RNA Non-Coding Panjang KCNQ1OT1 Mengatur Protein Kinase CK2 Melalui MiR-760 dalam Penuaan Dan Pembatasan Kalori Ⅱ

3. Diskusi

Epigenetic regulation mechanisms, including microRNAs (miRNAs), nucleosome remodeling, DNA methylation, and histone modification, can change heritable phenotypes without changing the DNA sequence (26). There are two main classes of non-coding RNAs(ncRNAs): the larger long ncRNAs (IncRNAs; >200 nukleotida), dan miR.NA yang lebih kecil (21-25 nukleotida) [1-3]. KCNO10T1 awalnya diidentifikasi sebagai lncRNA, yang membungkam beberapa gen dalam lokus kcng1 melalui pembentukan struktur kromatin tingkat tinggi (4 61. Baru-baru ini, lainnyafungsi biologis KCNO1OT1telah dilaporkan termasuk yang terkait denganfibros,iskemia serebral,stroke aterosklerosis, onkogenesis, diferensiasi osteogenik, penyembuhan patah tulang, Danhipertrofi jantung(7-13). Namun, mekanisme terperinci dimana KCNO10T1 mengatur penuaan seluler dan CR masih belum diketahui. Oleh karena itu, kami berusaha mengklarifikasi apakah KCNO10T1 terlibat dalam penuaan dan CR. Studi ini menunjukkan bahwa knockdown KCNO10T1 menginduksi beberapa penanda penuaan seluler, termasuk induksi aktivitas SA--gal, aktivasi jalur p53-21Cip1/WAF1, peningkatan trimetilasi H3K9 yang diperlukan untuk pembentukan SAHF dan faktor SASP (L{{ 13}}, ekspresi IL-6, dan MMP3), pada sel kanker manusia HCT116 dan MCF-7(Gambar 1 dan 2A). Karena stres oksidatif adalah penyebab penuaan yang signifikan (14,15 efek KCNO10T1 pada pembentukan ROS telah diselidiki. Seperti yang diharapkan, KCNO1OTknockdown meningkatkan ROS intraseluler dalam sel HCT116 dan MCF-7 (Gambar 2B). Selain itu, level KCNO10T1 mRNA berkurang dalam sel-sel tua yang diinduksi LPS, dan ekspresi ektopik KCNQ10T1 menekan ekspresi faktor SASP yang dimediasi LPS dalam sel-sel kanker ini (Gambar 3A, B). Selanjutnya, knockdown KCNO10T1 menginduksi aktivitas SA-B-gal pada IMR fibroblast paru-paru manusia {39}} sel, dan ekspresi KCNO10T1 menurun selama penuaan replikasi dalam sel IMR-90 (Gambar 6). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa KCNO10T1 bertindak sebagaireagen anti-penuaanDanantioksidandalam sel kanker manusia menempel fibroblas.

Cistanche Benefits in depression

Klik Di Sini Untuk Mengetahui Lebih Banyak Suplemen Cistanche Untuk Anti Penuaan

Sebelumnya ditunjukkan bahwa knockdown Ck2 menginduksi penanda penuaan seperti pewarnaan SA-gal [16], aktivasi jalur p53-p21Cip1/WAF1(generasi 171ROS [formasi 18SAHF (19l, dan ekspresi faktor SASP 20]. Oleh karena itu, hubungan antara KCNO10T1 dan CK2 diperiksa Studi ini menunjukkan bahwa overekspresi CK2x membatalkan penanda penuaan ini yang disebabkan oleh knockdown KCNO10T1 (Gambar 1, 2 dan 6B) Selain itu, knockdown KCNO10T1 menurunkan kadar protein dan mRNA CK2x (Gambar 1B, 2A dan 4B ), dan ekspresi berlebih KCNO10T1 (36,181-37,140) merangsang tingkat mRNA CK2x (Gambar 4A), menunjukkan bahwa KCNQ1OT1 berfungsi sebagai pengatur positif CK2a dalam sel. ekspresi mRNA target (1-3]. Karena penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa miR-760 berinteraksi dengan CK2a (21,22] dan KCNO10T1 [27], jaringan pensinyalan KCNO10T1, CK2x, dan miR{{ 47}} diperiksa. Studi ini menunjukkan bahwa pengobatan tambahan dengan miR-760 meniru menekan KCNQ10T1-memediasi upregulasi CK2x, dan pengobatan tambahan dengan miR-760 inhibitor menekan KCNO10T1 CK2 yang dimediasi knockdown downregulasi (Gambar 4). Secara konsisten, pengobatan dengan LPS, yang menurunkan ekspresi KCNO10T1, meningkatkan level miR-760 (Gambar 3C). Oleh karena itu, studi ini menunjukkan bahwa jumlah RNA KCNQ1OT1 dapat mentitrasi miR-760 dan dengan demikian mengatur ketersediaan miR-760 untuk mengikat mRNA CK2x. KCNO1OT1 dan CK2a dapat melakukan crosstalk melalui kemampuan transkripnya untuk bersaing dalam pengikatan miR-760.

KSL01

Karena CR menyediakan sebuahefek anti-penuaan(23], bagaimana CR mengatur KCNQ1OT1 dan miR-760 diperiksa Studi ini menunjukkan bahwa kondisi CR meningkatkan ekspresi KCNO10T1 dan CK2x dan menurunkan level miR-760 (Gambar 5A,B). , pengobatan dengan miR-760 mimik menekan upregulasi CK2x yang dimediasi CR (Gambar 5C). Secara konsisten, knockdown KCNO10T1 meningkatkan level miR-760, sedangkan kondisi tambahan menekan miR{{19} yang dimediasi knockdown KCNQ10T1 } induksi (Gambar 5D). Akhirnya, kondisi CR menyelamatkan penurunan ekspresi KCNO1OT1 dan CK2a, yang dimediasi oleh penuaan replikatif (Gambar 6C). Secara keseluruhan, hasil ini mengungkapkan bahwa kondisi CR menurunkan regulasi miR-760 melalui upregulasi KCNO10T1, menghasilkan upregulasi CK2x dalam sel manusia. Meskipun lncRNA SNHG6 bertindak sebagai spons miR-760dalam sel CRC [25], CR tidak mengubah ekspresi SNHG6 dalam kondisi eksperimental (data tidak ditampilkan). Bagaimana CR meningkatkan regulasi KCNQ1OT1 Kelompok lain sebelumnya telah menunjukkan bahwa faktor transkripsi NFY dan -catenin mengatur KCNO10T1 (28,29). Namun, CR tidak dapat mengatur ekspresi NF-Y dan B-catenin paling tidak dalam kondisi eksperimental (data tidak ditampilkan). Dengan demikian, studi tambahan diperlukan untuk mengidentifikasi regulator hulu khusus KCNO10T1 dalam kondisi CR.

Kesimpulannya, berdasarkan hasil penelitian ini, sebuah model untuk peran KCNQ1OT1 dalam penuaan dan CR diusulkan. KCNQ1OT1 meningkatkan regulasi CK2 dengan menyeka miR-760. Jalur KCNQ1OT1–miR-760–CK2 terlibat dalam penuaan dan CR. Perawatan LPS dan pembelahan sel dalam fibroblas menginduksi penuaan dengan menurunkan regulasi KCNQ1OT1. CR menekan penuaan dengan mengaktifkan jalur KCNQ1OT1–miR-760–CK2 (Gambar 6D). Oleh karena itu, penelitian ini menyarankan KCNQ1OT1 sebagai target terapi baru pada penuaan dan penyakit terkait usia, serta pengobatan alternatif yang meniru efek CR.

4. Bahan dan Metode

4.1. Bahan

Antiboditerhadap CK2 (#sc-373894), p53 (#sc-71820), p21Cip1/WAF1 (#sc-6246), dan -actin (#sc-47778) diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antibodi spesifik untuk histone H3- (#ab1791) dan histone H3 Lys9 trimetilasi (H3K9me3) (#ab8898) dibeli dari Abcam (Cambridge, Inggris). Antibodi khusus untuk asetilasi H3 Lys9 (H3K9Ac) (#06-942), 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactoside, dan LPS diperoleh dari Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). CM-H2DCFDA diperoleh dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

4.2. Kultur Sel dan CR

Sel IMR-90 fibroblas diploid manusia diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) pada tingkat penggandaan populasi (PDL) 24. Sel MCF-7 kanker payudara manusia, sel kanker usus besar HCT116 (ATCC), dan sel IMR-90 dikultur dalam medium Eagle's Dulbecco yang dimodifikasi yang mengandung 10 persen (v/v) serum janin sapi dan 1 persen (v/v) penicillin-streptomycin, dalam atmosfer yang dilembabkan dari 95 persen (v/v) udara dan 5 persen (v/v) CO2 pada 37 ◦C. PDL sel IMR-90 dihitung menggunakan rumus PD=log(Nf/Ni)/log2, di mana Nf adalah jumlah sel akhir, dan Ni adalah jumlah awal sel unggulan. Untuk kelaparan sel (pembatasan kalori), sel-sel dengan garam buffer fosfat dicuci dua kali dan dikultur dalam larutan garam seimbang Earle (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), dengan glukosa 5,5 mM, tanpa asam amino, selama tujuh jam.

KSL16

4.3. Ekstraksi RNA dan PCR Kuantitatif Real-Time miRNA

RNA diekstraksi dari sel menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen). miRNA kuantitatif real-time PCR (qPCR) dilakukan menggunakan kit transkripsi balik miRNA TaqMan, dan melalui uji miRNA dengan sistem ABI PRISM 7000 HT (Applied Biosystems, CA, USA), mengikuti instruksi pabrik. RNA nukleolar kecil U48 (RNU48) dipilih sebagai gen referensi RNA kecil rumah tangga. PCR waktu nyata dilakukan dalam rangkap tiga dari tiga sampel cDNA yang berbeda.

4.4. Transfeksi DNA dan Interferensi RNA

Untuk menghasilkan pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181–37.140), fragmen nukleotida dari 36.181 menjadi 37.140 KCNQ1OT1 disintesis secara kimiawi dan diikat ke situs BamHI/NotI dari vektor pcDNA3.1 (Invitrogen). Sel ditransfeksi dengan pcDNA3.1-HA-CK2 dan pcDNA3.1-KCNQ1OT1 (36.181– 37.140) menggunakan Polyfect (Qiagen, Hilden, Jerman), sesuai dengan instruksi pabriknya. Mimik untuk miR-760 dan kontrol miRNA dibeli dari Genolution, Inc. (Seoul, Korea). Inhibitor antisense untuk miR-760 diperoleh dari Panagene, Inc. (Seoul, Korea). Urutan siRNA untuk CK2 adalah 50 -GAUGACUACCAGCUGGUUCdTdT-30. Urutan siRNA untuk KCNQ1OT1 adalah 50 –GCCAAUGGAUAGAGAGCAAdTdT-30. Urutan siRNA untuk kontrol negatif adalah 50 -GCUCAGAUCAAUACGGAGAdTdT-30 . RNA ditransfusikan ke dalam sel menggunakan Lipofectamine (Invitrogen) selama 48 jam.

4.5. SA- Uji Aktivitas -gal

Sel-sel dalam kultur sub-konfluen dicuci dengan larutan garam buffer fosfat (PBS) dingin, difiksasi dengan formaldehida 3 persen (v/v) dalam PBS selama 10 menit pada suhu kamar, dan kemudian diinkubasi dengan pewarnaan larutan yang mengandung 1 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl -D galactoside, 40 mM asam sitrat-natrium fosfat (pH 6,0), 5 mM kalium ferrisianida,5 mM kalium ferosianida, 150 mM NaCl, dan 2 mM MgCl2 selama 24 jam pada suhu 37 ◦C. Sel bernoda biru dihitung dalam setidaknya sepuluh bidang pada pembesaran 400 × dan dinyatakan sebagai persentase sel positif.

4.6. Pengukuran Tingkat ROS Intraseluler

Probe fluoresen sensitif oksidasi CM-H2DCFDA digunakan untuk mengevaluasi level ROS. Sel diperlakukan dengan 5 μM CM-H2DCFDA selama 20 menit pada suhu 37 ◦C dalam gelap,dipisahkan dengan trypsinization, dan kemudian dicuci dengan PBS. Intensitas fluoresensi terhalangditambang menggunakan Coulter Elite ESP Cell Sorter (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA). Itugerbang pencar maju dan samping ditetapkan untuk mengecualikan sel mati dari analisis; setidaknya10,000 peristiwa di dalam gerbang diperoleh per sampel.

KSL13

4.7. Transkripsi Terbalik (RT)-PCR

Total RNA diekstraksi dari sel. RNA ditranskripsi terbalik menggunakan primer spesifik gen dan reverse transcriptase (Takara Bio Inc., Jepang), dan cDNA yang dihasilkan diamplifikasi dengan PCR. Primer yang digunakan untuk pengujian tercantum dalam Tabel Tambahan S2. Produk PCR diselesaikan pada gel agarosa 1,5 persen. Kuantifikasi pita transkripsi-PCR terbalik dilakukan menggunakan densitometri. Level -Actin RNA digunakan untuk membakukan jumlah RNA di setiap sampel.

4.8. Immunoblotting

Protein dipisahkan pada 10 persen gel poliakrilamida dengan adanya SDS dan kemudian dipindahkan ke membran nitroselulosa. Selaput diblokir dengan 5 persen (b/v) susu skim kering tanpa lemak dalam TBST (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, dan 0,05 persen Tween 20) selama 2 jam dan kemudian diinkubasi dengan antibodi spesifik dalam 1 persen (b/v) susu skim kering tanpa lemak selama 1 jam. Selaput dicuci tiga kali dengan TBST dan kemudian diolah dengan sistem ECL untuk mengembangkan sinyal (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Bila dianggap perlu, membran dilucuti dengan stripping buffer (2 persen SDS, 100 mM -mercaptoethanol, dan 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)) pada 50 ◦C selama 1 jam dengan pengocokan lembut dan kemudian diperiksa ulang dengan anti{{ 25}}antibodi aktin sebagai kontrol pemuatan internal.

4.9. Analisis statistik

Analisis varian satu arah pengujian data dilakukan dengan menggunakan program paket SPSS (IBM, Armonk, NY, USA). Hasilnya dianggap signifikan jika p-value<0.05. Duncan's multiple range test was conducted if the differences between the groups were identified as α = 0.05.

Bahan Pelengkap : Informasi penunjang berikut dapat diunduh di :

Kontribusi Penulis: Y.-SB menyusun dan merancang percobaan, YL melakukan percobaan, dan Y.-SB menulis makalah. Semua penulis telah membaca dan menyetujui versi naskah yang diterbitkan.

Pendanaan: Penelitian ini didukung oleh Program Riset Sains Dasar, melalui National Research Foundation of Korea (NRF) yang didanai oleh Kementerian Sains, TIK, dan Perencanaan Masa Depan (NRF-2019R1A2C1005219).

Pernyataan Dewan Peninjau Institusional: Tidak berlaku.

Pernyataan Informed Consent: Tidak berlaku.

Pernyataan Ketersediaan Data: Tidak berlaku.

Konflik Kepentingan: Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi

1. Ulitsky, I.; Bartel, DP lincRNAs: Genomik, evolusi, dan mekanisme. Sel 2013, 154, 26–46. [Referensi Silang] [PubMed]

2. Esteller, M. Non-coding RNAs pada penyakit manusia. Nat. Pendeta Genet. 2011, 12, 861–874. [Referensi Silang] [PubMed]

3. Quinn, JJ; Chang, HY Fitur unik dari biogenesis dan fungsi RNA non-coding yang panjang. Nat. Pendeta Genet. 2016, 17, 47–62. [Referensi Silang] [PubMed]

4. Mancini-Dinardo, D.; Steele, SJ; Levorse, JM; Ingram, RS; Tilghman, SM Pemanjangan transkrip Kcnq1ot1 diperlukan untuk pencetakan genom gen tetangga. Gen Dev. 2006, 20, 1268–1282. [Referensi Silang] [PubMed]

5. Pandey, RR; Mondal, T.; Mohammad, F.; Enroth, S.; Redup, L.; Komorowski, J.; Nagano, T.; Mancini-Dinardo, D.; Kanduri, C. Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA memediasi pembungkaman transkripsional spesifik garis keturunan melalui regulasi tingkat kromatin. Mol. Sel 2008, 32, 232–246. [Referensi Silang]

6. Kanduri, C. Kcnq1ot1: RNA pengatur kromatin. Sem. Sel. Dev. Biol. 2011, 22, 343–350. [Referensi Silang]

7. Yang, F.; Qin, Y.; Lv, J.; Wang, Y.; Che, H.; Chen, X.; Jiang, Y.; Li, A.; Matahari, X.; Yue, E.; et al. Membungkam RNA Kcnq1ot1 non-coding yang panjang mengurangi piroptosis dan fibrosis pada kardiomiopati diabetik Kematian Sel Dis. 2018, 9, 1000. [Referensi Silang]

8. Yu, S.; Yu, M.; Dia, X.; Wen, L.; Bu, Z.; Feng, J. KCNQ1OT1 mempromosikan autophagy dengan mengatur jalur miR-200a/FOXO3/ATG7 pada stroke iskemik serebral. Sel Penuaan 2019, 18, e12940. [Referensi Silang]

9. Yu, XH; Deng, WY; Chen, JJ; Xu, XD; Liu, XX; Chen, L.; Shi, MW; Liu, QX; Tao, M.; Ren, K. LncRNA kcnq1ot1 mendorong akumulasi lipid dan mempercepat aterosklerosis melalui fungsi sebagai ceRNA melalui sumbu miR-452-3p/HDAC3/ABCA1. Kematian Sel Dis. 2020, 11, 1043. [Ref Silang]

10. Cagle, P.; Qi, Q.; Nitura, S.; Kumar, D. KCNQ1OT1: RNA nonkode panjang onkogenik. Biomolekul 2021,

11, 1602. [Ref Silang] 11. Wang, JL; Wei, X.; Wang, AG; Bai, Y.; Wu, XJ KCNQ1OT1 mengatur diferensiasi osteogenik hBMSC dengan sumbu miR-320a/Smad5. eur. Pendeta Med. Pharmacol. Sains. 2020, 24, 2843–2854. [PubMed]

12. Chen, L.; Xiong, Y.; Yan, C.; Zhou, W.; Endo, Y.; Xue, H.; Hu, Y.; Hu, L.; Leng, X.; Liu, J.; et al. LncRNA KCNQ1OT1 mempercepat penyembuhan fraktur melalui modulasi sumbu miR-701-3p/FGFR3. FASEB J. 2020, 34, 5208–5222. [Referensi Silang] [PubMed]

13. Chen, Y.; Zhang, Z.; Zhu, D.; Zhao, W.; Li, F. Knockdown dari KCNQ1OT1 melemahkan hipertrofi jantung melalui modulasi sumbu miR-2054/AKT3. J. Thorac. Dis. 2020, 12, 4771–4780. [Referensi Silang] [PubMed]

14. Anak-anak, BG; Durik, M.; Pembuat roti, DJ; van Deursen, JM Penuaan seluler pada penuaan dan penyakit terkait usia: Dari mekanisme hingga terapi. Nat. Kedokteran 2015, 21, 1424–1435. [Referensi Silang]

15. McHugh, D.; Gil, J. Penuaan dan penuaan: Penyebab, konsekuensi, dan jalan terapi. J. Sel Biol. 2018, 217, 65–77. [Referensi Silang]

16.Ryu, SW; Woo, JH; Kim, YH; Lee, YS; Taman, JW; Bae, YS Downregulasi protein kinase CKII dikaitkan dengan penuaan seluler. FEB Lett. 2006, 580, 988–994. [Referensi Silang]

Tanya lebih lanjut:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950

Efek Protektif Cistanche Terhadap Degradasi Kolagen Fibroblas Dermal yang diinduksi H2O2/UVB Melalui Hsa-microRNA-4535-mediated TGF /Smad Signaling Ⅱ

Potensi Antioksidan Dan Anti Penuaan Dari Formulasi Peptida (Gal2–Pep) Terkonjugasi Dengan Asam Gallic Ⅱ