Ko-Imunoterapi Berbasis Liposom Dengan Agonis TLR Dan Blokade Pos Pemeriksaan CD47-SIRP Untuk Pengobatan Kanker Usus Besar yang Efisien

Abstrak:

Imunitas antitumor merupakan komponen penting dalam terapi kanker dan terutama dimediasi oleh respons imun bawaan, yang berperan penting dalam memulai dan membentuk respons imun adaptif. Bukti yang muncul telah mengidentifikasi pos pemeriksaan kekebalan bawaan dan reseptor pengenalan pola, seperti CD47 dan Toll-like receptor 7 (TLR7), sebagai target terapi yang menjanjikan untuk pengobatan kanker. Berdasarkan protein fusi Fc-CV1, yang terdiri dari varian SIRP afinitas tinggi (CV1), dan fragmen Fc dari antibodi IgG1 manusia, kami mengeksploitasi persiapan yang menggabungkan Fc-CV1 dengan liposom yang mengandung imiquimod (agonis TLR7) ( CILPs) untuk secara aktif menargetkan CT26. Model tumor usus besar syngeneic WT. Penelitian in vitro mengungkapkan bahwa CILP menunjukkan sifat pelepasan berkelanjutan dan efisiensi penyerapan sel yang lebih unggul dibandingkan dengan imiquimod bebas. Secara in vivo, pengujian membuktikan bahwa CILP menunjukkan akumulasi tumor yang lebih efisien dan efek penekanan tumor yang lebih signifikan dibandingkan kelompok kontrol. Sediaan imunoterapi ini mempunyai kelebihan yaitu dosis rendah dan toksisitas rendah. Hasil ini menunjukkan bahwa kombinasi terapi blokade pos pemeriksaan imun (ICB) dan agonis imunitas bawaan, seperti Fc-CV1 dan sediaan liposom yang mengandung imiquimod yang digunakan dalam penelitian ini, dapat mewakili strategi yang sangat efektif untuk terapi tumor.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Kata kunci:

imiquimod; liposom; Fc-CV1; imunoterapi; kanker usus besar

1. Perkenalan

Angka kejadian kanker secara global terus meningkat setiap tahunnya, sehingga menimbulkan ancaman serius terhadap kesehatan penduduk dunia dan memberikan beban berat pada sistem layanan kesehatan. Menurut laporan Organisasi Kesehatan Dunia, pada tahun 2020, 19,29 juta kasus baru kanker dan 9,96 juta kematian akibat kanker terjadi di seluruh dunia [1]. Namun, dengan kemajuan berkelanjutan dalam diagnosis klinis, pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi, kelangsungan hidup dan kualitas hidup pasien kanker secara keseluruhan telah meningkat secara signifikan. Khususnya, imunoterapi, yang berasal dari vaksin Coley pada tahun 1890an [2], mendahului radioterapi dan kemoterapi dan telah mencapai kemajuan signifikan dalam dekade terakhir, memberikan manfaat bagi pasien kanker.

Imunoterapi tumor telah dikenal karena biokompatibilitasnya yang sangat baik dan spesifisitasnya yang tinggi serta mampu menginduksi respon imun untuk menghilangkan sel tumor [3-5]. Dua strategi utama untuk imunoterapi tumor adalah peningkatan kekebalan dan normalisasi kekebalan [6]. Pola peningkatan kekebalan tubuh terutama terdiri dari terapi sitokin, vaksin terapi tumor, dan antibodi monoklonal. Reseptor mirip tol (TLR) dianggap sebagai target potensial untuk imunoterapi kanker karena perannya dalam aktivasi sistem kekebalan bawaan. Agonis TLR telah dikembangkan sebagai bahan pembantu imun, dan berbagai agonis TLR sedang menjalani uji klinis [7]. Agonis monofosforil lipid A dan imiquimod, TLR4, dan TLR7, masing-masing, telah mendapat persetujuan dari Food and Drug Administration untuk aplikasi klinis [7-9]. Imiquimod, agonis TLR7 [9], mengaktifkan respon imun dan meningkatkan aktivitas anti tumor dengan memicu TLR7 [10,11]. Strategi normalisasi imun diwakili oleh obat blokade pos pemeriksaan imun (ICB) yang mengatur respon imun tumor adaptif yang rusak. Sejak inhibitor checkpoint pertama, ipilimumab disetujui untuk aplikasi klinis di AS pada tahun 2011, inhibitor checkpoint imun, seperti inhibitor PD1/PDL1, telah membuat terobosan dalam imunoterapi kanker [12-14]. Kecuali untuk pos pemeriksaan imun teradaptasi yang mirip dengan PD1/PDL1, beberapa pos pemeriksaan imun bawaan, seperti SIRP -CD47, juga telah menarik banyak perhatian dan menjadi bidang yang sangat menarik dalam pengembangan obat antibodi [15-17].

Pos pemeriksaan SIRP -CD47 pertama kali diidentifikasi pada tahun 1999 [18,19]. SIRP adalah reseptor CD47 yang diekspresikan dalam neuron sistem saraf pusat [20] dan sel myeloid, termasuk monosit, makrofag, granulosit, dan sel dendritik. CD47 adalah "molekul pelabelan sendiri" yang diekspresikan pada hampir semua sel normal dan diekspresikan secara berlebihan pada sebagian besar sel tumor [21]. Pada permukaan sel tumor, CD47 berikatan dengan SIRP, menghambat fagositosis yang dimediasi makrofag, yang merupakan sarana penting untuk keluarnya kekebalan tumor [22]. Telah terbukti bahwa fagositosis makrofag dalam lingkungan mikro tumor dapat ditingkatkan ketika pengikatan CD47 dan SIRP diblokir [20-25]. Oleh karena itu, inhibitor pos pemeriksaan imun yang menghambat jalur CD47/SIRP telah dikembangkan dan diterapkan dalam terapi kanker [26].

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Dalam penelitian ini, kami menggunakan kombinasi imiquimod dan fusion protein (Fc-CV1) untuk mengobati kanker usus besar. CV1 adalah protein SIRP rekombinan manusia yang dimodifikasi dan memiliki afinitas 50,000-kali lipat lebih tinggi terhadap CD47 dibandingkan protein aslinya [27]. Fc-CV1 dibuat menggunakan teknologi "Knobs-into-holes", berdasarkan monomer CV1 dan fragmen Fc dari IgG1 manusia. Untuk mengatasi keterbatasan kemanjuran terapi yang buruk dan toksisitas sistemik yang terkait dengan imiquimod [28,29], kami menyiapkan nanoliposom melalui metode injeksi etanol. Nanoliposom memiliki karakteristik toksisitas rendah dalam penghantaran obat [30,31]. Selanjutnya, imiquimod dienkapsulasi dalam liposom yang permukaannya terkonjugasi Fc-CV1. Terakhir, sediaan nano baru ini dapat secara aktif mengirimkan agonis TLR7 ke jaringan tumor dan memiliki fungsi ganda sebagai obat ICB dan agonis TLR. Itu digunakan untuk mengobati model tumor kolon syngeneic CD47+ CT26.WT [32].

2. Hasil dan Pembahasan

2.1. Karakterisasi LP (Liposom Kosong), ILP (Non-CD47-Liposom Terenkapsulasi Imiquimod yang Ditargetkan), CLP (Liposom Bertarget CD47), dan CILP (Digabungkan Fc-CV1 ke Imiquimod (agonis TLR7)-Loaded Liposom)

CILP berhasil dibuat dengan injeksi etanol dan metode gradien amonium sulfat. Gambar 1A menampilkan proses sintesis CILPs. Analisis TEM menunjukkan bahwa CILP berbentuk bulat dan seragam (Gambar 1B). Lebih lanjut, hasil DLS menunjukkan bahwa ukuran partikel keempat liposom berdistribusi unimodal (Gambar 1C). Tingkat pengikatan (BR) diverifikasi oleh SDS-PAGE, yang ditampilkan pada Gambar 1D, E. Gambar 1D menunjukkan berat molekul Fc-CV1 dan kecerahan pita relatif CILP yang didialisis dan pra-dialisis. BR dihitung menjadi 67,13 ± 37,10% melalui pemindaian densitometri pita elektroforesis Gambar J (Gambar 1E), memberikan kemungkinan CD47-menargetkan sel tumor.

Gambar 1. (A) Ilustrasi skema sintesis CILPs. (B) gambar TEM CILP

HPLC digunakan untuk mendeteksi efisiensi enkapsulasi (EE) imiquimod (Gambar Tambahan S1). Seperti yang ditampilkan pada Gambar Tambahan S1A, imiquimod gratis menunjukkan puncak tunggal yang signifikan, sedangkan CLP tidak menunjukkan puncak pada kondisi pengujian yang sama (Gambar Tambahan S1B). Oleh karena itu, CILP dapat dideteksi secara langsung dalam kondisi pengujian. Seperti yang diharapkan, nilai deteksi CILP sebelum dan sesudah dialisis masing-masing dianggap sebagai kandungan obat total dan kandungan obat dalam liposom (Gambar Tambahan S1C, D). EE imiquimod dihitung menjadi 85,44 ± 4,11%. Dibandingkan dengan sistem pengiriman obat passive-loading yang dilaporkan [33-35], penelitian ini mencapai efisiensi enkapsulasi yang lebih tinggi dan proses persiapan yang lebih nyaman.

DLS menunjukkan bahwa diameter LP adalah 111,567 ± 0,655 nm, sedangkan CLP, ILP, dan CILP menunjukkan ukuran yang sedikit lebih besar yaitu 117,467 ± 0,34{{10} } nm, 120.233 ± 0.776 nm, dan 13{{30}}.033 ± 0.974 nm, masing-masing (Tabel 1). Perubahan ukuran liposom ini mungkin disebabkan oleh modifikasi Fc-CV1 dan imiquimod. PDI mendekati 0,1 (Tabel 1), yang menunjukkan bahwa kendaraan pengangkut narkoba ini sangat homogen dalam distribusinya. Selain itu, nilai zeta-potensial LPs, CLPs, ILPs, dan CILPs diukur menjadi −2.231 ± 0.167 mV, −2.492 ± 0.033 mV, −2.383 ± 0.070 mV, dan −2.075 ± 0.070 mV, masing-masing (Tabel 1) , menunjukkan bahwa Fc-CV1 terkonjugasi permukaan dan imiquimod yang dienkapsulasi memiliki pengaruh yang kecil terhadap muatan liposom.

Tabel 1. Diameter, potensi zeta, PDI, dan EE masing-masing LP, CLP, ILP, dan CILP.

2.2. Efisiensi Penyerapan Sel In Vitro

Efisiensi penyerapan sel CILP dievaluasi melalui intensitas fluoresensi Cy5 yang diambil oleh sel CT26.WT menggunakan Sistem Pencitraan Konten Tinggi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, dibandingkan dengan kelompok Cy5 dan ILP-Cy5 bebas, kelompok CILPs-Cy5 menunjukkan kapasitas penyerapan sel yang lebih kuat setelah inkubasi 30 menit. Hasil ini menyimpulkan bahwa Fc-CV1 meningkatkan kemampuan pengiriman intraseluler liposom yang mengandung imiquimod karena afinitas spesifik terhadap reseptor Fc-CV1, yang mengarah pada efek anti-tumor yang lebih kuat.

Gambar 2. Gambar sel CT26.WT setelah diinkubasi dengan Cy5 bebas, ILPs-Cy5, dan CILPs-Cy5 (merah) selama 0,5 jam, dan pewarnaan dengan DAPI (biru). Bilah skala: 50 µm. (n {{10}}). * hal <0,05; **** p < 0,0001

2.3. Lepas Kurva Liposom

Kurva pelepasan obat dari imiquimod bebas, ILPs, dan CILPs diukur dalam lingkungan simulasi in vivo. Gambar 3 menunjukkan bahwa imiquimod bebas dilepaskan seluruhnya setelah 1 jam, sedangkan laju pelepasan (RR) imiquimod yang dienkapsulasi dengan ILPs dan CILPs hanya 54,75 ± 4.08% dan 39,70 ± 0,05% pada 12 jam , masing-masing. Selain itu, pelepasan imiquimod yang lambat pada ILP dan CILP dapat ditutup dengan sifat pelepasan obat yang terkontrol dari liposom. RR imiquimod pada ILP dan CILP tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan pada 96 jam, menunjukkan bahwa "pasca penyisipan" menunjukkan dampak yang dapat diabaikan terhadap stabilitas membran liposom.

gambar 3. Kurva pelepasan imiquimod dari imiquimod bebas, ILPs, dan CILPs di PBS pada suhu 37 ◦C. Data disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi (n=3). * p < 0.05, ** p < 0,01

2.4. Studi Sitotoksisitas

Untuk mempelajari sitotoksisitas CILP secara in vitro, uji CCK{{0}} dilakukan pada sel CT26.WT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, CILP pada konsentrasi rendah (0,1-1 µg/mL) tidak menunjukkan sitotoksisitas, yang konsisten dengan keamanan terapi imunisasi. Viabilitas sel sedikit menurun setelah pengobatan imiquimod 5 µg/mL, mungkin karena ROS dan kematian sel imunogenik yang dimediasi retikulum endoplasma yang disebabkan oleh imiquimod [36]. Selain itu, CILP menyebabkan penurunan viabilitas sel yang signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang disebabkan oleh efek sinergis dari imiquimod dan Fc-CV1.

Gambar 4. Kelangsungan hidup sel yang diobati dengan Fc-CV1, imiquimod, CLPs, ILPs, dan CILPs selama 24 jam. Konsentrasi Fc-CV1 dan imiquimod keduanya 0–10 µg/mL. * p < 0.05, ** p < 0.01, ns=tidak ada perbedaan yang signifikan

2.5. Studi Biodistribusi

Distribusi dan akumulasi formulasi berbeda pada tumor dan organ utama secara langsung mempengaruhi efek terapeutik. Setelah pemberian intravena, sinyal fluoresensi dipantau menggunakan sistem pembedahan makhluk hidup inframerah dekat untuk menilai distribusi dan akumulasi formulasi berbeda pada tumor dan organ utama setelah 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5, intensitas fluoresensi total ILPs-Cy5 dan CILPs-Cy5 lebih tinggi daripada Cy5 bebas, menunjukkan bahwa liposom memiliki sifat sirkulasi panjang in vivo. Selain itu, intensitas fluoresensi kelompok pengobatan CILPs-Cy5 adalah yang tertinggi pada jaringan tumor, yang dapat dianggap berasal dari efek penargetan tumor dari ligan Fc-CV1, sehingga meningkatkan efek anti tumor. Yang mengejutkan, intensitas fluoresensi hati dan limpa lebih kuat dibandingkan organ lain, yang mungkin disebabkan oleh fagositosis liposom oleh sistem retikuloendotelial (RES) di hati dan ginjal [37].

Gambar 5. Distribusi fluoresensi Cy5-pada tumor dan organ utama pada 24 jam setelah pemberian intravena. Data ditampilkan sebagai rata-rata ± standar deviasi (n=3). ****p<0.0001

2.6. Dalam Studi Penghambatan Tumor Vivo

Jadwal terapi (Gambar 6A) dan efek dari sediaan yang berbeda ditunjukkan pada Gambar 6. Dibandingkan dengan kelompok PBS dan LP, kelompok pengobatan lain menunjukkan efek penekan tumor tertentu. Khususnya, volume tumor yang minimal setelah pengobatan dengan CILPs, menunjukkan bahwa CILPs memiliki efek penekan tumor yang sangat baik (Gambar 6B).

Gambar 6. (A) Ilustrasi skema pengobatan anti kanker usus besar pada model tumor CT26.WT. (B) Kurva pertumbuhan volume tumor selama masa pengobatan. (C) Foto relatif tumor dan (D) berat tumor dikumpulkan dari kelompok perlakuan berbeda pada hari ke 17. (E) Rasio berat badan relatif terhadap berat badan dibandingkan dengan 0 hari. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (n=5). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001.

Di akhir percobaan, tikus dikorbankan dan tumornya dipotong, difoto, dan ditimbang untuk menentukan kemanjuran terapi dari berbagai sediaan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6C, D, kelompok pengobatan CILP memiliki tumor terkecil dan teringan dibandingkan kelompok lain, menunjukkan bahwa CILP memiliki efek penekan tumor terbesar. Tabel 2 menunjukkan bahwa tingkat penghambatan pertumbuhan tumor CILP dihitung sebesar 84,35%. Selain itu, tingkat penekanan tumor sebesar 84,35% secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok CLPs dan ILPs, dan ini berarti terdapat efek sinergis dari pemblokiran poros “jangan makan aku” dan aktivasi respon imun. . Dibandingkan dengan sediaan yang setara secara in vitro (2,5–5 µg/mL), laju penghambatan yang lebih tinggi berkaitan erat dengan respon imun yang diaktifkan oleh formulasi dan menghambat mekanisme pelepasan kekebalan secara in vivo, yang tidak tersedia secara in vitro.

Tabel 2. Data berat tumor dan penghambatan pertumbuhan tumor (TGI) berbagai kelompok perlakuan.

2.7. CILPs Meningkatkan Infiltrasi Sel T dan Sekresi IFN

Untuk mengeksplorasi lingkungan sel imun dari tumor, sel imun yang diinduksi oleh CILP dianalisis secara imunohistokimia pada akhir uji anti tumor. Sel T CD4+ dan CD8+ meningkat pada bagian tumor kelompok CILPs (Gambar 7). Pemberian bersama Fc-CV1 dan terapi imiquimod menghasilkan infiltrasi sel T CD4+ dan CD8+ yang signifikan. Selain itu, terdapat sekresi IFN yang signifikan pada tumor yang menjalani pengobatan CILPs, karena CILPs memicu reseptor mirip Toll 7 dan mengaktifkan respons imun.

Gambar 7. Imunohistokimia jaringan tumor tikus; sel positif berwarna coklat. Bilah skala, 50 µm (n=5).

2.8. Penilaian Biosekuriti CILP

Keamanan hayati dari terapi yang dimediasi CILP juga merupakan indeks penting dalam mengakses evaluasi terapeutik. Selama studi penghambatan tumor in vivo, CILP tidak menyebabkan penurunan berat badan yang signifikan selama masa pengobatan (Gambar 6D). Parameter biokimia hati dan ginjal semuanya berada dalam kisaran normal menurut kisaran referensi standar tikus (Tabel 3), dan histologi organ tidak menunjukkan perubahan signifikan, yang menunjukkan bahwa CILP memiliki keamanan hayati yang sangat baik (Gambar 8). Temuan ini sangat penting dalam menilai potensi CILPs sebagai agen imunoterapi yang aman dan efektif untuk pengobatan kanker.

Tabel 3. Parameter biokimia hati dan ginjal

Gambar 8. Pewarnaan H&E (hematoxylin dan eosin) pada organ utama. Bilah skala, 50 µm (n=3)

3. Bahan dan Metode

3.1. Bahan

Imiquimod dibeli dari MedChem Express (Shanghai, Cina). Fc-CV1 disediakan oleh Laboratorium Kunci Negara untuk Obat Antibodi dan Terapi Bertarget. Kolesterol, lesitin terhidrogenasi (HSPC), DSPE-PEG2000, DSPE-PEG2000-NHS, dan DSPE-PEGCy5 dibeli dari Xi'an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Xi'an, Cina). 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diperoleh dari Keygen Biotech (Nanjing, Cina). Amonium sulfat diperoleh dari Sinopharm (Shanghai, Cina). Metanol (tingkat kromatografi) dan asetonitril (tingkat kromatografi) dibeli dari Perusahaan Reagen Aladdin (Shanghai, Cina). Reagen lainnya semuanya memiliki kualitas analitis dalam negeri. Garis sel kanker usus besar tikus CT26. WT disediakan oleh Bank Sel dari Akademi Sains Tiongkok. Sel-sel tersebut ditanam dalam inkubator sel dalam medium RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA) pada 5% CO2 dan 95% udara. Tikus BALB / c betina berumur 4-6 minggu dipasok oleh Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd. (Jinan, Cina).

3.2. Persiapan Liposom Kosong

Pertama, 13,455 mg HSPC, 4,3595 mg DSPE-PEG2000, dan 4,7095 mg kolesterol ditimbang secara tepat dan dilarutkan dalam 0,1 mL etanol (HSPC: DSPE-PEG2000:kolesterol=55.5: rasio molar 5,05:39,3). Kedua, larutan etanol dengan cepat disuntikkan ke dalam larutan amonium sulfat yang telah dipanaskan sebelumnya (250 mM, 1 mL, 65 ◦C) melalui jarum suntik dan kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 65 ◦C dengan pengadukan magnetik. Selanjutnya, larutan yang disiapkan secara berturut-turut diekstrusi melalui membran polikarbonat (Avanti, Alabaster, AL, USA); ukurannya masing-masing 200 nm, 100 nm, dan 50 nm. Terakhir, larutan yang dihasilkan adalah blank liposom (LPs) dengan konsentrasi lipid 22,5 mg/mL.

3.3. Persiapan Liposom Terenkapsulasi Imiquimod yang Ditargetkan CD47

Pertama, DSPE-PEG2000-NHS dilarutkan dalam ddH2O (60 ◦C) lalu dicampur dengan Fc-CV1 dan diinkubasi dalam meja pengocok pada suhu kamar selama 5 jam (Fc-CV1:DSPEPEG2000- NHS=12:1 rasio molar). Mekanisme reaksi kimia hubungan antara Fc-CV1 dan DSPE-PEG2000-NHS melibatkan ester NHS yang bereaksi dengan amina primer pada Fc-CV1 dan membentuk konjugat ikatan amina tabel. Larutan yang disiapkan dicampur secara proporsional dengan LP dan diinkubasi pada suhu 60 ◦C selama 1 jam untuk memasukkan Fc-CV1 ke dalam liposom, yang diberi nama "pasca penyisipan" [38]. Proporsi campurannya adalah 2,25 mg Fc-CV1 dimodifikasi per 22,5 mg liposom. Liposom bertarget CD47 (CLPs) kemudian diperoleh.

Selanjutnya, CLP ditempatkan dalam kantong dialisis (300 kDa) dan didialisis terhadap HEPES (10 mM, pH=7.4) selama 1 jam untuk menghilangkan amonium sulfat dan sisa Fc-CV1 di fase air luar. CLP yang didialisis diinkubasi dengan larutan imiquimod (5 mg/mL) dengan perbandingan 1 mg hingga 7 µmol total fosfolipid pada suhu kamar selama 24 jam dan kemudian didialisis terhadap PBS (300 kDa) tiga kali untuk menghilangkan imiquimod yang tidak berkapsul, yang mengacu pada teknik gradien amonium sulfat [39]. CILP kemudian diperoleh. Selain itu, liposom yang dienkapsulasi imiquimod (ILP) non-CD{14}}yang ditargetkan telah disiapkan. CLP dan ILP dianggap sebagai kontrol untuk CILP.

3.4. Karakterisasi

Morfologi liposom ini difoto dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, Joel, Tokyo, Jepang). Ukuran, potensi zeta, dan indeks dispersitas polimer (PDI) liposom ini ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis (DLS) dan hamburan cahaya elektroforesis (ELS) menggunakan Zeta sizer ZSE milik Malvern (Malvern, UK). Tingkat pengikatan (BR) Fc-CV1 yang dimasukkan ke dalam liposom diukur dengan 15% natrium lauril sulfat-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) dan perangkat lunak Image J (Bethesda, MD, USA). Efisiensi enkapsulasi (EE) imiquimod dideteksi dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, Thermo Fisher Scientific, New York, NY, USA).

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

3.5. Studi Serapan Sel In Vitro

Penyerapan sel in vitro dari liposom ini ditentukan oleh intensitas fluoresensi kumulatif Cy5 di CT26. sel WT. DSPE-PEG-Cy5 diinkubasi dengan CILPs dan ILPs (DSPE-PEG-Cy5: CILPs atau ILPs=1:5 rasio massa) masing-masing pada suhu 60 ◦C selama 1 jam, dan kemudian liposom fluoresen dinamai CILPs-Cy5 dan ILPs-Cy5 diperoleh. Sel CT26.WT diunggulkan di 96-pelat sumur dan dibagi secara acak menjadi tiga kelompok (1 × 104 sel/sumur, n=3). Setelah pertemuan sel mencapai 50-70%, masing-masing kelompok diinkubasi dengan Cy5 bebas, ILPs-Cy5, dan CILPs-Cy5, masing-masing, selama 30 menit pada suhu 37 ◦C, di mana konsentrasi akhir Cy5 adalah 1 µg/mL dalam 0,1 mL medium RPMI 1640. Selanjutnya, sel diimobilisasi dengan paraformaldehyde 4% selama 15 menit setelah dicuci dua kali dengan PBS dan kemudian diwarnai dengan 10 μL DAPI (1 μg/µL) selama 10 menit setelah dicuci dua kali dengan PBS. Akhirnya, penyerapan setiap kelompok sel dicatat oleh Sistem Pencitraan Konten Tinggi (Perangkat Molekuler, Sunnyvale, CA, USA) setelah dicuci dua kali dengan PBS.

3.6. Studi Rilis Imiquimod

Kurva pelepasan berbagai liposom yang mengandung obat dilakukan dengan menggunakan metode dialisis (300 kDa), dan hasilnya dibandingkan dengan larutan imiquimod gratis. Secara singkat, 0.6 mL ILP, CILP, dan larutan imiquimod dikemas secara terpisah ke dalam kantong dialisis dan kemudian ditempatkan dalam 500 mL larutan PBS (pH=7.4, 37 ◦C). Sampel dengan volume yang sama diekstraksi dari kantong pada interval waktu yang telah ditentukan (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72, dan 96 jam), dan laju pelepasan (RR) imiquimod dihitung menggunakan persamaan berikut:

dimana Sund dan Sd masing-masing mewakili area puncak HPLC dari imiquimod dalam sediaan pra-dialisis dan dialisis pada berbagai waktu (n=3).

3.7. Sitotoksisitas CILP

Sel CT{{0}}.WT diunggulkan dalam 96-well plate (1 × 104/well, n=3) dan dikultur dalam 100 μL media RPMI 1640 hingga pertemuan hampir mencapai 70%. Untuk menentukan sitotoksisitas CILPs, medium RPMI 1640 dikeluarkan dari setiap sumur dan diganti dengan larutan kompleks CILPs dan medium RPMI 1640, dengan konsentrasi Fc-CV1 dan imiquimod berkisar antara 0 hingga 10 µg/mL. Sel-sel diinkubasi dengan larutan kompleks selama 24 jam. Selain itu, sel-sel yang diobati dengan Fc-CV1, CLPs, larutan imiquimod, dan ILPs dalam konsentrasi yang sama dianggap sebagai kelompok kontrol. Sel yang bertahan dideteksi dengan uji CCK-8 setelah 24 jam, dan kelangsungan hidup sel yang tidak diobati dianggap 100%.

3.8. Studi Biodistribusi

Sembilan tikus BALB/c betina disuntik secara subkutan dengan CT26. Sel WT (5 × 105) di sisi kanan dan tikus yang mengandung tumor ini secara acak dibagi menjadi tiga kelompok (n=3). Volume tumor diukur menggunakan jangka sorong dan dihitung dengan rumus berikut:

Ketika volume tumor mencapai 100 mm3, Cy5 bebas, ILP-Cy5, dan CILPs-Cy5 disuntikkan secara intravena dengan dosis Cy5 0,4 mg/kg. Dua puluh empat jam setelah injeksi intravena, tumor, jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal dikeluarkan. Sinyal fluoresensi tumor dan organ utama dideteksi oleh sistem pencitraan optik IVIS (IVIS Lumina LT III, PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

3.9. Dalam Studi Penghambatan Tumor Vivo

Tiga puluh lima tikus BALB/c betina secara acak dibagi menjadi tujuh kelompok (n=5), dan 5 × 105 CT26. Sel WT disuntikkan secara subkutan ke sisi kanan masing-masing tikus. Ketika ukuran tumor tikus sekitar 100 mm3, pengobatan dimulai. PBS, LPs, imiquimod, Fc-CV1, ILPs, CLPs, dan CILPs disuntikkan secara intravena pada hari ke 0, 4, 8, dan 12. Dosis imiquimod adalah 2,5 mg/kg pada suntikan pertama dan kedua serta 5 mg/kg. pada suntikan ketiga dan keempat. Pada semua suntikan, dosis Fc-CV1 adalah 5 mg/kg. Pada dosis ini, konsentrasi obat dalam tubuh adalah 2,5–5 µg/mL, yang menyebabkan sitotoksisitas pada sel dalam percobaan in vitro. Diameter tumor dan berat badan diukur setiap hari selama pengobatan. Pada hari ke 17, tumor mencit diangkat dan diukur berat badannya. Penghambatan pertumbuhan tumor (TGI) dihitung berdasarkan rumus berikut:

3.10. Imunohistokimia

Pewarnaan imunohistokimia CD4, CD8, dan IFN dilakukan pada jaringan tumor sesuai dengan protokol standar. Setelah deparaffinisasi dan rehidrasi bagian parafin dari bagian jaringan tumor, 3% BSA ditambahkan ke dalam lingkaran untuk menutupi jaringan, dan kemudian ditutup selama 30 menit pada suhu kamar. Bagian tersebut diwarnai dengan antibodi CD4, CD8, dan IFN (Servicebio, Wuhan, Tiongkok) semalaman pada suhu 4 ◦C, dan kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder (berlabel HRP, Servicebio, Wuhan, Tiongkok) pada suhu kamar selama 50 menit setelah dua kali pencucian dengan PBS. Pada akhirnya, bagian-bagian tersebut divisualisasikan di bawah mikroskop (Nikon, E100, Tokyo, Jepang) setelah direaksikan dengan agen kromogenik DAB.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

3.11. Penilaian Biosekuriti CILP

Pada akhir studi penghambatan tumor, semua tumor dikumpulkan, dan berat tumor diukur. Parameter biokimia, termasuk alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), creatinine (CREA), dan urea (UREA), terdeteksi dalam darah tikus. Jaringan tumor segar dan organ utama difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dan ditanamkan dalam parafin menggunakan mesin embedding (Wuhan Junjie Electronics, JB-P5, Wuhan, China). Irisan jaringan setebal 5 µm dipotong melalui mikrotom (Leica Instrument, RM2016, Shanghai, China), kemudian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E) sesuai protokol. Selanjutnya, irisan pewarnaan diamati di bawah mikroskop (Nikon, E100, Tokyo, Jepang).

3.12. Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai mean ± SD. Tingkat signifikansi antar kelompok diuji dengan one way ANOVA menggunakan Graphpad Prism 8.0.2. p < 0.05 didefinisikan sebagai perbedaan yang signifikan.

3.13. Etika Hewan

Semua prosedur dan rekomendasi mengenai hewan telah disetujui oleh Komite Khusus Etika Penelitian Ilmiah Universitas Liaocheng mengikuti pedoman nasional untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium (Kode Persetujuan: 2022111010; Tanggal Persetujuan: 1 November 2022).

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

4. Kesimpulan

Singkatnya, liposom bertarget CD47-yang dienkapsulasi imiquimod berhasil dikembangkan, dan hasil in vitro membuktikan bahwa CILP memiliki pelepasan yang lebih berkelanjutan dan efek penargetan spesifik. Hasil in vivo menunjukkan bahwa sediaan tersebut dapat diserap secara efektif oleh sel tumor dan menunjukkan efisiensi pengobatan tumor serta keamanan hayati yang sangat baik karena fungsi ganda respons imun dan blokade pos pemeriksaan kekebalan bawaan. Oleh karena itu, liposom yang dienkapsulasi imiquimod yang digabungkan dengan Fc-CV1 tampaknya merupakan pengobatan nano baru yang menjanjikan untuk meningkatkan pengobatan tumor ekspresi CD47. Imunoterapi berdasarkan imunitas bawaan dapat berfungsi sebagai strategi umum melawan pertumbuhan tumor untuk kombinasi sinergis dengan ICB di masa depan.

Referensi

1. Dinyanyikan, H.; Ferlay, J.; Siegel, RL; Laversanne, M.; Soerjomataram, I.; Jemal, A.; Bray, F. Statistik Kanker Global 2020: Perkiraan Globocan mengenai Insidensi dan Kematian di Seluruh Dunia untuk 36 Kanker di 185 Negara. CA Kanker J. Clin. 2021, 71, 209–249. [Ref Silang] [PubMed]

2. Carlson, RD; Flickinger, JC, Jr.; Snook, AE Talkin' Toxins: Dari Coleys hingga Imunoterapi Kanker Modern. Racun 2020, 12, 241. [CrossRef] [PubMed]

3. Barbari, C.; Fontaine, T.; Parajuli, P.; Lamichhane, N.; Jakubski, S.; Lamichhane, P.; Deshmukh, Imunoterapi RR dan Strategi Kombinasi untuk Imuno-Onkologi. Int. J.Mol. Sains. 2020, 21, 5009. [Referensi Silang]

4. Hegde, PS; Chen, DS 10 Tantangan Teratas dalam Imunoterapi Kanker. Imunitas 2020, 52, 17–35. [Referensi Silang]

5. Jain, KK Imuno-Onkologi yang Dipersonalisasi. medis. Pangeran. Praktek. 2021, 30, 1–16. [Referensi Silang]

6. Sanmamed, MF; Chen, L. Pergeseran Paradigma Imunoterapi Kanker: Dari Peningkatan ke Normalisasi. Sel 2018, 175, 313–326. [Referensi Silang]

7. Husein, WM; Liu, TI; Skwarczynski, M.; Toth, I. Agonis Reseptor Seperti Tol: Tinjauan Paten (2011–2013). Pendapat Ahli. Ada. Menepuk. 2014, 24, 453–470. [Referensi Silang]

8. Chi, H.; Li, C.; Zhao, FS; Zhang, L.; Ng, TBC; Jin, G.; Sha, O. Aktivitas Anti Tumor Agonis Reseptor Seperti Tol 7. Depan. Farmakol. 2017, 8, 304. [Referensi Silang] [PubMed]

9. Wang, Y.; Zhang, S.; Li, H.; Wang, H.; Zhang, T.; Hutchinson, BAPAK; Yin, H.; Wang, X. Modulator Molekul Kecil dari Reseptor Seperti Tol. Acc. kimia. Res. 2020, 53, 1046–1055. [Ref Silang] [PubMed]

10. Le Mercier, I.; Poujol, D.; Sanlaville, A.; Sisirak, V.; Gobert, M.; Durand, saya.; Dubois, B.; Treilleux, saya.; Keajaiban, J.; Vlach, J.; dkk. Promosi Tumor oleh Sel Dendritik Plasmacytoid Intratumoral Dibalik dengan Perawatan Ligan Tlr7. Res Kanker. 2013, 73, 4629–4640. [Referensi Silang]

11. Bu, F.; Zhang, J.; Zhang, J.; Zhang, C. Agonis Tlr7 Imiquimod dan Gardiquimod Meningkatkan Imunoterapi Berbasis DC untuk Melanoma pada Tikus. Sel. mol. imunol. 2010, 7, 381–388. [Referensi Silang]

12. Billan, S.; Kaidar-Orang, O.; Gil, Z. Pengobatan setelah Kemajuan di Era Imunoterapi. Lancet Oncol. 2020, 21, e463–e476. [Ref Silang] [PubMed]

13. Darvin, P.; Toor, SM; Sasidharan Nair, V.; Elkord, E. Inhibitor Pos Pemeriksaan Imun: Kemajuan Terkini dan Potensi Biomarker. Contoh. mol. medis. 2018, 50, 1–11. [Ref Silang] [PubMed]

14. Li, B.; Chan, HL; Chen, P. Inhibitor Pos Pemeriksaan Imun: Dasar dan Tantangan. Saat ini. medis. kimia. 2019, 26, 3009–3025. [Ref Silang] [PubMed]

15. Jia, X.; Yan, B.; Tian, ​​X.; Liu, Q.; Jin, J.; Shi, J.; Hou, Y. Cd47/Sirpalpha Pathway Memediasi Pelarian Kekebalan Kanker dan Imunoterapi. Int. J.Biol. Sains. 2021, 17, 3281–3287. [Referensi Silang]

16. Swoboda, DM; Sallman, DA Janji Inhibitor Pos Pemeriksaan yang Diarahkan Makrofag pada Keganasan Myeloid. Praktik dan Penelitian Terbaik. Klinik. Hematol. 2020, 33, 101221.

17. Lentz, RW; Colton, MD; Mitra, SS; Messersmith, Inhibitor Pos Pemeriksaan Kekebalan Tubuh WA: Terobosan Berikutnya dalam Onkologi Medis? mol. Kanker Ada. 2021, 20, 961–974. [Referensi Silang]

18. Jiang, P.; Lagenaur, CF; Narayanan, V. Protein Terkait Integrin Merupakan Ligan untuk Molekul Adhesi Neural P84. J.Biol. kimia. 1999, 274, 559–562. [Referensi Silang]

19. Seiffert, M.; Tidak bisa, C.; Chen, Z.; Rappold, saya.; Brugger, W.; Kanz, L.; Coklat, EJ; Ullrich, A.; Buhring, HJ Protein Pengatur Sinyal Manusia Dinyatakan pada Normal, tetapi Tidak pada Subset Sel Myeloid Leukemik dan Memediasi Adhesi Seluler yang Melibatkan Counterreceptor Cd47. Darah 1999, 94, 3633–3643. [Referensi Silang]

20. Matlung, HL; Szilagyi, K.; Barclay, NA; van den Berg, TK Cd47-Sirpalpha Signaling Axis sebagai Pos Pemeriksaan Kekebalan Tubuh Bawaan pada Kanker. imunol. Wahyu 2017, 276, 145–164. [Ref Silang] [PubMed]

21. Oldenborg, PA; Zheleznyak, A.; Fang, YF; Lagenaur, CF; Gresham, HD; Lindberg, FP Peran Cd47 sebagai Penanda Diri pada Sel Darah Merah. Sains 2000, 288, 2051–2054. [Referensi Silang]

22. Li, Z.; Li, Y.; Gao, J.; Fu, Y.; Hua, P.; Jing, Y.; Cai, M.; Wang, H.; Tong, T. Peran Cd47-Pos Pemeriksaan Kekebalan Sirpalpha dalam Penghindaran Kekebalan Tumor dan Imunoterapi Bawaan. Ilmu Kehidupan. 2021, 273, 119150. [Referensi Silang]

23. Hayat, SMG; Bianconi, V.; Piro, M.; Jaafari, Bpk; Hatamipour, M.; Sahebkar, A. Cd47: Peran dalam Sistem Kekebalan Tubuh dan Penerapan Terapi Kanker. Sel. Onkol. 2020, 43, 19–30. [Referensi Silang]

24. Huang, Y.; Mungkin.; Gao, P.; Yao, Z. Menargetkan Cd47: Prestasi dan Kekhawatiran Studi Saat Ini tentang Imunoterapi Kanker. J.Torak. Dis. 2017, 9, E168–E174. [Referensi Silang]

25. Zhang, W.; Huang, Q.; Xiao, W.; Zhao, Y.; Pi, J.; Xu, H.; Zhao, H.; Xu, J.; Evans, CE; Jin, H. Kemajuan dalam Perawatan Anti-Tumor yang Menargetkan Sumbu Cd47/Sirpalpha. Depan. imunol. 2020, 11, 18. [Referensi Silang] [PubMed]

26. Liu, X.; Pu, Y.; Cron, K.; Deng, L.; Kline, J.; Frazier, WA; Xu, H.; Peng, H.; Fu, YX; Xu, MM Blokade Cd47 Memicu Penghancuran Tumor Imunogenik yang Dimediasi Sel T. Nat. medis. 2015, 21, 1209–1215. [Ref Silang] [PubMed]

27. Weiskopf, K.; Dering, pagi; Ho, CC; Volkmer, JP; Levin, SAYA; Volkmer, AK; Ozkan, E.; Fernhoff, NB; van de Rijn, M.; Weissman, IL; dkk. Varian Sirpalpha yang Direkayasa sebagai Bahan Tambahan Imunoterapi untuk Antibodi Antikanker. Sains 2013, 341, 88–91. [Referensi Silang]

28. Xiong, Z.; Ohlfest, Imiquimod Topikal JR Memiliki Efek Terapi dan Imunomodulator terhadap Tumor Intrakranial. J. Imun lainnya. 2011, 34, 264–269. [Referensi Silang]

29. Kamath, P.; Darwin, E.; Arora, H.; Nouri, K. Tinjauan Terapi Imiquimod dan Diskusi Penatalaksanaan Optimal Karsinoma Sel Basal. Klinik. Investigasi Narkoba. 2018, 38, 883–899. [Referensi Silang]

30. Liu, Y.; Castro Bravo, KM; Liu, J. Pengiriman Obat Liposom yang Ditargetkan: Perspektif Nanosains dan Biofisik. Horiz Skala Nano. 2021, 6, 78–94. [Ref Silang] [PubMed]

31. Farjadian, F.; Ghasemi, A.; Gohari, O.; Roointan, A.; Karimi, M.; Hamblin, MR Nanofarmasi dan Nanomedis Saat Ini di Pasar: Tantangan dan Peluang. Pengobatan nano 2019, 14, 93–126. [Referensi Silang]

32. Zhou, X.; Jiao, L.; Qian, Y.; Dong, Q.; Matahari, Y.; Zheng, W.; Zhao, W.; Zhai, W.; Qiu, L.; Wu, Y.; dkk. Memposisikan Ulang Azelnidipine sebagai Inhibitor Ganda yang Menargetkan Jalur Cd47/Sirpalpha dan Tigit/Pvr untuk Terapi Imuno Kanker. Biomolekul 2021, 11, 706. [CrossRef]

33. Ni, K.; Luo, T.; Culbert, A.; Kaufmann, M.; Jiang, X.; Lin, W. Kerangka Logam-Organik Skala Nano Bersama-sama Memberikan Tlr-7 Agonis dan Antibodi Anti-Cd47 untuk Memodulasi Makrofag dan Mengatur Imunoterapi Kanker. Selai. kimia. sosial. 2020, 142, 12579–12584. [Referensi Silang]

34. Chen, Q.; Xu, L.; Liang, C.; Wang, C.; Peng, R.; Liu, Z. Terapi Fototermal dengan Nanopartikel Pembantu Imun Bersama dengan Blokade Pos Pemeriksaan untuk Imunoterapi Kanker yang Efektif. Nat. Komunitas. 2016, 7, 13193. [CrossRef] [PubMed]

35. Wei, J.; Panjang, Y.; Guo, R.; Liu, X.; Tang, X.; Rao, J.; Yin, S.; Zhang, Z.; Li, M.; He, Q. Kemo-Imunoterapi Berbasis Misel Polimer Multifungsi dengan Blokade Pos Pemeriksaan Kekebalan Tubuh untuk Pengobatan Kanker Payudara Ortotopik dan Metastatik yang Efisien. Farmasi Acta. Dosa. B 2019, 9, 819–831. [Referensi Silang]

36. Huang, SW; Wang, ST; Chang, SH; Chuang, KC; Wang, HY; Kao, JK; Liang, SM; Wu, CY; Kao, SH; Chen, YJ; dkk. Imiquimod Memberikan Efek Antitumor dengan Menginduksi Kematian Sel Imunogenik dan Ditingkatkan oleh Inhibitor Glikolitik 2-Deoksiglukosa. J. Selidiki. Dermatol. 2020, 140, 1771–1783.e6. [Ref Silang] [PubMed]

37. Wang, B.; Dia, X.; Zhang, Z.; Zhao, Y.; Feng, W. Metabolisme Nanomaterial di Vivo: Sirkulasi Darah dan Pembersihan Organ. Acc. kimia. Res. 2013, 46, 761–769. [Referensi Silang]

38. Akhtari, J.; Rezayat, SM; Teymouri, M.; Alavizadeh, SH; Gheybi, F.; Badiee, A.; Jaafari, MR Targeting, Bio Distributif dan Penghambat Pertumbuhan Tumor Karakterisasi Kopling Affibody Anti-Her2 ke Liposom Doxorubicin Menggunakan Tikus Balb/C Bantalan Tubo Tumor. Int. J.Pharm. 2016, 505, 89–95. [Referensi Silang]

39. Woodle, MC; Papahadjopoulos, D. Persiapan Liposom dan Karakterisasi Ukuran. Metode Enzimol. 1989, 171, 193–217. [PubMed]