Fiksatif Karnovsky Mencegah Munculnya Artefak Sebagai Vakuolasi yang Berasal dari Pemrosesan Jaringan pada Ginjal yang Diobati Dengan Antisense Oligonukleotida Ⅰ

Abstrak: Oligonukleotida antisense(ASO) terapi telah diidentifikasi sebagai modalitas pengobatan baru untukpenyakit yang sulit disembuhkan. Di dalamginjal yang diobati dengan ASO, vakuola, selain butiran basofilik, sering terlihat di tubulus proksimal. Beberapa laporan menjelaskan bahwa vakuola ini kemungkinan besar merupakan fenomena sekunder akibatekstraksi ASOselama pemrosesan jaringan. Dalam penelitian ini, kami membandingkan morfologi ginjal setelah fiksasi dengan fiksatif Karnovsky atau buffer paraformaldehyde phosphate (PFA) 4% dengan larutan buffer formaldehida netral (NBF) 10%. Tikus Sprague-Dawley betina, diobati secara intravena empat kali dengan 50 mg/kg asam nukleat terkunci yang mengandung antisense oligonukleotida (LNA-ASOs) selama 1 atau 2 minggu, diperiksa. Secara mikroskopis, vakuola dan butiran basofilik di tubulus proksimal diamati pada ginjal yang difiksasi dengan NBF. Butiran basofilik menunjukkan akumulasi ASO. Selain itu, beberapa vakuola juga mengandung butiran basofilik yang samar, menunjukkan bahwa vakuola tersebut relevan dengan akumulasi ASO. Meskipun vakuola sedang diamati di tubulus proksimal, sebagian besar epitel bervakuola negatif untuk molekul kerusakan ginjal-1 pada pewarnaan imunohistokimia. Vakuola di tubulus proksimal tidak diamati pada sampel yang difiksasi Karnovsky, meskipun butiran basofilik diamati. Dalam sampel yang difiksasi PFA, vakuola dan butiran basofilik diamati di tubulus proksimal, serupa dengan sampel yang difiksasi NBF. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan kemungkinan perkiraan vakuola yang berlebihan karena artefak selama pemrosesan jaringan ketika menggunakan fiksasi NBF konvensional. Fiksatif Karnovsky dianggap sebagai alternatif yang berguna untuk membedakan vakuola buatan dari nefrotoksisitas sebenarnya. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Kata kunci:oligonukleotida antisense, artefak,Fiksatif Karnovsky, vakuolasi, butiran basofilik, ginjal

Suplemen Cistanche Suplemen Pendukung Fungsi Ginjal PhGs75% Ech 30% Act 12%

Baru-baru ini, terapi antisense oligonukleotida (ASO) telah ditetapkan sebagai modalitas baru untuk pengobatan penyakit yang sulit disembuhkan1,2. ASO adalah oligodeoksinukleotida pendek, sintetik, beruntai tunggal yang berikatan dengan asam ribonukleat dan menekan ekspresi gen3.

Secara toksikologi, toksisitas yang disebabkan oleh ASO dikategorikan menjadi toksisitas yang bergantung pada hibridisasi, yang terkait dengan rangkaian ASO, dan toksisitas yang tidak bergantung pada hibridisasi, yang terkait dengan modifikasi kimia. Toksisitas yang tidak bergantung pada hibridisasi disebabkan oleh tiga mekanisme utama: 1) akumulasi ASO, 2) efek proinflamasi, dan 3) efek pengikatan aptamerik4. Akumulasi ASO terutama terlihat di hati dan ginjal, dan akumulasi yang berlebihan menyebabkan disfungsi organ-organ ini5. Efek pro-inflamasi diinduksi oleh stimulasi sistem imun bawaan melalui pengikatan reseptor mirip Toll pada hewan pengerat dan monyet atau aktivasi jalur komplemen alternatif melalui penghambatan faktor H oleh ASO pada monyet6. Efek pengikatan aptamerik menginduksi aktivasi dan agregasi/trombositopenia trombosit untuk mengikat reseptor spesifik trombosit7. Selain itu, pengikatan aptamerik dengan protein intraseluler dalam hepatosit dianggap sebagai salah satu penyebab hepatotoksisitas8-10. Untuk mendeteksi toksisitas ini, para peneliti telah mengembangkan beberapa pengujian nonklinis; Diantaranya, pemeriksaan histopatologi merupakan salah satu pemeriksaan yang paling sensitif untuk mendeteksi akumulasi ASO.

Secara histopatologis, akumulasi ASO umumnya terlihat sebagai butiran basofilik di sitoplasma sel Kupffer di hati atau tubulus proksimal ginjal. Akumulasi butiran basofilik yang menonjol berkorelasi dengan peningkatan insiden atau keparahan perubahan degeneratif, yang umumnya terlihat sebagai vakuolasi atau degenerasi/nekrosis epitel tubulus proksimal di ginjal4. Butiran basofilik saja tidak dianggap signifikan secara toksik11; oleh karena itu, diferensiasi akumulasi granula basofilik dari perubahan degeneratif penting untuk mengevaluasi toksisitas terkait ASO.

Vakuola, yang sering diamati di tubulus proksimal ginjal monyet cynomolgus yang diobati dengan ASO, mengandung bahan basofilik dan menunjukkan distribusi umum yang sama di dalam sel seperti butiran basofilik11, 12. Beberapa laporan menunjukkan bahwa proses fiksasi dapat mempengaruhi munculnya akumulasi ASO dalam kompartemen fagolisosom5, 11. Selain itu, Henry et al. dan Engelhardt menjelaskan bahwa vakuola di tubulus proksimal kemungkinan merupakan fenomena sekunder yang dihasilkan dari ekstraksi ASO selama pemrosesan karena vakuola tidak ada di ginjal yang diperbaiki perfusi paraformaldehyde/glutaralde hyde5, 11. Vakuola di tubulus proksimal monyet cynomolgus yang dirawat dengan mipomersen diperkirakan muncul selama proses fiksasi13.

Jadi, meskipun vakuolasi akibat pengobatan ASO mungkin merupakan artefak dalam beberapa kasus, hipotesis ini belum terbukti secara jelas, dan tidak ada laporan yang mengidentifikasi metode fiksasi yang tepat untuk evaluasi toksikologi. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami membandingkan morfologi ginjal setelah fiksasi dengan fiksatif Karnovsky atau buffer paraformaldehyde phosphate (PFA) 4% dengan larutan buffer formaldehida netral (NBF) 10%. Selain itu, kami menunjukkan kegunaan fiksatif Karnovsky sebagai fiksatif alternatif untuk mencegah vakuola yang berasal dari artefak.

Tikus Sprague-Dawley betina berumur empat minggu dibeli dari Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Jepang) dan disesuaikan dengan kondisi laboratorium. Hewan-hewan dipelihara dalam kondisi terkendali (siklus terang/gelap 12-jam, suhu 23 ± 2 derajat, kelembaban relatif 50 ± 25%) dan diberi akses gratis ke makanan komersial standar (CR-LPF yang diautoklaf; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokyo, Jepang) dan air keran. Dua puluh hewan dialokasikan ke empat kelompok berikut (dengan masing-masing lima hewan): kelompok yang diberi larutan garam selama 1-minggu (Kontrol- 1W), kelompok yang diberi larutan garam 2-minggu (Kontrol{ {14}}W), asam nukleat terkunci 1-minggu yang mengandung kelompok yang diberi perlakuan antisense oligonukleotida (LNA-ASO) (ASO-1W), dan 2-minggu yang diberi perlakuan LNA ASO (ASO-2W). Hewan-hewan tersebut berumur 5 minggu pada saat inisiasi pemberian LNA-ASO 50 mg/kg. LNA-ASO diberikan secara intravena sebanyak empat kali sesuai dengan rejimen berikut: hari ke-1, 4, 8, dan 11 pada kelompok ASO-2W; dan hari 1, 2, 3, dan 4 di grup ASO-1W. Hewan pada kelompok Kontrol-1W dan ASO-1W dikorbankan pada hari ke 7. Hewan pada kelompok Kontrol-2W dan ASO-2W dikorbankan pada hari ke 7. 14. Pada setiap nekropsi terminal, sampel darah untuk patologi klinis dikumpulkan dari vena cava abdominalis dengan anestesi mendalam dengan isofluran. Setelah pengambilan sampel darah, seluruh tikus di-eutanasia dengan cara exsanguination dengan segera memotong aorta abdominalis. Permukaan luar tubuh, rongga dada dan perut, serta organ dalam diperiksa secara makroskopis, dan ginjal kiri diangkat dan diproses untuk pemeriksaan mikroskopis. Semua prosedur dilakukan sesuai dengan Aturan Pemberian Makan dan Penyimpanan Hewan Percobaan dan Hewan Percobaan Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Sampel serum diperoleh dengan sentrifugasi sampel darah pada suhu 4 derajat. Analisis biokimia serum dilakukan menggunakan instrumen TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Jepang) untuk menilai kadar nitrogen urea darah (BUN) dan kreatinin (CRE)

Ginjal difiksasi menggunakan tiga larutan fiksatif sebagai berikut: Setelah membagi ginjal secara melintang menjadi tiga segmen, bagian tengah termasuk panggul ginjal, difiksasi dalam NBF 10% selama 5 hari; bagian tengkorak difiksasi dalam fiksatif Karnovsky (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokyo, Jepang); dan bagian ekor difiksasi dalam PFA 4% selama 17 jam pada suhu 4 derajat dan kemudian ditempatkan dalam NBF 10% selama 24 jam. Setiap sampel tetap didehidrasi dan ditanam dalam parafin. Bagian jaringan disiapkan untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E). Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan menggunakan antibodi yang menargetkan molekul cedera ginjal-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA; pengenceran 1:300) dan protein membran terkait lisosom 2 (LAMP{{ 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA; pengenceran 1:1000) setelah pengambilan antigen (buffer sitrat, pH 6,0, dipanaskan selama 10 menit atau dipanaskan di bawah tekanan selama 20 menit). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Jepang) digunakan sebagai antibodi sekunder.

Layanan Pendukung Wecistanche:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko