Long Non-Coding RNA KCNQ1OT1 Mengatur Protein Kinase CK2 Melalui MiR-760 dalam Penuaan Dan Pembatasan Kalori

Kata kunci:KCNQ1OT1; RNA non-coding yang panjang; penuaan;pembatasan kalori; protein kinase CK2;miR-760

Klik Disini Untuk Mendapatkan Info Lebih Lanjut Tentang Cistanche Anti-Aging Effects

1. Perkenalan

RNA non-coding panjang (lncRNAs) adalah transkrip dengan ukuran lebih besar dari 200 nukleotida yang tidak diterjemahkan menjadi protein. LncRNA bertanggung jawab atas beragam fungsi, termasuk regulasi transkripsi dicisatautrans, organisasi domain nuklir, dan interaksi dengan microRNAs (miRNAs) [1–3]. Secara khusus, memahami jaringan interaksi lncRNA dan miRNA memberikan perspektif baru tentang mekanisme pengaturan gen. lncRNAKCNQ1OT1, nama lengkapnya adalahKCNQ1tumpang tindih transkrip 1, adalah transkrip 91 kb yang ditranskripsi oleh RNA polimerase II dalam orientasi antisense, relatif terhadapKCNQ1[4,5]. KCNQ1OT1hadir dalam intron 10 dari gen KCNQ1. ItuKCNQ1lokus terletak di lengan pendek kromosom manusia 11 (11p15.5). Melalui perekrutan G9a dan H3K27 histone methyltransferase PRC2 (polycomb repressive complex 2),KCNQ1OT1berinteraksi dengan kromatin untuk membentuk struktur pelipatan yang kompleks dan kemudian membungkam banyak gen target [6]. Selain itu,KCNQ1OT1terlibat dalam beberapa gangguan, termasuk penyakit jantung, stroke iskemik serebral, aterosklerosis, piroptosis, dan berbagai kanker (lambung, ovarium, dan kolorektal) dengan mengikat berbagai miRNA (misalnya, miR-760, miR{{1} }a, miR-452-3p, miR-320a, miR-701-3p, dan miR-2054), semuanya mengatur ekspresi gen target mereka [7–13]. Namun demikian, peran biologis dariKCNQ1OT1dalam penuaan dan pembatasan kalori (CR) masih belum jelas.

Penuaan seluler adalah penghentian proliferasi terminal, dirangsang oleh beberapa tekanan seluler seperti pemendekan telomer, aktivasi onkogenik, dan stres oksidatif.14,15]. Studi sebelumnya mengidentifikasi protein kinase CK2 (CK2), terdiri dari dua katalitik ( dan/atau 0 ) subunit dan dua regulator subunit, sebagai pengatur penuaan. CK2penghambatan memicu ekspresi beberapa penanda penuaan, termasuk terkait penuaan -galaktosidase (SA- -gal) aktivitas [16], p53–p21Cip1/WAF1aktivasi sumbu [17], produksi spesies oksigen reaktif (ROS) [18], pembentukan fokus heterokromatin terkait penuaan (SAHF) [19], dan ekspresi fenotip sekretori terkait penuaan (SASP) [20]. miR-186, miR-216b, miR-337-3p, dan miR-760 mempromosikan penuaan seluler dengan menghambat CK2 [21,22]. Pembatasan kalori (CR), terdiri dari pengurangan kronis asupan kalori total tanpa malnutrisi, adalah strategi paling sukses untuk menunda penuaan seluler [23]. Baru-baru ini dilaporkan bahwa CK2 diregulasi oleh CR dan menginduksi autophagy [24]. Namun, mekanisme molekuler yang mendasari upregulasi CK2 yang dimediasi CR masih belum jelas.

Dalam penelitian ini, peran potensial dariKCNQ1OT1dalam penuaan dan CR dinilai.KCNQ1OT1knockdown mempromosikan fenotipe penuaan melalui downregulating CK2 pada sel kanker MCF-7 dan HCT116 manusia serta sel IMR fibroblas paru-90. Penelitian ini menunjukkan bahwaKCNQ1OT1meningkatkan CK2 ekspresi melalui interaksi dengan miR-760 selama penuaan dan CR, menunjukkan hal ituKCNQ1OT1mungkin menjadi target terapi baru untuk penyakit terkait penuaan.

2. Hasil

2.1. KCNQ1OT1 Knockdown Menginduksi Aktivasi SA- -gal Pewarnaan, p53-p21Cip1/WAF1Jalur, dan Trimetilasi H3K9 Melalui CK2 Pembungkaman pada Sel Kanker Manusia

Sel MCF-7 dan HCT116 ditransfusikanKCNQ1OT1siRNA untuk menyelidiki keterlibatanKCNQ1OT1dalam penuaan.KCNQ1OT1knockdown upregulated SA- aktivitas -gal (Gambar1A). Selain itu, hasil imunoblot menunjukkan hal ituknockdown KCNQ1OT1meningkatkan level p53 dan p21Cip1/WAF1, dan keunggulan SAHF (peningkatan trimetilasi H3K9 (H3K9me3) dan penurunan asetilasi H3K9 (H3K9Ac)) (Gambar1B). Sebelumnya dilaporkan bahwa downregulasi CK2 menginduksi penanda penuaan ini (aktivasi SA- pewarnaan -gal, p53-p21Cip1/WAF1jalur, dan SAHF) [16,17,19]. Oleh karena itu, diperiksa apakahKCNQ1OT1berinteraksi dengan CK2. Menariknya, CK2 ektopik ekspresi membatalkan induksi SA- aktivitas -gal, p53, p21Cip1/WAF1, dan H3K9me3, dimediasi olehKCNQ1OT1downregulasi (Gambar1A, B). Lebih-lebih lagi,knockdown KCNQ1OT1mengurangi tingkat protein CK2 (Angka1B). Hasil ini secara kolektif menunjukkan hal ituKCNQ1OT1knockdown menginduksi penuaan seluler dengan menurunkan regulasi CK2.

2.2. KCNQ1OT1 Knockdown Menginduksi Ekspresi Faktor SASP dan Pembuatan ROS Melalui CK2 Pembungkaman pada Sel Kanker Manusia

Itu diselidiki apakahKCNQ1OT1downregulasi meningkatkan ekspresi faktor SASP karena laporan bahwa sel-sel tua mengeluarkan faktor pro-inflamasi [14,15]. KCNQ1OT1knockdown menginduksi ekspresi faktor SASP, termasuk interleukin (IL)-1 , IL-6, dan matrix metalloproteinase (MMP) 3 (Gambar2A). KCNQ1OT1downregulasi meningkatkan jumlah ROS intraseluler karena stres oksidatif merupakan penyebab utama penuaan [14,15]. Untuk tujuan ini, sel HCT116 dan MCF-7 ditransfusikanKCNQ1OT1siRNA dan diwarnai dengan CM-H2DCFDA.KCNQ1OT1knockdown meningkatkan produksi ROS, seperti yang ditunjukkan oleh pergeseran yang tepat dalam fluoresensi FL selama sitometri flflow (Gambar2B). Sebelumnya dilaporkan bahwa downregulation CK2 menginduksi ekspresi SASP [20] dan generasi ROS [18]. Ekspresi ektopik CK2 membatalkan induksi ekspresi faktor SASP dan generasi ROS, dimediasi olehKCNQ1OT1downregulasi (Gambar2A, B). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwaKCNQ1OT1knockdown menginduksi generasi ROS dan peradangan melalui downregulating CK2.

Gambar 1. KCNQ10Knockdown T1 menginduksi aktivasi SA--pewarnaan gal, jalur p53-p21CipI/WAF, dan trimetilasi H3K9 melalui pembungkaman CK2x dalam sel kanker manusia. Sel HCT116 dan MCF{{10}} ditransfeksi dengan siRNA KCNO10T1 selama dua hari tanpa kehadiran pcDNA3.1.HA-CK2x. (A) Sel diwarnai dengan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside, dan gambar yang representatif diperoleh pada perbesaran 20x (atas). Bilah skala=100 um. Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. Grafik mewakili persentase sel bernoda biru (bawah). (B) Immunoblotting digunakan untuk menentukan tingkat setiap protein menggunakan antibodi spesifik (atas). 3-Aktin digunakan sebagai kontrol, Grafik mewakili kuantisasi setiap protein relatif terhadap B-aktin (bawah). Data dilaporkan sebagai SEM rata-rata.* p <0,05; ** p <0,01, ** p <0,001.H3K9me3, trimetilasi histon H3 Lys9; H3K9AC, asetilasi H3 Lys9.

Gambar 2. Ekspresi faktor KCNQ10Knockdown T1 yang diinduksi senescence-associated secretory phenotype (SASP) dan generasi spesies oksigen reaktif (ROS) melalui pembungkaman CK2x dalam sel kanker manusiaHCT116 dan sel MCF-7 ditransfusikan dengan KCNO1{ {20}}T1 siRNA selama dua hari tanpa kehadiran pcDNA3.1-HA-CK2a. ( A ) Tingkat setiap mRNA ditentukan oleh reaksi berantai transkripsi-polimerase terbalik (RT-PCR) menggunakan primer spesifik (atas). Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. Grafik mewakili kuantisasi setiap mRNA relatif terhadap 6-aktin (bawah). (B) Sel-sel diinkubasi dengan 10 UM CM-HDCEDA Intensitas fluoresensi ditentukan dengan analisis flow cytometry (atas). Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. Grafik menunjukkan tingkat fluoresensi relatif (bawah)Data dilaporkan sebagai rata-rata 士 SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.

2.3. KCNQ1OT1 Terlibat dalam Lipopolysaccharide (LPS)-Mediated SASP Factor Expression Via Silencing CK2 dalam Sel Kanker Manusia

Karena pengobatan dengan LPS menyebabkan penuaan seluler dengan menurunkan regulasi CK2 [20], diuji apakah LPS diturunkan regulasinyaKCNQ1OT1ekspresi. Pengobatan dengan LPS (6µg/µL) mengurangi tingkat transkripCK2 DanKCNQ1OT1dalam sel kanker manusia (Gambar3A). Selanjutnya, efek dariKCNQ1OT1pada ekspresi faktor SASP dalam sel yang diobati dengan LPS diselidiki. Namun, pengobatan dengan LPS (6µg/µL) meningkatkan faktor SASP (IL-1 , IL-6, dan MMP3) dalam sel kanker manusia; pengobatan tambahan dengan pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181–37.140) membatalkan induksi faktor SASP yang dimediasi LPS (Gambar3B). Sebelumnya ditunjukkan bahwa tindakan bersama dari miR-760, miR- 186, miR-337-3p, dan miR-216b merangsang penuaan dini dengan membungkam CK2 protein dalam sel HCT116 [21], dan bahwa miR-760 dan miR-186 diregulasi dalam sel IMR tua replikatif-90 [22]. Pola ekspresi miRNA yang dipengaruhi oleh pengobatan dengan LPD ditentukan. Analisis kuantitatif real-time polymerase chain reaction (qPCR) mengungkapkan bahwa jumlah miR-760 meningkat lebih dari 200 persen pada sel HCT116 dan MCF-7 yang diobati dengan LPS (6µg/µL), dibandingkan dengan sel kontrol. miR-186 tidak diregulasi oleh pengobatan LPS, dan miR-337-3p dan miR-216b diatur secara berbeda dalam sel-sel ini (Gambar3C). Dengan demikian, hasil ini secara kolektif menunjukkan bahwa LPS meningkatkan jumlah miR-760 melalui penurunan regulasiKCNQ1OT1, menghasilkan CK2 penuaan yang dimediasi oleh downregulation.

Gambar 3. KCNO10T1 terlibat dalam lipopolysaccharide (LPS)-mediated-senescence-associated secretory phenotype (SASP) factor expression melalui pembungkaman CK2x dalam sel kanker manusia. (A) Sel HCT116 dan MCF-7 dirawat dengan LPS (6 ug/uL) selama dua hari. Level setiap mRNA ditentukan oleh RI-PCR menggunakan primer spesifik (atas). Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. B-Actin digunakan sebagai kontrol. Grafik mewakili kuantisasi setiap mRNA relatif terhadap B-aktin (bawah). (B) Sel diperlakukan dengan LPS (6 ug/uL) jika tidak ada atau ada pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) untuk dua hari. Tingkat setiap mRNA ditentukan oleh RI-PCR menggunakan primer spesifik (kiri). Data representatif dari tiga eksperimen independen menunjukkan bahwa 3-Actin digunakan sebagai kontrol. Grafik mewakili kuantisasi masing-masing mRNA relatif terhadap -aktin (kanan). (C) Sel diperlakukan dengan LPS (6 ug/uL) selama dua hari RNA total diisolasi dari sel dan dilakukan analisis PCR untuk menentukan tingkat relatif miR-760, miR-186, miR{{ 26}}p, dan miR-216b menggunakan RNU48 untuk normalisasi. Data ditampilkan sebagai tema 士 SEM.*p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.

2.4. KCNQ1OT1 Diregulasi CK2 oleh Sponging miR-760 di Sel Kanker Manusia

Selanjutnya diperiksa apakahKCNQ1OT1mengatur CK2 ekspresi melalui miR-760. Sel HCT116 dan MCF-7 ditransfeksi dengan pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181–37.140) atau siRNA KCNQ1OT1, bersama dengan miR-760 mimik atau inhibitor (urutan ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1). Ekspresi ektopik dariKCNQ1OT1(36.181–37.140) meningkatkan level mRNACK2 , sedangkan perawatan tambahan dengan miR-760 mimik ditekanKCNQ1OT1-dimediasiCK2 upregulasi (Gambar4A). Sebaliknya,KCNQ1OT1knockdown mengurangi tingkat mRNACK2 , sedangkan pengobatan tambahan dengan penghambat miR-760 ditekanKCNQ1OT1knockdown-dimediasiCK2 downregulasi (Gambar4B). MiR-760 mimik dan inhibitor tidak dapat mengubah jumlahnyaKCNQ1OT1, menunjukkan bahwa miR-760 bukanlah regulator upstream dariKCNQ1OT1. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan hal ituKCNQ1OT1meningkatkan jumlahCK2 mRNA dengan menyeka miR-760. Tambahan Gambar S1 menunjukkan urutan dan situs pengikatanKCNQ1OT1, miR-760, danCK2 mRNA, ditentukan menggunakan TargetScan dan Miranda.

Gambar 4. KCNQ10T1 meningkatkan regulasi CK2x dengan menyeka miR-760 dalam sel kanker manusia. (A) sel HCT116 dan MCF-7 ditransfeksi dengan pcDNA3.1-KCNO10T1 (36,181-37,140) selama dua hari di tidak adanya atau adanya miR-760. (B) Sel HCT116 dan MCF-7 ditransfeksi dengan siRNA KCNO10T1 selama dua hari tanpa kehadiran atau kehadiran penghambat miR-760. Level setiap mRNA ditentukan oleh RT-PCR menggunakan primer spesifik (atas). Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. Grafik mewakili kuantisasi setiap mRNA relatif terhadap B-aktin (bawah). Data dilaporkan sebagai rata-rata 士 SEM.* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001.

2.5. Kondisi CR Diregulasi CK2x oleh miR-760 Downregulasi Melalui KCNQ1OT1 Upregulasi dalam Sel Kanker Manusia

Seharusnya ekspresi KCNQ1OT1 di-upregulasi pada kondisi CR karena level mRNA CK2x di-upregulasi pada kondisi CR [24]. Sel HCT116 dan MCF-7 diinkubasi dalam kondisi CR untuk menguji hipotesis ini. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5A, ekspresi KCNO10T1 dan CK2x diinduksi oleh CR dalam sel-sel ini di mana pengobatan tambahan dengan siRNA KCNQ10T1 menekan CK2ainduksi yang dimediasi CR, menunjukkan KCNQ10T1 sebagai pengatur positif CK2x dalam kondisi CR. Selain itu, analisis dengan qPCR waktu nyata menunjukkan bahwa level miR-760 menurun sebesar 70 persen dalam kondisi CR, sedangkan level miR-186, miR-216b, dan miR{{22 }}p dalam kondisi CR tidak berubah atau meningkat (Gambar 5B). Selanjutnya, efek miR-760 pada upregulasi CK2x yang dimediasi oleh CR diperiksa. Pengobatan dengan miR-760 meniru upregulasi CK2x yang dimediasi oleh suppresseoCR, menunjukkan miR-760 sebagai regulator negatif utama dari kondisi CK2ain CR (Gambar 5C). Terakhir, analisis gPCR waktu nyata mengungkapkan bahwa pengobatan dengan siRNA KCNO10T1 meningkatkan level miR-760, sedangkan CR menekan induksi miR-760 yang dimediasi oleh KCNO10T1 knockdown (Gambar 5D). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa CR menurunkan regulasi miR-760 dengan meningkatkan regulasi KCNQ10T1, menghasilkan peningkatan regulasi CK2x dalam sel kanker manusia. Karena telah dilaporkan bahwa lncRNA SNHG6 juga bertindak sebagai aspons miR-760 dalam sel CRC [25], diuji apakah CR meningkatkan regulasiEkspresi SNHG6. Namun,SNHG6ekspresi tidak berubah dalam kondisi CR (data tidak ditampilkan)

Gambar 5. Kondisi pembatasan kalori (CR) meningkatkan regulasi CK2x dengan menurunkan regulasi miR-760 melalui peningkatan regulasi KCNO10T1 dalam sel kanker manusia. (A,C dan D) sel HCT116 dan MCF-7 ditransfeksi dengan KCNO1{{20}}T1 siRNA (A dan D) atau miR-760 (C) selama 1,5 hari dan kemudian diinkubasi dalam kondisi CR selama tujuh jam. (B) sel HCT116 dan MCF-7 diinkubasi dalam kondisi CR selama tujuh jam. ( A, C ) Level setiap mRNA ditentukan oleh RT-PCR menggunakan primer spesifik (atas) Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. 3-Aktin digunakan sebagai grafik kontrol untuk mewakili kuantisasi setiap RNA relatif terhadap B-aktin (bawah). (B, D) Total RNA diisolasi dari sel dan dianalisis oleh qPCR menggunakan RNU48 untuk normalisasi untuk menentukan level relatif dari miRNA yang ditunjukkan Data ditampilkan sebagai rata-rata ditambah SEM * y <0,05.*p <0,01;** * p <0,001.

2.6. KCNQ1OT1 Diturunkan selama Penuaan Replikatif dalam Sel Fibroblast Paru-Paru Manusia, yang kondisi CR-nya diselamatkan

Karena CK2x diregulasi ke bawah dalam sel tua replikatif dan jaringan tua [16] diperiksa apakah KCNO1OT1 diregulasi ke bawah selama penuaan di sel IMR fibroblast paru-paru manusia-90. Knockdown KCNO10T1 menurunkan level mRNA sel CK2xin IMR-90 (Gambar 6A). Sebaliknya, knockdown KCNO1OT1 menaikkan regulasi aktivitas SA-P-gal dalam sel IMR-90, dan ekspresi ektopik CK2a membatalkan induksi aktivitas SA-3-gal yang dimediasi oleh downregulasi KCNO1OT1 (Gambar 6B). Untuk menentukan bagaimana ekspresi KCNQ10T1 menurun karena penuaan replikasi, sel IMR-90 berulang kali dilewatkan hingga keadaan seperti penuaan diamati. Sebagian besar sel di PDL 47 diwarnai positif untuk SA-B-gal, sedangkan hanya sedikit yang diwarnai positif untuk SA-B-gal di antara sel-sel bagian awal (PDL 34) (data tidak ditampilkan). Tingkat transkrip KCNO10T1 menurun 60 persen dalam sel tua replikatif (PDL 47), dibandingkan dengan sel bagian awal (PDL 34), menunjukkan bahwa KCNO10T1 diturunkan regulasinya selama penuaan replikasi. Terakhir, kondisi CR meningkatkan KCNO1OT1 sebesar 150 persen pada sel-sel saluran awal (PDL 34) dibandingkan dengan kondisi kalori normal. Namun, kondisi CR meningkatkan KCNO10T1 lebih kuat (sebesar 250 persen ) dalam replikasi sel tua (PDL 47) dibandingkan dengan kondisi kalori normal. menunjukkan bahwa CR dapat menyelamatkan penurunan ekspresi KCNO10T1 dan CK2x, yang dimediasi oleh penuaan replikasi (Gambar 6C). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa penuaan replikasi menurunkan ekspresi CK2x melalui penurunan regulasi KCNQ10T1, dan bahwa CR dapat menekan penuaan replikasi melalui sumbu KCNO1OT1-CK2

Gambar 6. KCNQ1011 diturunkan regulasinya selama penuaan replikasi dalam sel fibroblast paru-paru manusia, yang dapat diselamatkan oleh kondisi pembatasan kalori (CR). (A) sel IMR-90 (PDI36) ditransfusikan dengan KCNO10T1 siRNA. Level setiap mRNA ditentukan oleh RT-PCR menggunakan primer spesifik (atas). Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan3-Actin digunakan sebagai kontrol. Grafik mewakili kuantisasi setiap mRNA relatif terhadap 6-aktin (bawah). (B) Sel IMR-90 (PDL 36) ditransfeksi dengan siRNA KCNO10T1 selama dua hari tanpa kehadiran pcDNA3.1-HA-CK2a. Sel diwarnai dengan 5-bromo-4-chloro3-indolyl--D-galactoside, dan gambar representatif diperoleh pada perbesaran 20x (kiri) Bilah skala=100 um . Data representatif dari tiga percobaan independen ditampilkan. Grafik mewakili persentase sel bernoda biru (kanan). (C) sel IMR-90 dari PDL 34 dan PDL 47 diinkubasi dalam kondisi CR selama tujuh jam. Tingkat setiap mRNA ditentukan oleh RT-PCR menggunakan primer spesifik (kiri). Data representatif dari tiga eksperimen independen ditampilkan3-Actin digunakan sebagai kontrol. Grafik mewakili kuantisasi setiap mRNA relatif terhadap 6-aktin (kanan). Data dilaporkan sebagai rata-rata 土 SEM.* p <0,05, ** p <0,01; *** p <0,001. (D) Kemungkinan model yang mengilustrasikan peran KCNO10T1 untuk penuaan dan CR. PDL, tingkat penggandaan populasi