkan saluran pengumpul. Sel-sel di domain proksimal tubuh berbentuk S berdiferensiasi menjadi sel epitel khusus dari sel ginjal matang (yaitu, podosit dan sel kapsul Bowman), sedangkan sel-sel di bagian tengah dan distal berdiferensiasi menjadi segmen tubular nefron (tubulus proksimal). , lengkung Henle, dan tubulus distal). Dibuat dengan BioRender.com.

Penghapusan bersyarat Dicer pada garis keturunan tunas ureter menghasilkan spektrum kelainan yang sangat mirip dengan CAKUT, termasuk displasia ginjal dan perkembangan kista saluran pengumpul (73, 77, 78). Penghentian dini morfogenesis percabangan (sebagai respons terhadap penurunan ekspresi Wnt11 dan c-Ret dari tunas ureter) kemungkinan merupakan faktor utama yang berkontribusi terhadap displasia ginjal (73). Permulaan pembentukan kista terjadi pada sekitar E15.5 dan berhubungan dengan defek pada panjang silia primer, peningkatan kematian sel apoptosis, dan proliferasi sel yang berlebihan (73). Karena Dicer memiliki peran penting yang tidak bergantung pada miRNA dalam sel, penghapusan bersyarat Dgcr8 telah digunakan untuk mengonfirmasi bahwa fenotip yang diamati dalam model knockout Dicer bersyarat memang merupakan hasil dari hilangnya miRNA. Hewan dengan penghapusan Dgcr8 di nefron distal dan turunan dari saluran pengumpul mengalami hidronefrosis dan kista saluran pengumpul (79), sebuah fenotip mirip CAKUT yang menyerupai hilangnya aktivitas Dicer di garis keturunan tunas ureter.

Studi dari dua kelompok independen menunjukkan bahwa ablasi Dicer dari garis keturunan stroma ginjal Foxd1+ dan turunannya menghasilkan spektrum anomali ginjal, dengan temuan yang konsisten mengenai ginjal hipoplastik, penurunan jumlah glomerulus, maturasi glomerulus abnormal, dan kerusakan pembuluh darah. pola (80, 81). Meskipun kedua kelompok menggambarkan fenotip yang sebagian besar sesuai dengan menggunakan model tikus yang serupa, ada dua perbedaan berbeda yang dicatat. Nakagawa dkk. mengamati kurangnya medula bagian dalam dan papila, serta penurunan zona nefrogenik (80). Sebaliknya, Phua dkk. menunjukkan perluasan populasi nenek moyang nefron dan papilla ginjal yang diawetkan (81). Nakagawa dkk. mengusulkan bahwa cacat ini terkait dengan gangguan pensinyalan jalur Wnt, yang mengakibatkan perubahan dalam migrasi dan proliferasi sel stroma, karena penurunan regulasi miRNA sel stroma, miR-214, miR-199a{{7 }}p, dan miR-199a-3p (80). Studi oleh Phua dkk. menyarankan bahwa perubahan dalam program apoptosis (termasuk peningkatan ekspresi gen efektor Bim dan p53) berkontribusi terhadap cacat fenotipik (81). Dapat dibayangkan bahwa perbedaan latar belakang genetik dan/atau efisiensi rekombinasi yang dimediasi Cre mungkin bertanggung jawab atas perbedaan yang dijelaskan oleh penelitian ini. Namun demikian, fenotip yang dijelaskan konsisten dengan peran multifaset stroma ginjal yang diketahui dalam perkembangan ginjal, dan mekanisme yang mendasari fenotip ini kemungkinan besar rumit mengingat sifat penghapusan Dicer. Penelitian lebih lanjut yang meneliti miRNA spesifik di berbagai subpopulasi stroma diperlukan untuk lebih menentukan mekanisme pengaturan yang berperan.

Penelitian yang lebih baru telah menjawab pertanyaan tentang fungsi miRNA spesifik pada nenek moyang ginjal dan nefron yang sedang berkembang. Menggunakan model sel induk embrio manusia, Bantounas dkk. menunjukkan bahwa penghambatan cluster miR-199a~214 menghasilkan glomeruli dismorfik, tubulus proksimal menyimpang, penurunan ekspresi WT1, dan peningkatan kapiler interstisial pada organoid mirip ginjal (82). Menariknya, penghapusan global miR-210 yang responsif terhadap hipoksia menghasilkan defisit nefron spesifik pria (83). Misalnya, penghapusan bersyarat dari cluster miR-17~92 pada progenitor nefron dan turunannya pada tikus mengganggu proliferasi sel progenitor dan mengurangi jumlah nefron yang sedang berkembang. Akibatnya, tikus mutan mengalami proteinuria, fibrosis ginjal, dan gangguan fungsi ginjal (84). Tingkat gen target miR-17~92 yang tidak teratur, CFTR, terlibat dalam proliferasi sel progenitor yang rusak dan berkurangnya jumlah nefron pada model tikus ini (85).

Urutan RNA kecil (smRNA-Seq) semakin banyak digunakan untuk membuat profil pola ekspresi miRNA dan untuk penemuan spesies miRNA baru. smRNA-Seq dari sel mesenkim nefrogenik E15.5 mengidentifikasi 162 miRNA beranotasi yang diekspresikan secara berbeda dalam populasi sel ini dibandingkan dengan seluruh ginjal dan 49 spesies miRNA baru (86). Menariknya, tingkat miRNA keluarga miR-200 berkurang secara signifikan pada nenek moyang nefron. Mengingat bahwa anggota keluarga miR-200 adalah pengatur utama transisi mesenkim-epitel di saluran pengumpul (87), kami berspekulasi bahwa ekspresi mereka mungkin diatur secara ketat untuk memastikan diferensiasi epitel normal progenitor nefron selama perkembangan ginjal.

Fungsi MiRNA di nefron matang

Selain kebutuhannya selama perkembangan ginjal, miRNA mengatur berbagai proses biologis dalam garis keturunan sel utama yang membentuk nefron matang (69, 88-91). Sesuai dengan ini, ekspresi miRNA spesifik segmen di sepanjang nefron telah dijelaskan, termasuk miR-143 dan miR-195a di glomerulus, miR-107 dan miR{{7} }a di tubulus proksimal, miR-193 dan miR-378a di bagian asendens yang tebal, miR-874 dan miR-155 di tubulus berbelit-belit distal, dan miR{{ 12}}c pada saluran pengumpul (87). Selain itu, studi fungsional di kompartemen nefron dewasa mendukung peran berbeda untuk miRNA.

Tikus yang kekurangan Dicer atau Drosha pada podosit menunjukkan proteinuria, glomerulosklerosis, dan progresi cepat menjadi gagal ginjal, akibat gangguan sawar filtrasi glomerulus (90-93). Analisis in silico mengungkapkan bahwa berbagai transkrip yang diregulasi dalam glomeruli mutan mengandung urutan target untuk anggota keluarga miR-30. Karena keempat anggota keluarga miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d, dan miR-30c{ {9}}) biasanya sangat diekspresikan dalam podosit, miRNA ini mungkin bertanggung jawab atas kelainan podosit dan gangguan penghalang filtrasi glomerulus pada tikus mutan (91).

Agak mengherankan, penghapusan Dicer dari tubulus proksimal mamalia pascakelahiran tidak mempengaruhi perkembangan, histologi, atau fungsi ginjal tetapi melindungi terhadap cedera iskemia/reperfusi ginjal. Tikus mutan menunjukkan fungsi ginjal yang lebih baik, mengurangi cedera ginjal, apoptosis tubular yang lebih rendah, dan meningkatkan kelangsungan hidup dibandingkan dengan tikus WT (94). Hal ini mungkin mencerminkan "jumlah" efek penghapusan beberapa miRNA di tubulus proksimal, karena penelitian lain telah menunjukkan bahwa ekspresi miRNA spesifik bersifat protektif pada cedera iskemia/reperfusi ginjal (misalnya, miR-16 dan miR-21; referensi 95, 96); sedangkan yang lainnya merugikan (misalnya, miR-182; ref. 97).

Meskipun miRNA tampaknya tidak diperlukan untuk fungsi tubulus proksimal, namun penting untuk nefron distal dan homeostasis saluran pengumpul (79, 88, 98). Mengumpulkan inaktivasi spesifik saluran dari Dicer dan gen penting terkait biogenesis miRNA lainnya (termasuk Dgcr8, Ago1, 2, 3, dan 4) menyebabkan gagal ginjal pada tikus dewasa karena fibrosis tubulointerstitial progresif dan peradangan interstitial (88). Hal ini didahului oleh transisi parsial epitel-mesenkim (EMT) pada sel saluran pengumpul, dan penurunan regulasi anggota keluarga miR-200, yang menghambat EMT (88). Demikian pula, ablasi Dicer atau Dgcr8 dari nefron distal dan turunan tunas ureter, masing-masing, mengakibatkan kelainan ginjal dan gagal ginjal (78, 98), yang pada akhirnya terkait dengan penurunan regulasi anggota keluarga miR-200 (98). Peningkatan ekspresi gen target miR-200 Pkd1 pada tikus mutan ini mengganggu tubulogenesis dan menghasilkan struktur seperti kista (98). Perbedaan kebutuhan miRNA fungsional di tubulus proksimal dan nefron distal/saluran pengumpul mungkin dijelaskan oleh distribusi segmental miRNA sepanjang nefron dan saluran pengumpul di ginjal WT (88).

Penghapusan Dicer pada sel-sel yang mensekresi renin pada aparatus juxtaglomerular mengakibatkan defisit sel-sel juxtaglomerular, penurunan kadar renin dalam sirkulasi yang mengakibatkan penurunan tekanan darah arteri, penurunan fungsi ginjal, pola fibrosis interstisial yang bergaris, dan kelainan pembuluh darah (89). Pengurangan sel juxtaglomerular menunjukkan kebutuhan miRNA matang dalam mempertahankan fenotipnya. Kemudian, miR-330 dan miR-125b-5p diidentifikasi sebagai kandidat potensial yang masing-masing menghambat atau meningkatkan fenotip otot polos sel juxtaglomerular (99).

Bidang penelitian aktif lainnya mengenai miRNA pada cedera ginjal akut (8-10), penyakit ginjal polikistik (11), dan transplantasi ginjal (10), telah dibahas secara komprehensif dalam ulasan terbaru lainnya.

MiRNA pada penyakit ginjal anak Pada bagian ini, kami memberikan gambaran umum tentang peran miRNA dalam perkembangan penyakit ginjal, termasuk tumor CAKUT dan Wilms. CAKUT merupakan salah satu bentuk malformasi saat lahir yang paling sering terjadi, mempengaruhi sekitar 3–7 dari 1000 kelahiran hidup (100). Gangguan pada ginjal dan perkembangan saluran kemih bagian bawah menyebabkan spektrum manifestasi klinis yang luas pada CAKUT, termasuk anomali ginjal (yaitu agenesis ginjal, hipoplasia dan displasia ginjal, dan ginjal displastik multikistik), anomali ureteropelvic (obstruksi sambungan ureteropelvis), sistem pengumpulan duplex, dan anomali kandung kemih dan uretra (101-103). Heterogenitas fenotipik ini kemungkinan besar disebabkan oleh interaksi kompleks antara faktor genetik, epigenetik, dan/atau lingkungan prenatal yang memengaruhi perkembangan ginjal dan saluran kemih bagian bawah, yang mengakibatkan CAKUT (101). Sebagian besar pengetahuan kita saat ini tentang patogenesis CAKUT berasal dari model tikus dan bentuk sindrom CAKUT. Studi-studi ini telah mengarah pada identifikasi beberapa gen CAKUT, banyak di antaranya terlibat dalam perkembangan awal ginjal, termasuk PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2, dan lainnya (101, 104, 105). Namun, mutasi tunggal atau varian nomor salinan pada gen pengkode protein tidak menjelaskan sebagian besar kasus CAKUT (~80%) (101, 106).

Seperti disebutkan di atas, penipisan miRNA matang dari garis keturunan sel berbeda dari ginjal yang sedang berkembang pada model tikus menghasilkan kelainan ginjal yang menyerupai CAKUT manusia (73, 74, 78, 79). Selain itu, penghapusan germline MIR17HG, yang mengkode cluster miR-17~92, menyebabkan sindrom Feingold tipe 2 pada manusia (107). Meskipun fenotip ginjal pada pasien sindrom Feingold tipe 2 dengan mutasi MIR17HG masih belum terdefinisi, 18% kejadian CAKUT telah dilaporkan pada kasus sindrom Feingold yang terkait dengan mutasi MYCN (108, 109). Bersama-sama, pengamatan ini menunjukkan bahwa mutasi pada miRNA yang diekspresikan selama perkembangan ginjal dapat menyebabkan CAKUT pada manusia, terutama karena banyak miRNA yang sangat terkonservasi antara tikus dan manusia.

Untuk menguji hipotesis ini, sebuah penelitian menyelidiki 1.248 pasien dengan CAKUT nonsindromik dari 980 keluarga dan mencari mutasi di 96 daerah stem-loop dari 73 gen miRNA perkembangan ginjal (106). Dalam kelompok ini, 31 individu dengan 17 varian nukleotida tunggal berbeda yang mempengaruhi 16 gen miRNA berbeda diidentifikasi. Di antaranya, dua varian baru pada miRNA ditemukan berpotensi bersifat patogen. MIR19B1 (anggota cluster miR-17~92) dikaitkan dengan adanya agenesis ginjal kanan, dan MIR99A dikaitkan dengan refluks vesikoureteral parah dan ptosis ginjal. Jumlah kandidat varian patogen yang sangat rendah ini sebagian disebabkan oleh keterbatasan penelitian ini, karena analisis tersebut hanya memperhitungkan mutasi pada gen miRNA yang dimasukkan dalam pendekatan kandidat gen dan tidak mendeteksi variasi jumlah salinan dan penataan ulang DNA yang besar (106) .

Dalam pendekatan alternatif, segmen ureter dari pasien dengan berbagai CAKUT dianalisis untuk ekspresi transkrip diferensial melalui microarray, untuk mengetahui adanya target miRNA yang diprediksi secara bioinformatika, dan miRNA matang melalui qPCR (110). Dengan menggunakan pendekatan multi-cabang ini, tujuh miRNA diidentifikasi dengan peran potensial dalam CAKUT, dan di antaranya, has-miR-144 meningkat secara signifikan pada pasien dengan CAKUT. Analisis ontologi gen menunjukkan bahwa gen target has-miR-144 yang diprediksi berkontribusi terhadap proses biologis yang terlibat dalam perkembangan CAKUT, termasuk perkembangan tabung (22 gen target), perkembangan sistem urogenital (18 gen target), perkembangan ginjal (14 gen target) , dan perkembangan organ embrio (18 gen target) (110).

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menentukan mekanisme molekuler yang mendasari peran patogen miRNA di CAKUT. Temuan dari penelitian tersebut akan sangat penting dalam meningkatkan perawatan pasien dengan CAKUT dan mencegah perkembangan mereka menjadi CKD, memberikan konseling genetik yang tepat untuk pasien dan keluarga mereka, dan mengembangkan strategi terapi baru.