Diskusi

Kami telah mengembangkan teknik kuantitatif dan real-time untuk mempelajari transmisi sel-ke-sel SNCA diC.elegans. Model ini menunjukkan banyak fitur utama sinukleinopati, termasuk akumulasi progresif agregat SNCA,degenerasi saraf,defisit perilaku, Danmasa hidup berkurang. Baik genetik maupunmanipulasi farmakologishewan telah menunjukkan korelasi yang kuat antaratingkat penuaan, transmisi SNCA transelular, dan fenotipe neurodegeneratif, dan juga berbagai manipulasi yang terkait denganefek anti-penuaandapat memperlambat perkembangan peristiwa ini.Perkembangan sinukleinopati yang bergantung pada penuaandisertai dengan penurunan degradasi protein.Perawatan anti-penuaandapat memulihkan sistem yang memediasi degradasi protein. Selain itu, pemulihan fungsi lisosom mengurangi penyebaran agregat dan degenerasi saraf yang menyertainya dalam model penuaan ini. BiFC adalah banyak digunakanflteknik fluoresensi yang telah berhasil diterapkan untuk menilai interaksi protein-protein dan dimerisasi protein dan/atau oligomerisasi dalam sel hidup.7 Pasangan BiFC V1S-SV2 telah terbuktiflmeningkat pada dimerisasi/oligomerisasi SNCA ketika protein ini diekspresikan bersama dalam sel mamalia.7 Dalam studi sebelumnya,17 dengan menghasilkan garis sel neuroblastoma yang mengekspresikan salah satu dari V1S dan SV2, kami telah menunjukkan bahwa transfer sel-ke-sel protein SNCA dan koagregasi protein yang ditransfer denganSNCA endogen dapat divisualisasikan dengan BiFCflfluoresensiselama kokultur sel-sel ini.

Selamat Datang di Toko Saya Untuk Mendapatkan Herbal Cistanche Untuk Perawatan Anti Aging

Pengiriman gratis, dan pengiriman global.

Salah satu masalah teknis penting dari sistem BiFC adalah memverifikasi ekspresi spesifik tipe sel dari setiap protein.Meskipun analisis kuantitatif ekspresi transgenik SNCA di setiap jenis sel tidak layak secara teknis, kami memiliki serangkaian data yang mendukung argumen bahwa SNCA secara eksklusifdiekspresikan hanya dalam jenis sel yang dimaksud. Pertama, DsRedkegagalankanker terdeteksi hanya di flip-21 neuron, tidak di sel otot faring sama sekali. Kedua, pewarnaan imunofluoresensi SNCA dengan antibodi yang sangat spesifik dan sensitif menunjukkan ekspresi protein ini secara spesifik pada sel yang dituju.jenis. Ketiga, ekspresi pasangan BiFC yang sama pada cacingdengandin-1tanda mutasififimengurangi BiFCflsinyal fluoresensi, menunjukkan bahwa generasi BiFCfluorescence membutuhkan endositosis. Ini menunjukkan bahwa sinyal BiFC tidak berasal dari koekspresi pasangan BiFC dalam tipe sel yang sama tetapi berasal dari transmisi protein antar sel.

sistem untuk identifikasi modulator genetik baru. Selain itu, struktur faring yang khas pada C. elegans akan memungkinkan identifikasi perubahan yang mudah dalam transmisi synucleinopathy dalam skrining skala besar untuk pengubah genetik dan molekul kecil.

Efek penuaanproses pada "transmisi," daripada agregasi itu sendiri, adalah subjek utama dari makalah ini. Sekarang, kami ingin memperjelas bahwa kami tidak mencoba untuk berargumen bahwa penuaan dan disfungsi lisosom hanya memengaruhi transmisi agregat tanpa memengaruhi agregasi otonom sel itu sendiri. Sistem BiFC kami adalah sistem yang sangat baik untuk mengukur peristiwa transmisi, tetapi tidak dirancang untuk memantau agregasi panggilan-otonom. Studi sebelumnya,25-27 termasuk studi kami,28 membahas efek disfungsi lisosom dalam pembersihan agregasi SNCA otonom sel. Namun, kami juga ingin menunjukkan bahwa tidak ada bukti definitif bahwa penelitian ini hanya mengamati agregasi otonom sel tidak termasuk efek transmisi dan amplifikasi agregat transeluler. Kami juga ingin menekankan bahwa inisiasi agregasi merupakan persyaratan mutlak untuk transmisi agregat. Faktanya, kami menunjukkan bahwa agregasi sel-otonom tingkat basal terjadi secara spontan bahkan pada hewan transgenik tunggal (Gbr. 8F).

Ituefek anti-penuaan dari GlcNActelah dideskripsikan sebagai DAF-16-independen.12 Ini menunjukkan bahwa GlcNAc menyelamatkan fenotipe daf-16 bukan dengan memengaruhi jalur DAF-16 secara langsung, tetapi dengan bertindak melalui jalur penuaan independen. Data yang kami sajikan menunjukkan bahwa transmisi SNCA tidak berada di bawah kendali jalur penuaan tertentu, melainkan diatur oleh penuaan umum.

Studi kami saat ini memberikan dasar untuk mempertimbangkan penggunaan pendekatan anti-penuaan umum sebagai strategi terapi untuk menghentikan atau memperlambat perkembangan PD dan sinukleinopati terkait. Selain itu, peningkat fungsi lisosom dapat dianggap sebagai kandidat terapi yang bertujuan untuk menghentikan atau menunda perkembangan penyakit ini. Pendekatan yang sama secara teori dapat diterapkan pada penyakit neurodegeneratif terkait usia lainnya, banyak di antaranya dianggap berkembang melalui penyebaran agregat protein spesifik. Dengan asumsi bahwa penyebaran agregat protein yang berbeda memiliki prinsip dasar yang sama, kami dengan hati-hati berspekulasi bahwa strategi anti-penuaan dan pro-lisosom dapat dikembangkan menjadi terapi umum untuk menghentikan perkembangan penyakit neurodegeneratif. Hipotesis ini dapat dijawab dengan menerapkan model hewan berbasis BiFC ke model transmisi lain yang melibatkan MAPT, protein poliglutamin, dan TARDBP.1

Bahan dan metode

Strain dan pembiakan nematoda Semua strain ditangani dengan menggunakan prosedur standar dan ditumbuhkan, pada pelat media pertumbuhan nematoda (NGM) yang berisi rumput Escherichia coli (E. coli) strain OP50 pada suhu 20 C.29 Bristol N2 tipe liar dan strain mutan unc-119(ed3), dyn-1(ky51), dan asp-4(ok2693) diperoleh dari Caenorhabditis Genetics Center (CGC; University of Minnesota, St. Paul, MN , AS). Strain mutan asp-1(tm666) disediakan oleh C. elegans National BioResource Project (NBRP; Fakultas Kedokteran Universitas Kedokteran Wanita Tokyo, Tokyo, Jepang). Strain mutan daf-2(e1370) dan daf-16(mu86) adalah hadiah murah hati dari Profesor Kyuhyung Kim (DGIST, Daegu, Korea).

Konstruksi plasmid untuk C. elegans

Plasmid templat V1S dan SV2 adalah hadiah yang murah hati dari Dr. Pamela McLean (Rumah Sakit Umum Massachusetts, Boston, MA, AS). Satu) Pmyo-2::EGFP Promotor myo-2 (Pmyo-2) diamplifikasi dengan PCR dari DNA genomik yang diperoleh dari cacing N2 tipe liar.

Primer sense yang berisi situs HindIII, 50 -GACAAGCTTGGGGTTTTGTGCTGTG GACGTT-30, dan primer antisense yang berisi situs BamHI, 50 - GACGGATCCTTCTGTGTCTGACGATCGAGG-30 digunakan. Pmyo-2::EGFP dibuat dengan memasukkan produk PCR ke situs HindIII dan BamHI dari pFX_EGFPT vector.30 Two) Pmyo-2::SNCA(Myc) A sense primer yang berisi situs SalI, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 dan primer antisense yang berisi urutan tag myc dan situs BglII, 50 - AGCA GATCTCTACAGATCCTCTCAGAGATGAGTTTCTGCTCG GCTTCAGGTTCGTAGTCTTG-30 digunakan untuk memperkuat MYC- SNCA manusia yang diberi tag diperoleh dari pcDNA3.1 vektor SNCA MycHis.28 Fragmen EGFP dari Pmyo-2::EGFP digantikan oleh fragmen SNCA manusia yang diberi tag Myc yang diperkuat PCR untuk membangun Pmyo-2::SNCA (Myc). Tiga) Pmyo-2::V1S Sebuah primer sense yang berisi situs SalI, 50 - AGCGTCGACGC CACCATGGTGAGCAAGGCCGAGG-30, dan primer antisense yang berisi situs BglII, 50 -AGCAGATCTTTAGGCTT CAGGTTCGTAGTC{{ 25}} digunakan untuk memperkuat V1S. Selain itu, fragmen EGFP dari Pmyo-2::EGFP digantikan oleh fragmen V1S yang diperkuat PCR untuk membuat Pmyo-2::V1S. Empat) Pmyo-2::V1Q25 Primer sense yang berisi situs klaI, 50 - TAAGCAATCGA TATGGCGACCCTGGAAAAGCTG-30, dan primer antisense yang berisi situs klaI, 50 -TGCTTAATCGATAGGTCGGTGCA GAGGCTCCTC{{ 38}} digunakan untuk memperkuat Q25. Kemudian, fragmen SNCA manusia dari Pmyo-2::V1S digantikan oleh fragmen Q25 yang diperkuat PCR untuk membuat Pmyo-2::V1Q25. Empat) Pflflp-21::SV2 Fragmen EGFP dari pFX_EGFPT digantikan oleh fragmen SV2 yang diperkuat PCR untuk membuat vektor SV2.

Primer sense yang berisi situs SpeI, 50 -AGCACTAGTGCCACCATGGATG TATTCATGAAAGG-30, dan primer antisense yang berisi situs BglII, 50 -AGCAGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC CG-30 digunakan. Flip-21 promotor (Pflflp-21) diamplifikasi dengan PCR dari DNA genomik N2 dan disubklon ke situs KpnI dan SalI dari vektor SV2 untuk menghasilkan Pfflp-21::SV2. Primer sense yang berisi situs KpnI, 50 - AGCGGTACCAACTAGGTCCAGTGACCGAAAG-30 dan primer antisense yang berisi situs SalI, 50 -AGCGTCGACGCCAC CATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30 digunakan untuk memperkuat flflp{{15} } promotor. Lima) Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed Untuk membuat vektor SV2 yang mengekspresikan DsRed sebagai penanda saraf faring, Pfflp-21 disubklon ke situs KpnI dan SalI dari pFX{ {21}}DsRedxT vector30 dan diberi nama Pflflp-21::DsRed. Koekspresi SV2 dan DsRed di bawah promotor flflp-21 dicapai dengan menempatkan wilayah antar cistronic (ICR) antara SV2 dan DsRed, yang diamplifikasi dengan PCR dari N2.31 Fragmen SV2 digabungkan dengan wilayah ICR melalui fusi PCR32 dan disubklon ke Pflflp-21::DsRed untuk membangun Pfflp-21::SV2-ICR DsRed. Primer sense yang berisi situs SalI, 50 -AGCGTC GACGCCACCATGGATGTATTCATGAAAGGAC-30, dan primer antisense yang berisi wilayah yang tumpang tindih dengan ICR, 50 -CGATCATTTTGGAGATTACTTGTACAGCTTGTCC-30 digunakan dalam reaksi PCR untuk SV2. Wilayah ICR diamplifikasi dengan primer sense yang berisi wilayah yang tumpang tindih dengan SV2, 50 -GGACGAGCTGTACAAGTAATCTCCAAAT CATCG-30, dan primer antisense yang berisi situs SpeI 50 - AGCACTAGTTACCCCTGTAATAATATATTAAAC-3

Pembentukan cacing transgenik BiFC

Plasmid Pmyo-2::V1S dan Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed disuntikkan dengan koin ke dalam gonad cacing L4-tahap akhir N2 dengan penanda pilihan, pRF4 yang mengekspresikan gen kolagen mutan, rol- 6(su1006), 33 untuk membuat garis transgenik ganda yang mengekspresikan pasangan BiFC. Sebagai kontrol negatif untuk BiFC, Pmyo-2::V1S saja disuntikkan ke dalam worm N2 dengan pRF4, dan Pfflp-21::SV2-ICR DsRed saja disuntikkan ke unc{{18 }}(ed3) cacing mutan dengan penanda pilihan, pCFJ151, yang mengekspresikan gen unc-119(C).34 Plasmid Pmyo-2::V1 dihasilkan untuk mengekspresikan urutan parsial BiFC hanya dengan memperkenalkan stop codon tepat sebelum urutan pengkodean SNCA di Pmyo-2::V1S menggunakan Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, 200521). Plasmid Pmyo-2::V1 dan Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed kemudian diinjeksi dengan koin ke dalam N2 dengan pRF4. Plasmid Pmyo-2::V1Q25 dihasilkan untuk mengekspresikan huntingtin exon 1 dengan peregangan 25 glutamin dengan mengganti SNCA dengan fragmen Q25 di Pmyo-2:: V1S. Plasmid Pmyo-2::V1Q25 dan Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed kemudian diinjeksi dengan koin ke dalam N2 dengan pRF4. Selain itu, Pflflp-21::DsRed disuntikkan ke N2 dengan pRF4 sebagai kontrol untuk efek ekspresi berlebih protein secara umum di neuron. Untuk integrasi kromosom dari plasmid yang diperkenalkan, garis yang disuntikkan terpapar radiasi UV. Setelah iradiasi UV, setiap jalur terintegrasi disilangkan 4 kali dengan N2. Jalur transgenik ganda yang membawa Pmyo-2::V1S dan Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed dihasilkan dengan mengawinkan jalur Pmyo-2::V1S terintegrasi dengan jalur Pmyo terintegrasi Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed line. Semua cacing transgenik ini menunjukkan fenotipe roller dan ekspresi DsRed

fluoresensi pada neuron faring.

Pembuatan model SNCA tanpa tanda Pmyo-2::SNCA dan Pflflp-21::SNCA plasmid dirancang untuk mengekspresikan SNCA hanya dengan memperkenalkan stop codon tepat setelah urutan pengkodean SNCA dengan menggunakan QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit. Sebagai kontrol negatif, Pmyo-2::SNCA sendiri disuntikkan ke dalam cacing N2 dengan pRF4. Pmyo-2::SNCA dan Pflflp-21:: Plasmid SNCA disuntikkan secara koin ke dalam gonad cacing N2 stadium akhir L4-dengan pRF4. Semua cacing ini menunjukkan fenotipe rol dan 3 baris perwakilan dari setiap genotipe digunakan untuk percobaan. Pembuatan model BiFC terkait penuaan Pmyo-2::V1S dan Pflflp-21::SV2-Plasmid ICR-DsRed disuntikkan secara koin ke dalam gonad tahap akhir L4-daf Cacing mutan -2(e1370) dan daf-16 (mu86) dengan pRF4. Sebagai kontrol untuk model BiFC terkait penuaan, Pmyo-2::V1S atau Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed saja disuntikkan ke dalam gonad L{{30} }tahap cacing mutan N2 dan daf-16(mu86) dengan pRF4. Setelah beberapa galur transgenik yang mengandung plasmid yang diperkenalkan diperoleh, 3 galur representatif di setiap latar belakang mutan digunakan untuk percobaan.

Pembuatan garis transgenik hlh-30p::hlh-30

Sebuah plasmid yang mengekspresikan hlh-30p::hlh-30::gfp adalah hadiah yang murah hati dari Dr. Malene Hansen (Sanford-Burnham Medical Research Institute, CA, USA). Plasmid hlh-30p::hlh-30 dirancang untuk memperkenalkan kodon stop sebelum urutan pengkodean GFP menggunakan QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit untuk menghambat ekspresi GFP. Sebagai kontrol, setiap Pmyo-2::V1S atau Pflflp-21::SV2-ICRDsRed dan hlh-30p::hlh-30 diinjeksikan ke dalam gonad dari cacing N2 stadium akhir L4-dengan pRF4. Plasmid yang mengekspresikan Pmyo-2::V1S, Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed dan hlh-30p::hlh-30 disuntikkan secara koin ke dalam gonad cacing mutan L4-tahap daf-16(mu86) mutan dengan pRF4. Untuk menganalisis disfungsi lisosom, cacing mutan asp-4(ok2693) dan asp-1(tm666), di mana gen cathepsin enzim lisosomal tidak aktif, digunakan. Plasmid Pmyo-2::V1S dan Pflflp-21::SV2-ICR-DsRed disuntikkan dengan koin ke dalam gonad cacing mutan L4-tahap akhir dengan pRF4. Setelah galur transgenik yang mengandung plasmid introduksi diperoleh, 3 galur representatif dari masing-masing genotipe digunakan untuk percobaan.

Mikroskop imunofluoresensi

Untuk pewarnaan cacing imunofluoresensi, N2 tipe liar dan cacing transgenik dikumpulkan, dicuci dengan buffer M9 (22 mM KH2PO4, 22 mM Na2HPO4, 85 mM NaCl, 1 mM MgSO4), dan kemudian difiksasi awal dengan paraformaldehyde 4 persen di MRWB ( 80 mM KCl, 20 mM NaCl, 1{{60}} mM EGTA, 5 mM spermidine [Sigma-Aldrich, S0266], 50 persen metanol). Untuk mengurangi kekakuan lapisan kutikula untuk penetrasi, cacing mengalami beberapa siklus pembekuan/pencairan menggunakan nitrogen cair, dan diinkubasi dengan agitasi pada suhu 4 C selama 2 jam. Karena langkah reduksi dan oksidasi meningkatkan permeabilitas cacing, cacing dicuci dengan buffer Tris-Triton (100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 persen Triton X-100 [Bio-Rad laboratory Inc., 161– 0407], 1 mM EDTA), dan diinkubasi dengan 1 persen b-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, M7522) dalam buffer Tris-Triton pada suhu kamar (RT) selama 2 jam. Selanjutnya, cacing diinkubasi dalam larutan kolagenase (100 unit kolagenase tipe IV [Worthington Biochemical Co., LS004188] dalam 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM CaCl2, 0,1 persen Triton X-100) dengan rotasi selama 4 jam di RT. Kemudian cacing diinkubasi dalam buffer Tris-Triton ditambah dengan 0,3 persen H2O2 (Sigma-Aldrich, H1009) selama 15 menit di RT. Setelah inkubasi dalam buffer pemblokiran (0,1 persen albumin serum sapi [BSA; Sigma-Aldrich, A7906], 0,5 persen Triton X-100, 1 mM EDTA dalam saline buffer fosfat [PBS; GenDEPOT, CAP08-050 ]), cacing diinkubasi dengan antibodi monoklonal 274 mAb10 semalaman pada suhu 4 C dalam larutan antibodi primer (1 persen BSA, 0,5 persen Triton X-100, 1 mM EDTA dalam PBS). Keesokan harinya, cacing dicuci dengan buffer pemblokiran dan diinkubasi dengan IgG anti-tikus kambing terkonjugasi-X rhodamin merah (1:100; Jackson Immunoresearch Laboratories, 115-295-166) selama 2 jam. Cacing kemudian dicuci dengan buffer pemblokiran dan dipasang di reagen Antifade (Invitrogen, P36930). Sampel dianalisis menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Olympus FV1000 (Olympus, Tokyo, Jepang).

Mikroskop fluoresensi cacing hidup

Cacing diimobilisasi dengan 10 mM natrium azida dalam buffer M9, dan ditutup dengan kaca penutup. Gambar cacing diperoleh dengan menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Olympus FV1000.

blotting Barat

Cacing dewasa dicuci dengan buffer M9 dan selanjutnya dengan PBS yang mengandung 1 persen Triton X-100. Pelet cacing disonikasi dalam PBS yang mengandung 1 persen Triton X-100, koktail penghambat protease 1 persen (vol/vol) (Sigma-Aldrich, P8340) dan disentrifugasi untuk mendapatkan larutan Triton (supernatan ) dan fraksi -tidak larut (pelet). Konsentrasi protein diukur menggunakan uji protein BCA (Pierce Biotechnology, 23223 dan 23224). Sampel protein (3 mg untuk uji ekspresi SNCA, 50 mg untuk mendeteksi protein poliubiquitin, dan 20 mg (garis V1S, V1SCSV2) dan 40 mg (garis SV2) untuk kelarutan diferensial SNCA) dimuat ke dalam gel SDS-PAGE 12 persen. Antibodi utama yang digunakan untuk western blotting adalah antibodi anti-SNCA monoklonal, 274 mAb (1:1.500) dan Syn-1 (1:1.500; BD BioScience, 610787), dan antibodi anti-ubiquitin (1:3,{ {35}}; Abcam, ab7254). Deteksi chemiluminescence dilakukan menggunakan LAS-3000 luminescence image analyzer (Fujifilm, Tokyo, Japan) dan Amersham imager 600 (Ge Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA), dan perangkat lunak Multi Gauge (v3.0) (Fujifilm , Tokyo, Jepang).

Noda titik

Cacing dewasa dari setiap strain dicuci dengan buffer M9 dan selanjutnya dengan PBS yang mengandung 1 persen Triton X-100. Pelet cacing disonikasi dalam PBS yang mengandung 1 persen Triton X-100 dan koktail protease inhibitor 1 persen (vol/vol). Sampel protein (500 ng) dimasukkan ke dalam membran nitroselulosa, yang kemudian dikeringkan dan diinkubasi dalam larutan penghambat. Antibodi utama yang digunakan untuk dot blotting adalah antibodi anti-SNCA monoklonal 274 mAb dan Syn-O2,13 yang terakhir khusus untuk agregat SNCA. Deteksi chemiluminescence dilakukan menggunakan LAS-3000 luminescence image analyzer dan Amersham imager 600, dan perangkat lunak Multi Gauge (v3.0).

Perawatan agen anti-penuaan

N-acetylglucosamine (GlcNAc) (Sigma-Aldrich, A8625) dilarutkan dalam air suling hingga 1 M sebagai larutan stok. Larutan stok diencerkan dengan media cair LB (Sigma-Aldrich, L3022). Cacing stadium L4-dari setiap jalur transgenik dipindahkan ke pelat NGM yang mengandung konsentrasi akhir 10 mM GlcNAc. PCR Cacing Tunggal Cacing tunggal gravid dari setiap lini dilisiskan dalam buffer lisis (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 persen NP-40 [IGEPAL; Sigma-Aldrich, I3021], 0,45 persen Tween 20 [Sigma-Aldrich, P1379]) dengan 0,1 mg/ml proteinase K (Sigma Aldrich, P4850). Cacing tunggal dalam buffer dikenai beberapa siklus beku-cair menggunakan nitrogen cair, diinkubasi pada suhu 65 C selama 1 jam untuk melepaskan DNA genom, dan kemudian dipanaskan pada suhu 95 C selama 15 menit untuk menonaktifkan proteinase K. Analisis PCR cacing tunggal dilakukan dilakukan menggunakan Ex TaqTM polimerase (Takara Biotechnology, RR001A) dalam sistem Bio-Rad MyCycler PCR Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).

Genotipe polimorfisme panjang fragmen restriksi PCR

Cacing Gravid 5 dari setiap garis dilisiskan dalam buffer lisis dengan 0.1 mg/ml proteinase K. Cacing dalam buffer dikenai beberapa siklus beku-cair menggunakan nitrogen cair, diinkubasi pada suhu 65 C selama 1 jam untuk melepaskan DNA genom, dan kemudian dipanaskan pada 95 C selama 15 menit untuk menonaktifkan proteinase K. Setelah melakukan PCR, produk PCR dicerna dengan enzim NcoI (New England Biolabs Inc., R3193S), pada suhu 37 C semalam dan dielektroforesis untuk mendeteksi restriksi. polimorfisme panjang fragmen.

PCR kuantitatif (qPCR)

Cacing transgenik dewasa dikumpulkan dan dicuci dalam buffer M9. Cacing dalam buffer disonikasi dan sampel mengalami beberapa siklus beku-cair menggunakan nitrogen cair. RNA diekstraksi dengan Reagen Trizol (Invitrogen, 15596-026) dan dimurnikan menggunakan kit mini RNeasy (Qiagen, 74106). Setiap cDNA disintesis dari 500 ng RNA total menggunakan kit sintesis cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories Inc., 170–8891). Untuk PCR real-time, gen target dan primer spesifik dicampur dengan SYBR Premix Ex Taq II (Takara Biotechnology, RR081A) di pelat sumur 96-. Primer spesifik yang sebelumnya dirancang oleh kelompok lain digunakan.14 Produk DNA dianalisis menggunakan sistem PCR 7500 Real-Time (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Level mRNA relatif dari gen target dinormalisasi untuk bertindak-1.

Perlakuan kejut panas terhadap mutan dyn-1

Cacing transgenik ganda (Pmyo-2::V1S C Pflflp-21::SV2-ICR DsRed) dikawinkan dengan cacing mutan dyn-1(ky51).20 Dewasa cacing induk dari galur transgenik ganda, dengan atau tanpa mutasi dyn-1(ky51), dibiakkan pada pelat NGM yang mengandung E. coli OP50 selama 4 jam pada suhu 20 C untuk bertelur, dan kemudian dibuang. Cacing keturunan yang disinkronkan dari setiap galur pada tahap L4-dikultur pada suhu 30 C untuk pengamatan.

Analisis pemompaan faring

Pemompaan faring dihitung selama 1 menit di RT menggunakan mikroskop fluoresensi. N2 tipe liar, mutan dan cacing transgenik dianalisis. Data dinyatakan sebagai PPM (pompa per menit).

Uji rentang hidup

Telur yang diletakkan oleh induk cacing dewasa ditumbuhkan secara serempak hingga tahap larva L4 pada lempeng NGM yang diunggulkan dengan E. coli OP50 pada suhu 20 C. Cacing tahap L4-dipindahkan ke lempeng NGM yang mengandung 100 mM 5- flfluoro-20 -deoxyuridine (Sigma-Aldrich, F0503) untuk mencegah mereka menghasilkan keturunan. Jumlah cacing yang hidup atau mati dicatat setiap satu atau 2 hari. Cacing yang pecah, menggali, atau merangkak dari piring disensor tetapi dimasukkan dalam analisis masa hidup sebagai hewan yang disensor. Data kelangsungan hidup dianalisis dengan menggunakan OASIS (aplikasi online untuk analisis kelangsungan hidup uji rentang hidup.

Analisis statistik

Semua percobaan dilakukan dengan kode buta dan diulang setidaknya 3 kali. Nilai dalam gambar dinyatakan sebagai perbedaan rata-rata dianggap signifikan jika nilai P adalah § < SEM. 0.05. Grafik digambar menggunakan perangkat lunak Prism 5 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA). Nilai dibandingkan dengan ANOVA satu arah dengan uji posthoc Tukey menggunakan perangkat lunak InStat (versi 3.05) (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Singkatan

Aktin ACTB, b

penyakit Alzheimer

Ab amiloid b

Sklerosis lateral amiotrofik ALS

Komplementasi fluoresensi bimolekuler BiFC

GlcNAc N-asetilglukosamin

Penyakit PD Parkinson

Pengungkapan potensi konflik kepentingan

Tidak ada potensi konflik kepentingan yang diungkapkan.

Pendanaan

Pekerjaan ini didukung oleh hibah National Research Foundation (NRF) yang didanai oleh Pemerintah Korea (MEST) (NRF-2015R1A2A1A10052540, NRF-2015R1A2A1A15053661), dan Proyek R&D Teknologi Kesehatan Korea, Kementerian Kesehatan & Kesejahteraan, Republik Korea (HI14C0093), serta Program Brain Pool KU 2014 dari Universitas Konkuk.

Referensi

[1] Brundin P, Melki R, Kopito R. Transmisi agregat protein seperti prion pada penyakit neurodegeneratif. Nat Rev Mol Sel Biol 2010; 11:301-7; PMID:20308987;http://dx.doi.org/10.1038/nrm2873

[2] Lee SJ, Desplats P, Sigurdson C, Tsigelny I, Masliah E. Transmisi sel ke sel agregat protein non-prion. Nat Rev Neurol 2010; 6:702-6; PMID:21045796; http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2010.145

[3] Jucker M, Pejalan LC. Perbanyakan sendiri agregat protein patogen pada penyakit neurodegeneratif. Alam 2013; 501:45-51; PMID:24005412;http://dx.doi.org/10.1038/nature12481

[4] Bae EJ, Lee HJ, Rockenstein E, Ho DH, Park EB, Yang NY, Des plats P, Masliah E, Lee SJ. Pembersihan a-synuclein ekstraseluler yang dibantu antibodi mencegah transmisi agregat sel-ke-sel. J Neurosci 2012; 32:13454-69; PMID:23015436; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.1292-12.2012

[5] Tran HT, Chung CH, Iba M, Zhang B, Trojanowski JQ, Luk KC, Lee VM. Imunoterapi alfa-sinuklein memblokir pengambilan dan propagasi templat dari a-sinuklein dan neurodegenerasi yang salah lipatan. Perwakilan Sel 2014; 7:2054-65; PMID:24931606; http://dx.doi.org/10.1016/j. perwakilan sel.2014.05.033

[6] Lee HJ, Bae EJ, Lee SJ. Extracellular a–synuclein-a novel dan faktor penting dalam penyakit tubuh Lewy. Nat Rev Neurol 2014; 10:92-8; PMID:24468877;http://dx.doi.org/10.1038/nrneurol.2013.275

[7] Outeiro TF, Putcha P, Tetzlaff JE, Spoelgen R, Koker M, Carvalho F, Hyman BT, McLean PJ. Pembentukan spesies a-synuclein oligomer beracun dalam sel hidup. PLoS Satu 2008; 3:e1867; PMID:18382657; http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0001867

[8] McKay JP, Raizen DM, Gottschalk A, Schafer WR, Avery L. makan-2 dan makan-18 diperlukan untuk transmisi saraf nikotinik di faring Caenorhabditis elegans. Genetika 2004; 166:161-9; PMID:15020415; http://dx.doi. org/10.1534/genetics.166.1.161

[9] Rogers C, Reale V, Kim K, Chatwin H, Li C, Evans P, de Bono M. Penghambatan makan sosial Caenorhabditis elegans oleh FMRFamide terkait aktivasi peptida NPR-1. Nat Neurosci 2003; 6:1178-85; PMID:14555955;http://dx.doi.org/10.1038/nn1140

[10] Lee HJ, Bae EJ, Jang A, Ho DH, Cho ED, Suk JE, Yun YM, Lee SJ. Tes imunosorben terkait-enzim untuk a-synuclein dengan spesifisitas spesies dan keadaan multimerik. Metode J Neurosci 2011; 199:249-57; PMID:21658411; http://dx.doi.org/10.1016/j. Nemeth.2011.05.020

[11] Kenyon C, Chang J, Gensch E, Rudner A, Tabtiang R. A C. elegans mutan yang hidup dua kali lebih lama dari tipe liar. Alam 1993; 366:461-4; PMID:8247153;http://dx.doi.org/10.1038/366461a0

[12] Denzel MS, Storm NJ, Gutschmidt A, Baddi R, Hinze Y, Jarosch E, Sommer T, Hoppe T, Antebi A. Metabolit jalur hexosamine meningkatkan kontrol kualitas protein dan memperpanjang usia. Sel 2014; 156:1167-78; PMID:24630720; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.061

[13] Vaikath NN, Majbour NK, Paleologou KE, Ardah MT, van Dam E, van de Berg WD, Forrest SL, Parkkinen L, Gai WP, Hattori N, dkk. Pembuatan dan karakterisasi antibodi monoklonal spesifik konformasi baru untuk patologi a-synuclein. Neuro biol Dis 2015; 79:81-99; PMID:25937088; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.nbd.2015.04.009

[14] Lapierre LR, De Magalhaes Filho CD, McQuary PR, Chu CC, Visvikis O, Chang JT, Gelino S, Ong B, Davis AE, Irazoqui JE, dkk. Ortolog TFEB HLH-30 mengatur autophagy dan memodulasi umur panjang di Caenorhabditis elegans. Nat Commun 2013; 4:2267; PMID:23925298

[15] Vilchez D, Morantte I, Liu Z, Douglas PM, Merkwirth C, Rodrigues AP, Manning G, Dillin A. RPN-6 menentukan umur panjang C. elegans dalam kondisi stres proteotoksik. Alam 2012; 489:263-8; PMID:22922647;http://dx.doi.org/10.1038/nature11315

[16] Hansen C, Angot E, Bergstrom AL, Steiner JA, Pieri L, Paul G, Outeiro TF, Melki R, Kallunki P, Fog K, dkk. a-Synuclein menyebar dari otak tikus ke neuron dopaminergik yang dicangkokkan dan agregasi biji dalam sel manusia yang dikultur. J Clin Investasikan 2011; 121:715-25; PMID:21245577;http://dx.doi.org/10.1172/JCI43366

[17] Bae EJ, Yang NY, Song M, Lee CS, Lee JS, Jung BC, Lee HJ, Kim S, Masliah E, Sardi SP, dkk. Deplesi glucocerebrosidase meningkatkan transmisi sel-ke-sel dari a-synuclein. Nat Commun 2014; 5:4755; PMID:25156829; http://dx.doi.org/10.1038/ncomms5755

[18] Lee HJ, Suk JE, Bae EJ, Lee JH, Paik SR, Lee SJ. Endositosis yang bergantung pada perakitan dan pembersihan a-synuclein ekstraseluler. Int J Biochem Sel Biol 2008; 40:1835-49; PMID:18291704; http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biocel.2008.01.017

[19] Desplats P, Lee HJ, Bae EJ, Patrick C, Rockenstein E, Crews L, Spen cer B, Masliah E, Lee SJ. Pembentukan inklusi dan kematian sel neuron melalui transmisi neuron-ke-neuron dari a-synuclein. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:13010-5; PMID:19651612; http://dx.doi. org/10.1073/pnas.0903691106

[20] Clark SG, Shurland DL, Meyerowitz EM, Bargmann CI, van der Bliek AM. Mutasi dynamin GTPase menyebabkan cacat gerak yang diinduksi suhu yang cepat dan reversibel pada C. elegans. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:10438-43; PMID:9294229; http://dx.doi.org/ 10.1073/pnas.94.19.10438

[21] Lee HJ, Cho ED, Lee KW, Kim JH, Cho SG, Lee SJ. Autophagic fail ure mempromosikan eksositosis dan transfer antar sel dari a-synuclein. Exp Mol Med 2013; 45:e22; PMID:23661100; http://dx.doi.org/ 10.1038/emm.2013.45

[22] Syntichaki P, Xu K, Driscoll M, Tavernarakis N. Protease aspartyl dan calpain spesifik diperlukan untuk degenerasi saraf pada C. elegans. Alam 2002; 419:939-44; PMID:12410314; http://dx.doi.org/10.1038/nature01108

[23] Sardiello M, Palmieri M, di Ronza A, Medina DL, Valenza M, Gennarino VA, Di Malta C, Donaudy F, Embrione V, Polishchuk RS, dkk. Jaringan gen yang mengatur biogenesis dan fungsi lisosom. Sains 2009; 325:473-7; PMID:19556463

[24] Grove CA, De Masi F, Barrasa MI, Newburger DE, Alkema MJ, Bulyk ML, Walhout AJ. Jaringan multiparameter mengungkapkan perbedaan yang luas antara faktor transkripsi C. elegans bHLH. Sel 2009; 138:314-27; PMID:19632181; http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.058

[25] Klucken J, Poehler AM, Ebrahimi-Fakhari D, Schneider J, Nuber S, Rockenstein E, Schlotzer-Schrehardt U, Hyman BT, McLean PJ, Masliah E, dkk. Agregasi alfa-sinuklein melibatkan jalur autophagy sensitif bafilomycin A 1-. Autofagi 2012; 8:754-66; PMID:22647715; http://dx.doi.org/10.4161/auto.19371

[26] Yu WH, Dorado B, Figueroa HY, Wang L, Planel E, Cookson MR, Clark LN, Duff KE. Aktivitas metabolik menentukan kemanjuran pembersihan makro-autophagic dari a-synuclein oligomer patologis. Am J Pathol 2009; 175:736-47; PMID:19628769; http://dx.doi.org/10.2353/ajpath.2009.080928

[27] Kilpatrick K, Zeng Y, Hancock T, Segatori L. Aktivasi genetik dan kimia dari TFEB memediasi pembersihan agregat a-synuclein. PloS satu 2015; 10:e0120819; PMID:25790376; http://dx.doi.org/ 10.1371/journal.pone.0120819

[28] Lee HJ, Khoshaghideh F, Patel S, Lee SJ. Pembersihan zat antara oligomer a-synuclein melalui jalur degradasi lisosom. J Neurosci 2004; 24:1888-96; PMID:14985429; http://dx.doi.org/ 10.1523/JNEUROSCI.3809-03.2004