Aktivitas Penghilang Warna Melanin Enzim Antioksidan, Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, Dan Katalase

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Gyeongchan Jeon¹· Chinhan Kim²· Uk Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Jiho Min¹

Abstrak

Melanin adalah faktor terpenting untuk menentukan warna kulit. Banyak upaya penelitian sedang dilakukan untuk menguraikan senyawa melanin yang sudah diproduksi di kulit untuk kecantikan. Penelitian ini meneliti pengaruh penurunan warna melanin dari ketiga enzim antioksidan, Glutathione peroxidase (GPX), Thiol peroxidase (TPX), dan Katalase, pada fraksi lisosom. Larutan melanin direaksikan dengan enzim dan hidrogen peroksida, kemudian direaksikan selama 48 jam. GPX dan TPX menghilangkan warna melanin, dan di antara keduanya, GPX lebih efisien, tetapi Katalase tidak efektif. GPX juga menghambat produksi melanin dalam sel melanoma B16F10. GPX, yang hadir di hampir semua mikroorganisme, memainkan peran penting dalam mekanisme pertahanan seluler oleh spesies oksigen reaktif. Selain itu, tidak sitotoksik tetapi secara signifikan efektif dalam menghilangkan warna melanin. Oleh karena itu, dalam bidang biologi dan mikrobiologi, kemungkinan pemanfaatannya dalam kosmetik pemutih kulit sangat tinggi.

Kata kunci Melanin · Glutathione peroksidase (GPX) · Thiol peroksidase (TPX) · Katalase · B16F10 · Lisosom

Cistanche adalah bahan pemutih kulit.

pengantar

Wajah yang bersih merupakan salah satu elemen penting kecantikan bagi masyarakat modern, terutama orang Asia yang antusias dengan kulit putih. Senyawa melanin merupakan faktor terpenting dalam menentukan warna kulit. Ini dibedakan dari eumelanin yang berwarna hitam atau coklat, dan pheomelanin yang menghasilkan rona merah muda hingga merah [1]. Senyawa melanin disintesis oleh oksidasi tirosin dalam sel melanosit, yang ditemukan di lapisan basal epidermis; dan peran utama pigmen ini di kulit adalah untuk melindungi dermis dengan menghalangi radiasi ultraviolet yang berbahaya [2, 3]. Namun, jika terlalu banyak senyawa melanin yang ada di kulit, membuat kulit menjadi gelap dan tidak bersih, serta dapat menyebabkan hiperpigmentasi, seperti melasma [4].

Telah banyak penelitian yang berkaitan dengan kosmetik perawatan kulit yang memecahkan masalah tersebut, namun sebagian besar kosmetik pemutih kulit yang dikembangkan saat ini memiliki fungsi untuk menghambat sintesis melanin melalui beberapa mekanisme, seperti menghalangi oksidasi tirosin, atau sinar UV yang dapat mempromosikan sintesis melanin [5]. Produk-produk ini membutuhkan waktu lama untuk menjadi efektif, dan tidak efektif untuk gejala tertentu, seperti hiperpigmentasi [6]. Saat ini, metode khas untuk menghilangkan melanin yang telah dibuat adalah perawatan laser [7]. Jika bahan yang dapat memecahkan masalah ini tanpa prosedur tersebut dikembangkan, mereka akan memiliki kegunaan yang besar di bidang biologi dan kosmetik.

Dalam penelitian sebelumnya, kami mencoba menemukan cara untuk menghilangkan warna senyawa melanin yang sudah diproduksi. Telah ada laporan penelitian mengenai korelasi lisosom dan melanin. Sangat mungkin bahwa keratinosit yang berdiferensiasi terutama mendegradasi melanosom ekstrinsik sesuai dengan jenis fungsi autophagy dasar yang mengontrol jumlah organel seluler, atau menghilangkan organel yang rusak, seperti peroksisom [8]. Jalur autophagic, dari sitoplasma ke lisosom, memainkan peran penting dalam degradasi melanosom di epidermis manusia keratinosit [9]. Data ini memberikan bukti bahwa enzim spesifik lisosom berkontribusi terhadap degradasi melanin. Sebelumnya, kami menemukan aktivitas enzim pengurangan warna melanin dalam fraksi lisosom, kompleks yang mengandung hidrolisat untuk memecah bahan limbah dan puing-puing seluler di peroksisom dan lisosom [10, 11]. Makalah ini mempelajari efek dari tiga enzim yang dipilih, Glutathione peroksidase, Thiol peroksidase, Katalase, dalam fraksi lisosom untuk mengurangi warna melanin. Peroksidase ini berfungsi untuk mempertahankan diri dari kerusakan sel yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif (ROS), dan terdapat pada semua eukariota [12].

Spesies oksigen reaktif (ROS) terbentuk sebagai produk sampingan alami dari metabolisme normal oksigen dalam sel, dan dapat ditingkatkan oleh tekanan lingkungan. ROS yang dihasilkan sangat tinggi dapat merusak sel. Efek berbahaya ROS pada sel adalah sebagai berikut [12, 13]: kerusakan DNA atau RNA, oksidasi asam lemak tak jenuh ganda dalam lipid, oksidasi asam amino dalam protein, dan penonaktifan oksidatif enzim tertentu dengan oksidasi kofaktor. Sel menetralkan ROS oleh sistem antioksidan untuk mencegah kerusakan jaringan tersebut. Dalam sistem ini, ion superoksida yang dihasilkan oleh metabolisme sangat merusak; meskipun diubah menjadi hidrogen peroksida oleh Superoksida dismutase (SOD), hidrogen peroksida masih reaktif. Hidrogen peroksida diubah menjadi H2O oleh Katalase, dan dikonsumsi dalam produksi Glutathioneedisulfide (GSSG) dari Glutathione dengan katalisis GPX. TPX bekerja mirip dengan GPX [13].

Penelitian ini meneliti efek penghilangan warna melanin dari tiga enzim antioksidan yaitu GPX, TPX, dan Katalase. Hasilnya, GPX dan TPX efektif dalam mengurangi warna melanin. Di antara mereka, GPX tidak memiliki sitotoksisitas pada konsentrasi optimal aktivitas penghilangan warna melanin, dan secara efektif menghambat sintesis melanin. Oleh karena itu, memberikan bukti bahwa GPX memainkan peran penting dalam mekanisme dekolorisasi melanin fraksi lisosom, tidak hanya aktivitas antioksidan, dan menawarkan potensi agen kosmetik pemutih baru sebagai enzim tunggal.

Bahan dan metode

Uji Aktivitas Peroksidase dan Peroksidase

Konsentrasi tiga peroksidase (Glutathione Peroxidase, Thiol Peroxidase, dan Catalase) ditentukan dengan kit uji (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChromTM) yang dibeli dari Bioassay Systems. Glutathione peroxidase 2(GPX2, NBP1-78,824, Novus) dan Thiol peroxidase (TPX,NBP1-78,805, Novus) dibeli dari Novus, dan Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich ) dibeli dari Sigma-Aldrich.

Kit uji ini menggunakan H2O2 dan pewarna donor elektron yang membentuk resorufin selama peroksidase. Pengujian dilakukan pada suhu kamar (RT), dan intensitas warna diukur pada 570 nm. Peroksidase direaksikan dengan pewarna donor elektron dengan hidrogen peroksida 0,6 persen selama 10 menit di RT. Setelah reaksi, stop reagen ditambahkan, dan absorbansi sampel diukur dengan spektrofotometri lempeng mikro. Kegiatan tersebut dihitung sebagai berikut:

Aktivitas peroksidase=RSAMPLE RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reaksi Vol(𝜇L)RRESORUFIN RH2 O t(min) Sampel Vol(𝜇L)

(U/L). Satu unit (U) enzim akan mengkatalisis pembentukan 1 mol resorufin per menit pada kondisi pengujian. Di sini RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN, dan RH2O masing-masing adalah absorbansi Sampel, Blanko Sampel, Resorufin, dan Air; dan n adalah faktor pengenceran sampel. [Resorufin] untuk pengujian ini adalah 50 M. Vol Reaksi adalah 100μL, dan Vol Sampel dalam penelitian ini adalah 10 L.

Dekolorisasi Melanin oleh Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), dan Katalase

Larutan melanin mengandung {{0}}.1 mM PBS (Phosphatebuffered saline, pH: 7.0) dan bubuk melanin (Synthetic,Sigma) yang dibuat dengan oksidasi tirosin dengan hidrogen peroksida. Kandungan melanin diukur dengan absorbansi pada 450 nm. Untuk menentukan konsentrasi melanin, kurva standar dibuat dari standar otentik melanin sintetis (R2=0.999, data tidak ditampilkan).

Untuk memverifikasi dekolorisasi melanin, 100 ppm larutan melanin yang mengandung (50 hingga 1000) U/L Peroksidase (GPX,TPX, Katalase) dengan 1 mM hidrogen peroksida direaksikan pada RT, dan diukur setiap hari. Nilai dekolorisasi melanin ditentukan dengan mengurangi konsentrasi melanin setelah reaksi, dari nilai awal.

Cistanche menghambat sintesis melanin.

Budaya sel

Sel melanoma tikus B16F10 (KCLB 80008) dibeli dari Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Sel-sel dikultur dalam Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) yang mengandung 4500 mg/L glukosa, 4 mM l-glutamin, 1 mM natrium piruvat, yang ditambahkan 10 persen serum janin sapi (FBS), 20 mM HEPES, 1 persen penisilin, dan sel-sel diinkubasi dalam kondisi lembab yang mengandung 5 persen CO2 pada 37 derajat. Media diganti setiap 2 hari (d), dan sel dipanen dengan menggunakan larutan tripsin/EDTA.

Uji Viabilitas Sel (Uji MTT)

Efek toksik glutathione peroksidase pada sel melanoma B16F10 dikonfirmasi dengan uji MTT, metode umum yang digunakan untuk menentukan efek sampel pada viabilitas sel yang melekat. Pengujian ini menggunakan 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) yang dapat direduksi menjadi formazan oleh mitokondria enzim dalam sel hidup. Sel-sel 3 × 103 diunggulkan per sumur dalam pelat sumur 96-, dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian sampel ditambahkan ke setiap sumur, dan diinkubasi selama 72 jam. Setelah itu, media ditukar dengan media yang mengandung 0,5 mg/mL MTT, dan diinkubasi selama 2 jam. Selanjutnya, reagen pewarna MTT dihilangkan, dan formazan yang dihasilkan dilarutkan dengan DMSO selama 30 menit. Akhirnya, konsentrasi formazan diukur pada 570 nm menggunakan spektrofotometri lempeng mikro. Viabilitas sel dihitung sebagai berikut: viabilitas sel ( persen )=(Contoh Ablank)/(Acontrol Ablank)*100.

cistanche dalam bahasa Hindi

Uji Kandungan Melanin

Sel-sel B16F10 3 × 105 diunggulkan per sumur dalam pelat sumur 6-, dan diinkubasi selama 24 jam untuk melekat. Media masing-masing sumur ditukar dengan satu yang berisi berbagai konsentrasi enzim dan 10 nM -MSH, kemudian diinkubasi selama 72 jam. Setelah itu, semua sumur dicuci dengan buffer DPBS, dan dipanen menggunakan larutan tripsin/EDTA 0,5 persen. Pelet sel yang diperoleh melalui sentrifugasi dilisiskan dengan 200 L NaOH 1 N yang mengandung 10 persen DMSO selama 1 jam pada suhu 80 derajat . Akhirnya, kandungan melanin yang dilisiskan diukur dengan absorbansi pada 450 nm. Efisiensi penghambatan produksi melanin enzim ditentukan dengan perbandingan dengan kontrol positif menggunakan arbutin 100 mg/mL.

Hasil

Aktivitas Peroksidase Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), dan Katalase

Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dari penerapan perlakuan fraksi lisosom untuk penghilangan warna senyawa melanin secara in vitro dan in vivo. Pada penelitian sebelumnya, kami menemukan bahwa fraksi lisosom yang diisolasi dari sel Hela, S. cerevisiae, telur ayam memiliki efek mengurangi warna melanin, danefisiensi dekolorisasi melanin dikaitkan dengan aktivitas peroksidase dari fraksi lisosom yang tidak terikat membran fraksi mikrosom, termasuk lisosom dan peroksisom. Untuk mengkonfirmasi efek pengurangan warna melanin peroksidase, tiga peroksidase dipilih, Glutathione peroksidase (GPX), Thiol peroksidase (TPX), dan Katalase. Enzim-enzim ini berperan penting dalam mengurangi stres oksidatif yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif dalam sel [14].

Aktivitas enzim ini ditentukan dengan kit uji (Peroksidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™). Metode ini didasarkan pada oksidasi pewarna donor elektron yang membentuk warna merah muda selama reaksi peroksidase [15]. Aktivitas peroksidase dinyatakan dengan menggunakan unit berikut: 1 Unit=1 U=pembentukan 1 mol resorufin per menit di bawah kondisi pengujian. Tabel 1 merangkum aktivitas dan konsentrasi tiga peroksidase, GPX, TPX, dan Katalase.

Aktivitas Dekolorisasi Melanin Glutathione Peroxidase (GPX), Thiol Peroxidase (TPX), dan Katalase

Untuk mengkonfirmasi efek dekolorisasi melanin dari peroksidase, larutan melanin 100 ppm diperlakukan dengan 1 mM hidrogen peroksida dan (50 sampai 1000) konsentrasi U/L dari setiap peroksidase. Sampel direaksikan selama 2 hari di RT, kemudian dibandingkan dengan konsentrasi awal. Gambar 1 menunjukkan penurunan melanin setelah 48 jam. Gambar 1 menunjukkan bukti bahwa TPX dan GPX memiliki aktivitas dekolorisasi melanin. Katalase tidak berpengaruh pada pengurangan warna melanin (Gbr. 1a). TPX efektif dalam menghilangkan warna senyawa melanin, dan efisiensinya paling baik bila diperlakukan pada konsentrasi 1 U/mL (Gbr. 1b). GPX juga memiliki aktivitas pengurangan warna melanin, yang terbaik pada konsentrasi 0,2 U/mL, dan secara bertahap menurun pada konsentrasi yang lebih tinggi (Gbr. 1c). Nilai ini mewakili 175 persen pengurangan warna melanin yang lebih baik, dibandingkan dengan kontrol yang hanya diberi hidrogen peroksida. GPX lebih efisien dalam hal konsentrasi dan aktivitas peroksidase, dibandingkan dengan TPX. Perlakuan 0,2 U/mL GPX dan 1 mM hidrogen peroksida untuklarutan melanin menghilangkan warna 13 persen dari 100 ppm melanin selama 4 hari (Gbr.2). Namun, baik GPX maupun TPX tidak menunjukkan efek pengurangan warna apa pun di bawah tidak adanya hidrogen peroksida (data tidak ditampilkan).

Tabel1 Data spesifik enzim, Glutathione Peroxidase 2, Thiol Peroxidase dan Katalase

Pengaruh Glutathione Peroxidase (GPX) dan H2O2 pada Viabilitas Sel B16F10

Pengaruh GPX pada kelangsungan hidup sel melanoma B16F10 dikonfirmasi dengan uji MTT, sebelum uji penghambatan sintesis melanin. Untuk menemukan konsentrasi hidrogen peroksida yang tepat untuk pengobatan, sitotoksisitas dinilai dengan pengobatan dengan hidrogen peroksida selama 72 jam pada konsentrasi yang berbeda. Di bawah konsentrasi 0.1 mM, H2O2 tidak memiliki toksisitas sel terhadap sel selama 72 jam, sedangkan pada konsentrasi di atas 1 mM, toksisitas besar diamati. (Gbr. 3a). Pengaruh GPX pada kelangsungan hidup sel kemudian dinilai dengan adanya 0.1 mM hidrogen peroksida, yang tidak sitotoksik. GPX tidak memiliki sitotoksisitas terhadap sel B16F10 di bawah konsentrasi 0,5 U/mL, yang efektif dalam studi dekolorisasi melanin (Gbr. 3b).

Gambar 1Pengurangan warna melanin relatif dibandingkan dengan hanya memperlakukan hidrogen peroksida.

Pengaruh Glutathione Peroxidase (GPX) dan H2O2 Terhadap Sintesis Melanin Pada Sel Melanoma B16F10

Kami meneliti efek GPX, yang paling efektif pada dekolorisasi melanin, pada sintesis melanin di mel-anosit. Gambar 4 menunjukkan kandungan melanin dalam sel melanoma B16F10yang diobati dengan setiap sampel selama 72 jam. Perlakuan dengan 0.05 U/mL GPX dan 0,1 mM H2O2 menginduksi penghambatan melanogenesis paling banyak sebesar 43 persen dibandingkan dengan kontrol (hanya pengobatan dengan -MSH). Ini adalah 153 persen lebih tinggi dari kontrol positif (pengobatan dengan Arbutin dan -MSH), dan 22 persen lebih tinggi dari hidrogen peroksida tanpa enzim, sedangkan pengobatan GPX tidak menunjukkan pengurangan melanin yang dramatis tanpa adanya hidrogen peroksida juga mendukung pandangan ini. (data tidak ditampilkan). Akibatnya, GPX menghambat produksi senyawa melanin, tetapi sintesis melanin dalam sel lebih dipengaruhi oleh hidrogen peroksida daripada oleh GPX.

Diskusi

Dalam penelitian ini, peneliti kami menemukan konsentrasi optimal dan efek GPX, TPX, dan Katalase, enzim antioksidan yang mengurangi stres oksidatif dalam sel, pada dekolorisasi senyawa melanin. Sebagai hasil dari eksperimen ekstraseluler menggunakan senyawa melanin yang disintesis, GPX dan TPX memiliki efek penghilangan warna melanin, tetapi katalase tidak. Ada laporan bahwa enzim pendegradasi lignin dalam beberapa jamur, seperti lakase, lignin peroksidase, dapat memecah melanin dengan adanya hidrogen peroksida [16-18]. Melalui penelitian ini, dikonfirmasi bahwa enzim antioksidan, yang ada di semua eukariota dan bukan enzim pendegradasi lignin, memiliki aktivitas penghilangan warna melanin. Meskipun GPX dan TPX juga dapat mengurangi warna melanin dengan adanya hidrogen peroksida, enzim ini memiliki kemungkinan bertindak sebagai komponen utama dari mekanisme dekolorisasi melanin dari fraksi lisosom.

GPX, yang paling efektif untuk mengurangi warna melanin secara in vitro, diobati dengan sel melanoma B16F10 untuk menentukan pengaruhnya terhadap sintesis melanin. Dalam sel melanoma B16F10, GPX tidak sitotoksik pada konsentrasi yang efektif dalam penghilangan warna senyawa melanin, dan konsentrasi hidrogen peroksida yang diperlakukan bersama adalah 0,1 mM, tanpa toksisitas. Pengobatan hidrogen peroksida sangat menghambat sintesis melanin, dan ketika bekerja dengan GPX, efisiensinya lebih baik, sementara tidak ada ketergantungan konsentrasi obat. Karena hidrogen peroksida cepat dikonsumsi oleh enzim, dapat diartikan bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim yang akan diolah, semakin rendah penghambatan sintesis melanin oleh hidrogenperoksida. Fakta bahwa pengobatan GPX tidak menunjukkan pengurangan melanin yang dramatis tanpa adanya hidrogen peroksida juga mendukung pandangan ini (data tidak ditampilkan). Akibatnya, GPX menghambat produksi senyawa melanin, tetapi sintesis melanin dalam sel lebih dipengaruhi oleh hidrogen peroksida daripada oleh GPX. Hasil ini menunjukkan bahwa enzim antioksidan menginduksi degradasi melanin dalam mekanisme autophagy yang mencerna melanosom.

tablet cistanche

Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik di sini.

Kesimpulan

Studi kami menunjukkan bahwa Glutathione peroxidase (GPX) dan Thiol peroxidase (TPX) berkontribusi pada dekolorisasi melanin, dan GPX secara efektif menghambat sintesis melanin. Hasil mendukung hipotesis bahwa enzim antioksidan menginduksi degradasi melanin dalam mekanisme autophagy yang mencerna melanosom. Untuk mencapai kesimpulan yang pasti, studi tentang mekanisme pencernaan melanosom pada sel kulit, keratinosit, dan melanosit, mungkin diperlukan.