Efek Anti-Penuaan yang Dimediasi Dari Ekstrak Cistanche

budaya EC

Sel endotel vena umbilikalis manusia diperoleh dari American Type Culture Collection (Manassas VA, USA). Sel dikultur pada suhu 37'C dengan media pertumbuhan endotel CO2 5 persen-2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, USA) ditambah dengan 10 persen serum janin sapi (FBS). EC dikultur selama 48 jam pada suhu 37'C dengan 5 persen CO, dalam media EGM-2 (kontrol) atau HG 30 mM, dengan atau tanpa penambahan konsentrasi Cistanche yang berbeda (1040 ug/mL).

Uji viabilitas sel

Sel dikultur pada suhu 37'C selama 72 jam dalam media EGM-2 yang dilengkapi dengan 2 persen FBS dan berbagai konsentrasi Cistanche, dan diberi perlakuan dengan larutan MTT selama 4 jam. Endapan formazan yang dihasilkan dilarutkan dengan dimetilsulfoksida, di mana absorbansinya diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat mikro ELISA VersaMax (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA).

Uji migrasi luka gores

Sel dilukai, kemudian media kultur diganti dengan media segar yang mengandung berbagai konsentrasi Cistanche. Sel dipertahankan selama 24 hingga 48 jam. Saat migrasi penuh, sel dicitrakan menggunakan mikroskop (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Jepang). Sel yang bermigrasi dihitung menggunakan mikroskop optik pada perbesaran 200x dan dihitung secara manual

Pewarnaan SA-P-gal

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 sel dihitung menggunakan tiga bidang independen.

analisis noda barat

Sel dipanen dan dilisiskan dalam larutan ekstraksi protein (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Korea) yang mengandung penghambat protease dan fosfatase (10 mnt pada suhu 4'C). Konsentrasi protein total dalam supernatan diukur menggunakan uji Bradford. Setelah pemanasan pada 95 derajat selama 5 menit, sampel protein (30 ugs) dipisahkan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 8~12 persen. Protein kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (MilliporeBedford, MA, USA) pada 100 V selama 60 menit. Membran diinkubasi dalam 5 persen bovine serum albumin (BSA) dalam larutan Tris-buffered saline (TBS) ditambah dengan 0,05 persen TBS dengan Tween-20 (TBST) (30 menit pada suhu kamar), kemudian diinkubasi dalam 5 persen BSA di TBST dilengkapi dengan antibodi primer (1:200 hingga l,000) (semalam pada suhu 4'C). Selanjutnya, membran diinokulasi dengan antibodi kambing anti-kelinci atau anti-tikus terkonjugasi HRP (1:5,000) untuk h, dan pita protein dideteksi menggunakan kit deteksi chemiluminescence yang ditingkatkan (Intron Biotechnology, Inc. ) dan LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokyo, Jepang). Analisis semi-kuantitatif dari hasil densitometri dilakukan dengan menggunakan Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA).

Pengukuran konsentrasi NO produksi NO ditentukan dengan mendeteksi konsentrasi nitrit menggunakan alat uji NO, sesuai dengan instruksi pabrik. Kepadatan optik ditentukan pada 560 nm menggunakan pembaca pelat mikro, dan konsentrasi dihitung menggunakan kurva kalibrasi

Analisis statistik

Hasil dinyatakan sebagai rata-rata plus standar deviasi (SD) Signifikansi statistik ditentukan oleh analisis varians satu arah (ANOVA). Perbandingan post hoc antar kelompok dilakukan dengan menggunakan tes perbandingan berganda Bonferroni. Semua perhitungan dilakukan menggunakan SPSS di Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA), dan nilai-P<0.05 were considered statistically significant.

HASIL DAN DISKUSI

sitotoksisitas Cistanche

Untuk menentukan sitotoksisitas Cistanche pada EC, sel diinkubasi dengan berbagai konsentrasi Cistanche (0 hingga 100ug/ml) selama 72 jam. Cistanche menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml pada semua titik pengobatan (Gbr. 1). Oleh karena itu, konsentrasi Cistanche dari<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Jalur protein kinase teraktivasi mitogen (MAPK) mengatur proses utama yang terlibat dalam pengembangan EC vaskular, seperti proliferasi sel, invasi, metastasis dan kelangsungan hidup, dan angiogenesis (Pišlar et al., 2015). MAPK melibatkan ERK, c-Jun N-terminal kinase, dan p38 (Kim dan Choi, 2010). ERK dan p38 adalah protein pensinyalan penting yang terlibat dalam penyembuhan luka, sedangkan ERK memainkan peran penting dalam mengendalikan migrasi sel, proliferasi, diferensiasi, dan kelangsungan hidup (Roskoski, 2012). Dalam penelitian terbaru, jalur pensinyalan MAPK p38 disarankan untuk terlibat dalam penyembuhan luka (Loughlin dan Artlett, 2011; Kim et al., 2019; Wang et al., 2019). Dalam penelitian ini, kami memeriksa ekspresi protein ERK dan p38 untuk mengidentifikasi jalur pensinyalan yang terlibat dalam migrasi EC yang diatur oleh Cistanche. Perlakuan cistanche (40 g/mL) meningkatkan migrasi EC 1.5-kali lipat relatif terhadap kontrol (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-lipat lebih tinggi dari kontrol (P<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Gambar 1.Efek dariCistanche(Cistanche) pada viabilitas sel. Sel diperlakukan dengan Cistanche (0 hingga 100g/ml) selama 72 jam. Viabilitas seldihitung sebagai persentase sel hidup yang dikultur dalamtidak adanya Cistanche. Hasil menunjukkan rata-rata±SD. *P<0.05.