Penemuan Dan Identifikasi Potensi Konstituen Aktif Anti-melanogenik Bletilla Striata

{0}}

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 dan Hongjiang Chen1,2*

Abstrak

Latar belakang:Bletilla striata adalah obat utama dari banyak formula klasik pemutih kulit dalam pengobatan tradisional Cina (TCM) dan banyak digunakan dalam industri kosmetik baru-baru ini. Namun, bahan aktifnya masih belum jelas dan akar berseratnya tidak digunakan secara efektif. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menemukan dan mengidentifikasi potensi konstituen aktif anti-melanogenik dengan model ikan zebra dan docking molekuler.

Metode:Ituantioksidanaktivitas dievaluasi oleh 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) aktivitas pemulungan radikal, 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS ) aktivitas pemulungan radikal dan reduksi besiantioksidanuji daya (FRAP). Aktivitas anti-melanogenik dinilai dengantirosinasepenghambatanaktivitasin vitro dan penghambatan melanin pada ikan zebra. Profil kimia dilakukan dengan kromatografi cair kinerja sangat tinggi yang dikombinasikan dengan spektrometri massa tandem waktu terbang quadrupole (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Sementara itu, potensi konstituen aktif anti-melanogenik sementara diidentifikasi dengan docking molekuler.

Hasil:Ekstrak etanol 95 persen akar serabut (EFB) B. striata memiliki aktivitas penghambatan DPPH, ABTS, FRAP dan tirosinase paling kuat, dengan IC50 5.94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, dan 58,92 mg/L, masing-masing. Selain itu, EFB dan ekstrak etanol 95 persen umbi B. striata (ETB) secara signifikan mengurangi sintesis melanin dari embrio ikan zebra dengan cara yang bergantung pada dosis. 39 komposisi kimia, termasuk 24 stilbenoid secara tentatif diidentifikasi dari EFB dan ETB. Docking molekuler menunjukkan bahwa ada 83 (termasuk 60 stilbenoids) dan 85 (termasuk 70stilbenoids) senyawa menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih kuat terhadap tirosinase dan adenilat siklase.

Kesimpulan:Temuan ini mendukung alasan penggunaan EFB dan ETB sebagai bahan pemutih kulit alami dalam industri farmasi dan kosmetik.

Kata kunci: Bletilla striata, Antioksidan, Aktivitas antimelanogenik, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Molecular docking

Klik untuk melihat efek samping dan manfaat antioksidan

Latar belakang

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. merupakan tanaman herba tahunan yang tersebar luas di Asia, seperti Cina, Korea, dan Jepang [1]. Umbi kering B. striata, juga dikenal sebagai Baiji, pertama kali dicatat dalam Materia Medica Klasik Shennong, telah digunakan secara luas sebagai pengobatan tradisional Tiongkok (TCM) selama ribuan tahun di Tiongkok. Farmakope Cina menyatakan bahwa ia memiliki kemampuan astringency pada hemostasis dan analgetik, oleh karena itu, itu banyak digunakan untuk pengobatan hematemesis, hemoptisis, perdarahan traumatis, bisul, pembengkakan dan kulit pecah-pecah [2, 3]. Studi farmakologis menunjukkan bahwa B. striata memiliki spektrum aktivitas biologis yang luas, seperti penyembuhan luka [4, 5], antiulkus [6, 7], hemostatik [8],anti-peradangan[9], antioksidan[10], antibakteri [11], anti-virus influenza [12], dan antipenuaan [13]. Pada saat yang sama, B. striata mengandung berbagai kelas komposisi kimia, termasukpolisakarida[14], bibenzil, fenantrena, antrakuinon,flavonoid, dan 2-isobutilmalat [3, 15], dll.

B. striata adalah obat utama dari banyak formula klasik pemutih kulit dalam TCM [16] dan belakangan ini banyak digunakan dalam industri kosmetik [17]. Namun, bahan aktifnya masih belum jelas dan bahkan beberapa hasil penelitian bertentangan. Misalnya, hasil penelitian yang diberikan oleh Chenet al. menunjukkan bahwa 95 persen ekstrak etanol B. striata memiliki aktivitas penghambatan tirosinase yang lebih tinggi daripada ekstrak airnya dengan tingkat penghambatan 68,36 persen secara in vitro[18], sedangkan hasil dari Huang et al. menunjukkan bahwa aktivitas hambat ekstrak air B. striata terhadap tirosinase lebih kuat dibandingkan ekstrak etanol 95 persen dengan laju hambat 62 persen in vitro [19]. Hasil penelitian Luetal.[20]dan Linghuetal.[21]menunjukkan bahwa baik air maupun ekstrak etanol 95 persen B. striata, terutama fraksinasi kloroformnya, dapat menghambat pertumbuhan sel B16 dan menginduksi apoptosisnya dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.

Karena tes in vitro dari penghambatan tirosinase dan garis sel melanoma, tidak melibatkan kondisi fisiologis kompleks in vivo, dan penyerapan, metabolisme, distribusi dan ekskresi sampel uji, banyak sampel menunjukkan aktivitas penghambatan yang signifikan terhadap garis sel tirosinase dan melanoma di vitro, bagaimanapun, menunjukkan efektivitas yang lemah atau bahkan tidak efektif secara in vivo [22,23]. Glabridin menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase yang signifikan dengan IC50 0.43μmol/L, yang 176 kali lebih kuat daripada asam kojic. Namun demikian, itu tidak ada efek penghambatan pada pigmentasi ikan zebra in vivo [24].

Sedangkan akar serabut (FB) B. striata merupakan hasil samping yang dihasilkan selama proses pengolahan B. striatatuber (TB). Penelitian modern menunjukkan bahwa FB mengandung senyawa yang mirip dengan TB dan dengan kandungan fenolik yang lebih tinggi [25]. Selain itu, aktivitas antibakteri [26], antioksidan dan anti-tirosinase ekstrak FB lebih kuat dibandingkan ekstrak TB [25]. Namun, sumber daya FB tidak digunakan secara efektif dan ditinggalkan di lahan pertanian, yang menyebabkan pemborosan sumber daya FB dan pencemaran lingkungan [27].

Zebrafish (Danio rerio), ikan air tawar tropis kecil, adalah model hewan yang muncul untuk farmakologi

dan penelitian toksikologi in vivo, dengan banyak keuntungan termasuk biaya rendah, siklus hidup pendek, transparansi tinggi, mudah dirawat, kesuburan tinggi, dan sampel uji yang dibutuhkan lebih sedikit [28, 29]. Selain itu, ikan zebra memiliki pigmen melanin di permukaan, memungkinkan pengamatan sederhana dari proses pigmentasi, dan banyak digunakan dalam studi anti-melanogenik [28, 30].

Dalam penelitian ini, kami membandingkan aktivitas penghambatan antioksidan dan tirosinase dari polysaccha-ride mentah dan ekstrak etanol 95 persen TB dan FB in vitro, dan aktivitas anti-melanogenik dalam model ikan zebra. Sementara itu, konstituen aktif anti-melanogenik potensial sementara diidentifikasi dengan docking molekuler. Kami menemukan bahwa 95 persen ekstrak etanol TB (ETB) dan FB (EFB) memiliki aktivitas antioksidan dan anti-tirosinase yang signifikan, dan dapat mengurangi sintesis melanin pada embrio ikan zebra dengan cara yang bergantung pada dosis. Dengan demikian, ETB dan EFB dapat digunakan sebagai bahan pemutih kulit alami dalam industri farmasi dan kosmetik.

Metode

Bahan kimia dan reagen

Tirosinase, 3-(3,4-dihidroksifenil)-L-alanin(L-DOPA) dan arbutin dibeli dari perusahaan reagen Aladdin (Shanghai, Cina).2,2-difenil{{8 }}pikrilhidrazil (DPPH), 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS),6-hidroksi-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-asam karboksilat (Trolox), dan 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Asetonitril dan metanol (kelas HPLC) dibeli dari Tedia (Fairfield, OH, USA). Air deionisasi disiapkan oleh sistem air Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Prosedur pengumpulan dan ekstraksi tanaman

B. striata dikumpulkan dari Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou,Zhejiang, China). Spesimen voucher disimpan di Herbarium Perguruan Tinggi Farmasi Zhejiang (Nomor Aksesi 190615). Seluruh tanaman dibagi menjadi umbi dan akar berserat. Selanjutnya, mereka dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dengan pengeringan beku vakum, masing-masing.

Sampel kering dan bubuk (TB dan FB) diekstraksi dengan etanol 95 persen selama tiga kali (1,5 jam untuk setiap waktu). Ekstrak disaring menggunakan kertas saring What man (No.1). Filtrat dipekatkan sampai kering dalam rotavapor (Hei-VAP, Heidolph, Jerman) pada 50 derajat dan selanjutnya dikeringkan dengan pengering vakum-beku. Hasil ekstraksi etanol TB (ETB) dan FB (EFB) masing-masing adalah 5,21 dan 6,53 persen. Ampas digunakan untuk mengekstrak polisakarida mentah dengan cara didispersikan dalam air 80 derajat selama 4 jam dan pengendapan dengan etanol [31]. Rendemen polisakarida TB (PTB) dan FB (TBS) masing-masing adalah 14,75 dan 6,45 persen.

ekstrak cistanche

Analisis kimia

Analisis kimia dilakukan pada kromatografi cair kinerja ultra tinggi yang dikombinasikan dengan spektrometri massa tandem waktu terbang quadrupole (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Pemisahan kromatografi dilakukan pada tem Waters Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, US) dengan kolom WatersBEH Shield RP C18 (100×2.1mm, 1.7μm) at3{ {43}} derajat . Fase gerak terdiri dari 0,1 persen asam format dalam air (A) dan asetonitril (B), dengan gradien linier: 0–3 menit, 5–16 persen B; 3–8 menit, 16–30 persen B; 8–10 menit, 30–35 persen B; 10-15 menit, 35-55 persen B; 15–18 menit, 55–80 persen B; 18–19 menit, 80–5 persen B; 19-20 menit, 5 persen B. Laju aliran adalah 0,3 mL/menit, dan volume injeksi adalah 2 L.

Percobaan TOF-MS/MS dilakukan dengan menggunakan spektrometri massa AB SCEIX Triple TOF 5600 (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) yang dilengkapi dengan electrospray ionization (ESI). Deteksi MS dilakukan dengan metode ionisasi negatif. Parameter ditetapkan sebagai berikut: suhu sumber dan desolvasi masing-masing 100 derajat dan 450 derajat; laju alir gas desolvasi adalah 900L/jam; tegangan kapiler adalah 2kV; tegangan kerucut adalah 40 V; energi tumbukan adalah 22 eV; dan scanspectra penuh adalah 100-2000 Da.

Uji antioksidan aktivitas pemulungan radikal DPPH

Aktivitas scavenging radikal DPPH ditentukan sesuai dengan Ali et al. dengan sedikit modifikasi [32]. Secara singkat, 50 L larutan sampel uji dicampur dengan 150 LDPPH larutan etanol (0.2mM) di 96-piring sumur dan disimpan di tempat gelap selama 30 menit . Absorbansi campuran pada 517nm (A1) dinilai dengan spektrofotometer lempeng mikro (Thermo Fisher Scientific, America). Larutan blanko tanpa sampel uji yang dicampur dengan larutan DPPHethanol ditetapkan sebagai gugus positif (A0). Larutan blanko tanpa DPPH dicampur dengan larutan sampel uji ditetapkan sebagai kelompok blanko (A2). Semua eksperimen dieksekusi dalam rangkap tiga. Radikal scavengingrate DPPH dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Tingkat pemulungan radikal DPPH ( persen ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 persen .

Aktivitas pemulungan radikal ABTS

Kapasitas scavenging radikal ABTS diukur dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Ali et al. [32]. Secara singkat, larutan berair 7mMABST dicampur dengan 2,45mM kalium persulfat dengan perbandingan 1:1 (v/v), dan diinkubasi pada suhu kamar dalam gelap selama 16 jam untuk mendapatkan larutan stok ABST plus. Larutan stok diencerkan dengan phosphate buffered saline (PBS) untuk mengatur absorbansi (0.72±0.2) pada 734nm. Sampel uji 20μL pada konsentrasi yang berbeda dicampur secara menyeluruh dengan larutan 180μL ABTS plus. Campuran reaktif disimpan dalam gelap selama 5 menit dan kemudian diukur absorbansinya (B1) pada 734nm. Absorbansi campuran tanpa sampel uji dan ABST plus ditetapkan masing-masing sebagai B dan B. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Tingkat penangkapan radikal ABTS dihitung menurut rumus berikut:

Tingkat pemulungan radikal ABTS ( persen ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 persen .

Uji kekuatan antioksidan pereduksi besi (FRAP)

Aktivitas reduksi besi besi ditentukan menurut prosedur oleh Kosakowska et al. [33]. 300mM buffer asetat, 10mM TPTZ (2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazine) dan 20mM FeCl3 dicampur pada a (v/v/v) perbandingan 10:1:1 untuk menyiapkan reagen kerja. 100μL setiap larutan sampel uji dicampur dengan 100μL reagen kerja TPTZ, diinkubasi pada 37 derajat selama 20 menit dan absorbansi ditentukan pada 593 nm. Sementara itu, serangkaian larutan standar FeSO4 dalam rentang konsentrasi 0–1000ug/mL digunakan untuk menyiapkan kurva kalibrasi. Kapasitas reduksi besi dihitung dalam pembentukan kompleks biru Fe2 plus -TPTZ yang intens. Hasilnya dinyatakan sebagai Fe2 plus kapasitas antioksidan (mmol FeSO4/g ekstrak).

Aktivitas penghambatan tirosinase

Aktivitas penghambatan tirosinase ditentukan dengan metode spektrofotometri menggunakan L-DOPA sebagai substrat [34]. Secara singkat, larutan sampel 50μL pada konsentrasi yang berbeda dicampur dengan 50 L tirosinase (200 unit/mL, dilarutkan dalam buffer fosfat pH 6,8) di sumur 96- piring dan diinkubasi selama 15 menit pada 25 derajat. Reaksi kemudian dimulai dengan penambahan L-DOPA (50 L). Setelah diinkubasi selama 30 menit pada suhu 25 derajat , absorbansi pada 490 nm (Aa) ditentukan menggunakan spektrofotometer sky microplate multiskan (ThermoFisher Scientific, America). Demikian pula, absorbansi sumur sampel tanpa tirosinase (Ab) dan sumur kontrol dengan enzim tetapi tanpa sampel (Ab) terdeteksi pada waktu yang sama. Aktivitas penghambatan tirosinase dihitung dengan persamaan sebagai berikut:

Laju penghambatan tirosinase ( persen )=[1− (Aa Ab)/Ac] × 100 persen .

IC50 dihitung menggunakan persamaan GraphPad Prism seperti di bawah ini:

Y=mnt plus (maks mnt)/1 plus 10(x−logIC50)×Kemiringan bukit

X mewakili konsentrasi inhibitor; Y mewakili data penghambatan ( persen ) bersama dengan nilai minimal (min) dan maksimal (maks); Kemiringan bukit adalah faktor kemiringan.

Cistanche menghambat aktivitas tirosinase.

Penghambatan melanin pada ikan zebra

Ikan zebra garis AB tipe liar (disediakan oleh Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Provinsi Zhejiang) ditempatkan di air ikan (0.2 persen garam laut instan dalam air deionisasi, pH 6,9–7,2, konduktivitas 48{ {18}}–510 mS/cm, dan kekerasan 53,7–71,6mg/L CaCO3) dalam fotoperiode terang/gelap 14/10 jam pada suhu konstan 28±0,5 derajat, dan memberi makan udang air asin hidup dua kali sehari. Embrio ikan zebra diperoleh dari pemijahan alami dan dikumpulkan dalam waktu 30 menit. Uji ikan zebra diakreditasi oleh Asosiasi untuk Penilaian dan Akreditasi Laboratorium Perawatan Hewan (AAALAC). Penelitian ini telah disetujui oleh IACUC (Institusional Animal Careand Use Committee) di Hunter Biotechnology, Inc. dan nomor persetujuan IACUC adalah 001458.

Embrio pada tahap 6 jam pasca fertilisasi (hpf) diperlakukan masing-masing ekstrak pada enam konsentrasi (10, 30, 62.5,125, 250 dan 500 mg/L) selama 72 jam untuk mengevaluasi konsentrasi maksimum tidak mematikan (MNLC). ). Akibatnya, MNLC dari semua ekstrak lebih dari 62,50mg/L.10 embrio ditempatkan di 6-sumur dan terpapar sampel yang diuji pada konsentrasi 10 dan 30 mg/L dari 6 hpf hingga 54 hpf (paparan 48 jam ). DMSO (0,05 persen, v/v) andarbutin (10 dan 30mg/L) masing-masing digunakan sebagai kontrol normal dan kontrol positif.

Embrio yang disinkronkan dikumpulkan dan diamati di bawah mikroskop stereo (SZX7, Olympus, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera digital (VertA1, China). Akumulasi melanin, berkorelasi langsung dengan area pigmentasi ikan zebra, dihitung menggunakan Program Manipulasi Gambar GNU (GIMP versi 2.10.2) dan dinyatakan sebagai persentase sehubungan dengan kontrol negatif (akumulasi melanin 100 persen) [28, 30].

Studi docking molekuler

158 senyawa yang diisolasi dari B. striata dalam literatur [2], termasuk 19 glikosida, 28 bibenzil, 19 fenan-tren, 18 bifenantrena, 23 dihidrofenantrena, 5 antosianin, 11 steroid, 8 triterpenoid, 12 asam fenolik, 5 kuinon, dan 10 senyawa lainnya, digunakan sebagai ligan. Struktur 3D digambar olehChemBio3D dan dioptimalkan menggunakan MM2 dan Autodock Tools. Struktur kristal 3D tirosinase (PDBID:5M8N) dan adenilat siklase (PDB ID:5IV3) diambil dari RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Semua molekul air dan atom hetero dihilangkan dari struktur kristal dengan menggunakan Chimera dan MGL Tools. Akhirnya, Autodock

Vina digunakan untuk mengikat protein reseptor dengan ligan molekul kecil. Parameter situs docking protein reseptor ditetapkan sebagai 36.700, 7.034, 19.104, dan 17.467, 22.807, 2.786, masing-masing, menurut ligan asli mimosine dan LRE1 [35]. Untuk mencapai akurasi komputasi yang lebih tinggi, 20 parameter kelengkapan untuk setiap reseptor dihasilkan, dan konformasi dengan afinitas tertinggi dipilih sebagai konformasi docking akhir dan divisualisasikan dalam Pymol2.3. Sedangkan ligan asli mimosine dan LRE1 diambil sebagai kontrol positif [36].

Prediksi ADMET in silico

3 hit teratas dari B. striata memiliki afinitas pengikatan yang lebih baik dengan tirosinase dan adenilat siklase, menjadi sasaran analisis ADMET. QikProp di Schrodingersuite digunakan untuk menghitung sifat fisik dan karakteristik terkait obat, termasuk berat molekul (MW), koefisien partisi oktanol/air yang diprediksi (QPlogPo/w), prediksi kelarutan dalam air (QPlogS), prediksi sel Caco-2 yang terlihat permeabilitas untuk sawar darah usus (QPPCaco), prediksi koefisien partisi otak/darah (QPlogBB), prediksi permeabilitas kulit (QPlogKp), prediksi IC50 untuk penyumbatan saluran HERGK plus (QPlog HERG) dan prediksi penyerapan oral manusia. Properti dinilai berdasarkan aturan Lipin-ski tentang lima dan literatur [37, 38].

Simulasi dinamika molekul

Untuk menguji stabilitas dan fluktuasi dinamis kompleks ligan-protein di bawah lingkungan biologis yang disimulasikan, dan selanjutnya memvalidasi hasil docking, senyawa blestrin D (75) dipilih sebagai ligan untuk studi simulasi dinamika molekul (MD), berdasarkan hasil docking molekuler. Kompleks blestrin D dengan tirosinase dan adenilat siklase dilakukan simulasi MD dan dijalankan selama 100ns, menggunakan mode air TIP3P. Nilai root mean square deviasi (RMSD) dari atom tulang punggung protein relatif terhadap struktur awal dihitung untuk menguji stabilitas protein selama periode simulasi [39].

Hasil

Komposisi kimia

Kromatogram dasar puncak kromatogram ETB dan EFB ditunjukkan pada Gambar. 1. Perangkat lunak PeakView digunakan untuk mengidentifikasi konstituen. Rumus molekul secara akurat ditetapkan dalam kesalahan massa 10ppm. Berat molekul yang tepat dan fragmen digunakan untuk mengidentifikasi komponen sesuai dengan literatur dan database struktur kimia bebas, seperti ChemSpider dan Massbank. Hasilnya, 39 komposisi kimia, termasuk 24 stilbenoid (bibenzil, fenantrena dan turunannya), 6 glikosida, 4 asam fenolat, 3 kuinon, 1 steroid, dan 1 senyawa lain diidentifikasi sementara dari TKKS dan ETB. Pada saat yang sama, semi-kuantifikasi relatif mereka dilakukan dengan mengukur area puncak setiap senyawa dalam mode MS menggunakan kromatogram ion yang diekstraksi [40]. Informasi rinci tentang identifikasi dan konten relatifnya (sorotan peta panas, semakin gelap warnanya, semakin tinggi konsentrasi) diringkas dalam Tabel 1.

Kapasitas antioksidan

Telah diketahui dengan baik bahwa penyinaran Ultraviolet A (UVA) dapat menginduksi produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan memediasi melanogenesis yang berlebihan dalam sel-sel kulit. Polifenol alami adalah penghambat pembentukan ROS dan dapat bertanggung jawab atas aktivitas anti-melanogenik ekstrak tumbuhan [41 , 42]. Jadi, dalam penelitian ini, kapasitas antioksidan dinilai melalui DPPH, aktivitas scavenging radikal ABTS dan FRPassay. Hasil (Tabel 2 dan Gambar 2) menunjukkan bahwa TKKS (IC50=5.94mg/L) memiliki aktivitas pemulungan radikal DPPH yang paling kuat secara in vitro dibandingkan dengan PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L), dan ETB(IC50=65.25mg/L). Tren serupa diamati pada uji ABTS dan FRAP. Ekstrak etanol 95 persen TB dan PB memiliki aktivitas antioksidan yang lebih kuat secara in vitro daripada polisakarida mentahnya. Selain itu, EFB menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih kuat daripada ETB, yang konsisten dengan hasil penelitian sebelumnya [25].

Aktivitas penghambatan tirosinase

Tirosinase adalah enzim pembatas laju kunci dalam jalur biosintesis melanin dan digunakan secara luas untuk mengidentifikasi potensi produk alami dengan efek anti-melanogenesis [43]. Hasil (Gbr. 3) menunjukkan bahwa ETB dan EPB memiliki aktivitas penghambatan tirosinase yang lebih kuat daripada PTBand PPB secara in vitro, yang konsisten dengan hasil penelitian sebelumnya [25]. EFB menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase yang lebih kuat dengan cara yang bergantung pada dosis (antara 20 dan 200mg/L) dengan IC50=58.92mg/L daripada ETB(IC{50=75.44mg/L) dan senyawa positif arbutin(IC{ {11}}.02 mg/L).

Penghambatan melanin pada ikan zebra

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), menunjukkan bahwa kendaraan 0,05 persen DMSO tidak mempengaruhi produksi melanin pada embrio ikan zebra. Namun, setelah terpapar sampel yang diuji dan arbutin selama 48 jam, embrio ikan zebra menunjukkan berbagai tingkat deposisi melanin (Gbr. 3B,4), kecuali kelompok PFB 10 mg/L. Terlihat bahwa kandungan melanin relatif pada kelompok ETB 10mg/L (78,38 persen ) dan 30 mg/L (64,72 persen ) secara signifikan lebih rendah dibandingkan pada kelompok PTB 10mg/L (93,06 persen ) dan 30mg/L (82,02 persen ) (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Docking molekuler

Tirosinase adalah enzim pembatas laju dalam biosintesis melanin: hidroksilasi tirosin menjadi 3,4-dihidroksi-fenilalanin (DOPA), dan oksidasi DOPA todopakuinon. Oleh karena itu, tirosinase telah dianggap sebagai target penting untuk pengembangan inhibitor melanogenesis [44]. Selain itu, adenilatsiklase adalah enzim kunci dari melanogenesis yang diinduksi cAMP. Pengikatan melanotropin alfa polipeptida (-MSH) ke reseptor MC1R menginduksi aktivasi adenilat siklase, peningkatan level cAMP, peningkatan ekspresi gen tirosinase, dan selanjutnya meningkatkan sintesis melanin [45]. Oleh karena itu, kami melakukan studi docking molekuler dari 158 senyawa yang diisolasi dari B. striata sebelumnya [2], dengan tirosinase dan adenilat siklase. Energi ikat ligan yang dipelajari dengan tirosinase dan adenilatsiklase dirangkum dalam Tabel S1. Ada 83 (termasuk 60 stilbenoids) dan 85 (termasuk 70 stilbenoids) senyawa menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih kuat terhadap tirosinase dan adenilat siklase, dibandingkan dengan ligan asli mimosine (− 6,4 kkal/mol) dan LRE1 (− 8,5 kkal /mol). 1,8-bis(p-hidroksibenzil)-4-metoksifenantrena-2,7-diol (56), blestrin D (75), dan 2,7-dihidroksi -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-meth-oxy-9,10-dihydrophenanthrene (93) adalah tiga ligan teratas terhadap tirosinase, dengan energi ikat 10.2,10.0, dan 9.7kkal/mol, masing-masing. Sedangkan blestrin D(75), blestrin B (73), dan 3,3′-dihidroksi-5-metoksi-2,5′,6-tris(p-hidroksibenzil) bibenzil (42) adalah tiga ligan teratas menuju adenilat siklase, masing-masing dengan energi ikat 12,1, 11,9, dan 11,6 kkal/mol. Afinitas ikatan teoritis dan interaksi ligan-asam amino dirangkum dalam Tabel 3.

Perlu dicatat bahwa blestrin D (75), senyawa bifenantrena, masuk ke dalam kantong pengikatan tirosinase dan adenilat siklase (Gbr. 5), dan menunjukkan afinitas pengikatan yang signifikan terhadap tirosinase dan denilat siklase. Interaksi Van der Walls berkontribusi terhadap nilai interaksi energi secara keseluruhan, sementara gugus hidroksil menghasilkan ikatan hidrogen dengan residu asam amino Glu 451, Arg114 dari tirosinase, dan Val 167 dari adenilat siklase, masing-masing (Tabel 3 dan Gambar S1). Senyawa 93 juga menunjukkan afinitas pengikatan yang signifikan menuju tirosinase melalui pembentukan 6 ikatan hidrogen dengan residu asam amino Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223, dan Gln236.

Prediksi ADMET in silico

Nilai prediksi dari beberapa parameter penting beserta kisaran yang dapat diterima dirangkum dalam Tabel 4. Selain QPlogS dari 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, blestrin B dan blestrin D, dan QPlogBB dari 3,3′,{{6} }trimethoxybibenzyl, semua properti ADMET yang dihitung lainnya dari tiga hit teratas berada dalam kisaran yang diharapkan, sementara itu, QPlog HERG dari semua tiga hit teratas kurang dari 5, menunjukkan bahwa mereka berpotensi untuk digunakan oleh manusia. QPlog Kp dari semua tiga hit teratas untuk tirosinase dan adenilat siklase, kecuali 3,3′,5-trimethoxybibenzyl, berada dalam kisaran yang menguntungkan, menunjukkan bahwa senyawa ini dapat dengan mudah menembus ke dalam kulit.

Simulasi dinamis molekul

Plot RMSD menunjukkan bahwa nilai RMSD kompleks protein-ligan tidak berfluktuasi secara signifikan selama seluruh periode simulasi. Nilai RMSD (Gbr. 6A) dari blestrin D dengan kompleks tirosinase dan adenilat siklase ditentukan mulai dari 1,5 hingga 2,8Å, dan dari 2.0 hingga 3,6Å, masing-masing. Nilai TheRMSF mencerminkan fleksibilitas setiap residu selama simulasi. Residu dengan nilai RMSF yang lebih tinggi mengungkapkan bahwa mereka lebih fleksibel (Gbr. 6B). Nilai RMSF dari residu asam amino di daerah loop ditemukan sangat berfluktuasi. Sementara, residu situs aktif menyimpan nilai RMSF kecil (kurang dari 1,0Å), seperti Arg114, Val167, Tyr226, Leu229, dan Arg230in tirosinase, dan Val167, Leu102, Phe45, Lys95 dan Leu166 dalam adenilat siklase, menunjukkan bahwa kantong pengikat tetap stabil. Interaksi molekuler blestrin D dengan tirosinase dan adenilat siklase ditunjukkan pada Gambar 7.

Energi bebas yang mengikat dihitung dengan metode luas permukaan lahir umum mekanika molekuler (MM-GBSA) [39]. Energi bebas pengikatan blestrin D yang diprediksi dengan tirosinase dan adenilatsiklase masing-masing adalah 96,94kkal/mol dan 139,69kkal/mol, yang menyiratkan interaksi pengikatan yang responsif (Tabel 5). Selanjutnya, kontribusi yang mendukung pengikatan ligan adalah interaksi solvasi nonpolar, van der Waals dan interaksi elektrostatik.

Perlu diketahui bahwa jenis dan kandungan komponen kimia dalam TKKS lebih banyak dari pada ETB. Area puncak dari semua senyawa yang diidentifikasi dalam TKKS kira-kira dua kali lipat dari yang ada di ETB. Mili-tarine adalah senyawa yang paling melimpah baik di TKKS maupun ETB, yang memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi dan neuroproteksi yang signifikan, dan dipilih sebagai penanda kimia untuk kontrol kualitas B. striata dalam Chinese Pharmacopoeia2020 edisi [46]. Area puncak relatif militarine di EFB (38,39 × 106) sedikit lebih tinggi daripada di ETB (30,48 × 106). Gastrodin adalah senyawa terkenal dalam banyak obat herbal Cina, seperti Gastrodia elata, yang menunjukkan penghambatan tirosinase yang signifikan dan efek pemulungan radikal [30]. Area puncak relatif gastrodin di EFB (1,43 × 106) sedikit lebih rendah daripada di ETB (2,17 × 106).

Ekstrak etanol 95 persen TB dan PB memiliki aktivitas antioksidasi yang lebih kuat secara in vitro dibandingkan polisakarida mentahnya. Selain itu, EFB menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih kuat daripada ETB, yang konsisten dengan hasil penelitian sebelumnya [25]. Fenomena ini diduga karena TKKS mengandung senyawa antioksidan yang lebih tinggi, seperti militarin dan stilbenoid (polifenol tumbuhan alami). Misalnya, luas puncak relatif 4,8,4′,8′-tetrametoksi-[1,1′-bifenantrena]-2,7,2′,7′-tetrol, suatu bifenantrena dengan empat gugus hidroksil fenolik, adalah 9,15×106 di FB, sedangkan 0,01×106 di TB.

Dalam penelitian ini, PPB dan PTB menunjukkan sedikit aktivitas penghambatan tirosinase dengan cara yang bergantung pada dosis. Namun, hal itu menunjukkan bahwa tidak ada aktivitas yang terdeteksi dalam ekstrak air PB (mengandung PPB) [25]. Fenomena ini mungkin disebabkan oleh persiapan sampel yang berbeda. Ekstrak air PB digunakan untuk mengevaluasi aktivitas penghambatan tirosinase dalam percobaan Jiang [25], sedangkan dalam penelitian ini, ekstrak air dipresipitasi dengan etanol untuk mendapatkan polisakarida mentah.

Baru-baru ini, model ikan zebra banyak digunakan dalam evaluasi efek anti-melanogenesis in vivo [47, 48]. Arbu-tin, senyawa hidrokuinon glukosida yang ada di berbagai tanaman, yang telah digunakan secara komersial dalam industri kosmetik, ditetapkan sebagai kontrol positif. Aktivitas antimelanogenesis ETB dan TKKS lebih kuat dibandingkan arbutin, hal ini menunjukkan bahwa ETB dan TKKS dapat diaplikasikan sebagai bahan pencerah kulit dalam industri kosmetik.

Area puncak relatif blestrin D di EFB(1,91 × 106), kira-kira empat kali lipat dari ETB(0.46 × 10 ). Area puncak relatif senyawa 56 (8,73 × 106) dan 93 (0,64 × 106) di EFB juga signifikan lebih tinggi daripada di ETB (kurang dari 0,01 × 106 dan 0,10 × 106). Ini mungkin salah satu alasan mengapa EFB menunjukkan efek anti-melanogenik yang lebih kuat daripada ETB. Menarik untuk dicatat bahwa tiga ligan teratas terhadap tirosinase dan adenilat siklase semuanya milik stilbenoid (bibenzil, fenantrena dan turunannya). Stilbenoid adalah polifenol tumbuhan alami, yang telah menarik minat besar dalam beberapa tahun terakhir karena bioaktivitasnya yang luar biasa seperti aktivitas anti-inflamasi, antimikroba dan antioksidan [49]. Resveratrol adalah stilbenoid yang paling umum. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa resveratrol dan turunannya secara signifikan dapat menghambat aktivitas katalitik, ekspresi gen, dan modifikasi pascatranslasi tirosinase. Dengan demikian, mereka menunjukkan potensi berguna sebagai agen pencerah kulit dan antipenuaan dalam kosmetik [41, 50].

Cistanche menunjukkan potensi bermanfaat sebagai pencerah kulit dan agen antipenuaan dalam kosmetik.

Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik gambar.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, aktivitas antioksidan dan antimelanogenik polisakarida kasar dari B. striattuber (PTB) dan akar serabut (FPB), dan ekstrak etanol 95 persen umbi B. striata (ETB) dan akar serabut (EFB) diselidiki secara sistematis. . Hasil penelitian menunjukkan bahwa TKKS memiliki DPPH, aktivitas penangkap radikal ABTS dan aktivitas reduksi besi besi yang paling kuat. Selain itu, ETB dan EFB dapat secara signifikan mengurangi aktivitas tirosinase in vitro dan sintesis melanin embrio ikan zebra dengan cara yang bergantung pada dosis. Docking molekuler menunjukkan bahwa terdapat sejumlah besar senyawa, sebagian besar milik stilbenoid, menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih kuat terhadap tirosinase dan denilat siklase, dibandingkan dengan afinitas pengikatan ligan asli. Temuan ini mendukung alasan penggunaan ETB dan EFB sebagai bahan pemutih kulit alami di industri farmasi dan kosmetik.