Perancangan In Silico Vaksin Peptida Multi-subunit Polivalen Baru yang Memanfaatkan Imunitas Silang Terhadap Leishmaniasis Visceral dan Kulit Manusia: Suatu Pendekatan Berbasis Imunoinformatika

Abstrak

Konteks Leishmaniasis adalah sekelompok penyakit menular yang ditularkan melalui vektor yang disebabkan oleh lebih dari 20 spesies Leishmania patogen yang endemik di banyak negara tropis dan subtropis. Munculnya strain yang resistan terhadap obat, efek samping obat anti-Leishmania, dan tidak adanya strategi vaksinasi preventif mengancam populasi sensitif. Baru-baru ini, banyak kelompok peneliti yang memanfaatkan bidang vaksinologi terbalik untuk mengembangkan vaksin, dengan fokus utama pada upaya menginduksi kekebalan terhadap leishmaniasis viseral atau kulit.

cistanche tubulosa—Anti inflamasi

MetodePekerjaan ini melibatkan pengambilan dua belas rangkaian protein antigenik leishmanial yang divalidasi secara eksperimental dari database UniProt, diikuti dengan profil antigenisitasnya menggunakan server ANTIGENpro dan Vaxijen 2.0. Epitop pengikatan MHC untuk hal yang sama diprediksi menggunakan server NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI, sedangkan epitop untuk sel B dihitung menggunakan server ABCpred dan BepiPred 2.0. Epitop yang disaring dengan skor yang jauh lebih tinggi digunakan untuk merancang konstruksi vaksin dengan penghubung dan bahan pembantu alami yang sesuai. Struktur sekunder dan tersier dari peptida sintetik ditentukan oleh masing-masing bidang acak bersyarat, jaringan saraf dangkal, dan penyelarasan threading profil-profil dengan simulasi perakitan struktur berulang. Model vaksin 3-D divalidasi melalui penyempurnaan yang teruji CASP10-dan server web MolProbity. Docking molekuler dan simulasi analisis mode normal multiskala dilakukan untuk menganalisis kompleks vaksin-TLR terbaik. Yang terakhir, temuan simulasi imun komputasi mengungkapkan respons imun seluler dan humoral yang menjanjikan, menunjukkan bahwa peptida chimeric yang direkayasa merupakan vaksin spektrum luas yang potensial melawan leishmaniasis viseral dan kulit.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Kata kunci Leishmaniasis · Vaksinologi terbalik · TLR · Vaksin multi-epitop · Simulasi dinamika molekuler · Pemodelan homologi

Perkenalan

Leishmaniasis adalah sekelompok penyakit parasit yang disebabkan oleh berbagai anggota genus Leishmania, protozoa parasit intraseluler dimorfik [1]. Leishmaniasis mempengaruhi sebagian besar populasi dari status sosial ekonomi rendah di negara-negara tropis dan subtropis di seluruh dunia [2]. Penyakit ini ditularkan melalui vektor, dan parasitnya ditularkan melalui gigitan lalat pasir betina phlebotomine yang terinfeksi (WHO, 2019). Menurut laporan terbaru Organisasi Kesehatan Dunia, 700, 000 hingga 1 juta kasus baru dan sekitar 26,000 hingga 65, 000 kematian terjadi setiap tahunnya (WHO, 2019). Di Afrika Timur, wabah leishmaniasis visceral sering terjadi. Wilayah Mediterania Timur menyumbang 70% kasus leishmaniasis kulit di seluruh dunia (WHO, 2019). Pada tahun 2017, 20.792 dari 22.145 (94%) kasus baru yang dilaporkan ke WHO terjadi di tujuh negara: Brazil, Ethiopia, India, Kenya, Somalia, Sudan Selatan, dan Sudan (WHO, 2017). Karena skenario yang mengkhawatirkan ini, langkah-langkah untuk mengendalikan dan memberantas penyakit ini juga harus digarisbawahi di negara kita. Leishmaniasis memiliki beragam manifestasi klinis, dan terdapat tiga bentuk utama penyakit ini—visceral (juga dikenal sebagai kala-azar dan merupakan bentuk penyakit yang paling parah), kulit (yang paling umum), dan mukokutan (WHO, 2019) . Bukti penyembuhan diri pada beberapa kasus leishmaniasis kulit (CL) dan kekebalan yang dihasilkan terhadap infeksi ulang menyimpulkan kemungkinan cakupan vaksinasi sebagai metode yang layak untuk mengendalikan leishmaniasis selama periode tersebut [3]. Namun, sampai saat ini, tidak ada vaksin berlisensi yang tersedia untuk melawan leishmaniasis pada manusia. Meskipun beberapa kandidat vaksin potensial telah maju ke tahap uji klinis, banyak diantaranya masih dalam tahap penelitian dan pengembangan awal [4]. Pembuatan vaksin peptida merupakan bidang penelitian yang dominan dan menjanjikan dalam bidang ini. Berbeda dengan parasit hidup atau parasit yang dilemahkan atau vaksin berbasis subunitnya, peptida sintetik memiliki beberapa keunggulan yang mencakup tidak adanya bahan yang berpotensi membahayakan, kompleksitas antigen yang lebih rendah, stabilitas yang baik, dan biaya peningkatan yang rendah [1, 5]. Mengembangkan vaksin baru memerlukan wawasan yang lebih dalam mengenai imunologi, biologi molekuler, dan teknik kimia. Oleh karena itu, para ilmuwan di semua bidang bekerja sama untuk merancang dan memproduksi vaksin yang aman dan efektif [6]. Vaksin yang ideal untuk melawan leishmaniasis harus menghasilkan kekebalan jangka panjang dan respons imun yang dimediasi TH-1 dan TH-2-yang seimbang [4, 7]. Pendekatan berbasis imunoinformatika untuk merancang kandidat vaksin baru merupakan strategi baru yang terutama menggunakan alat komputasi untuk memprediksi vaksin peptida multi-subunit yang stabil secara struktural dan imunogenik dalam waktu singkat. Protein yang terutama ditemukan memiliki fitur imunogenik yang diperlukan untuk memberikan kekebalan terhadap penyakit dalam penelitian imunologi sebelumnya yang melibatkan model hewan percobaan atau analisis in silico lainnya adalah kandidat epitop terbaik [1, 8-10]. Di antara protein yang sedang diselidiki, protein LACK (antigen C-kinase teraktivasi Leishmania) adalah protein yang sangat terkonservasi di seluruh spesies Leishmania, dan dianggap sebagai kandidat vaksin yang layak untuk melawan leishmaniasis manusia [11]. Telah terbukti menjadi target utama respon imun pada tikus BAL b/c yang sensitif [12]. KMP-11 (protein membran kinetoplastid-11) terdapat di semua protozoa kinetoplastid dan juga dianggap sebagai kandidat vaksin potensial yang terbukti meningkatkan kadar IL-10 pada model murine, yang menunjukkan potensi imunogeniknya [13]. Leishmanolysin, atau GP63, adalah proteinase permukaan yang telah dipostulatkan sebagai faktor virulensi yang terlibat dalam interaksi langsung parasit dengan reseptor makrofag inang [14]. Protein membran LCR1 dan GP46 juga ditemukan meningkatkan produksi IFN-gamma, dan karenanya, dianggap membantu dalam mengembangkan vaksin umum melawan infeksi Leishmania [5, 15]. Protein kejutan panas (HSP) adalah molekul yang sangat terkonservasi dan sangat imunogenik untuk menginduksi jalur imunitas adaptif MHC-I dan MHCII dan dianggap memiliki peran penting dalam pengembangan vaksin melawan leishmaniasis menular [16]. Leishmania hydrophilic acylated surface protein-B (HASP-B) hanya diekspresikan pada parasit infektif yang menunjukkan peran dalam virulensi parasit dan, oleh karena itu, merupakan kandidat vaksin yang potensial [17]. Protein Kinetoplastid parafagellar rod (PFR) juga memiliki kepentingan terapeutik dan profilaksis karena distribusi evolusionernya yang terbatas, organisasi tingkat tinggi, dan imunogenisitas yang tinggi [18]. Demikian pula, protease sistein dan proteofosfoglikan juga bertindak sebagai faktor virulensi penting bagi parasit pada mamalia dan merupakan target obat yang menarik untuk leishmaniasis [19-21]. Selain itu, protein beta-tubulin juga sebelumnya telah dikarakterisasi sebagai antigen perangsang sel T dari Leishmania, meskipun kemanjurannya sebagai kandidat vaksin belum dicoba [22]. Beta-tubulin dari L. donovani juga dianggap sebagai target obat potensial terhadap leishmaniasis visceral [23]. Terakhir, protein faktor translasi eIF5A dari L. braziliensis telah terbukti menginduksi perlindungan heterolog terhadap leishmaniasis pada hewan ketika diberikan sebagai vaksin dalam kombinasi dengan protein rekombinan lainnya. Hal ini meningkatkan sekresi sitokin spesifik parasit pada hewan yang divaksinasi. Protein eIF5A juga disimpan di semua eukariota (24). Sebelumnya, Khatoon dkk. menggambarkan pendekatan berbasis imunoinformatik untuk merancang vaksin peptida multi-subunit terhadap leishmaniasis visceral (VL) dengan mengeksplorasi protein sekretori L. donovani [6]. Di sini, kami memilih berbagai antigen leishmanial di berbagai spesies parasit yang menular. Pada saat yang sama, semua protein ini telah diidentifikasi (baik melalui penelitian pada hewan secara in vitro atau dengan menggunakan alat komputasi) untuk memicu respons imun, sehingga memicu imunitas protektif. Urutan protein yang dipilih berasal dari salah satu dari lima spesies patogen Leishmania, yaitu Leishmania mayor, Leishmania Mexicana, Leishmania donovani, Leishmania chagasi, dan Leishmania amazon, di antaranya L. donovani adalah parasit utama penyebab leishmaniasis visceral (VL), sedangkan yang lainnya terutama bertanggung jawab menyebabkan leishmaniasis kulit (CL) atau mukokutaneus (MCL). Alasan di balik pemilihan beragam jenis protein yang dilestarikan dan imunogenik pada spesies Leishmania yang berbeda adalah untuk merancang vaksin peptida umum yang akan memberikan imunitas silang spektrum luas terhadap kedua bentuk leishmaniasis (VL dan CL) yang umumnya menyerang manusia. .

Apa yang dilakukan ramuan cistanche—Anti-inflamasi

Bahan dan metode

Seleksi dan pengambilan rangkaian protein antigenik Leishmania

Urutan asam amino lengkap dari dua belas protein antigenik spesifik Leishmania diambil dari database Uniprot (Universal Protein Resource) (https://www.unipr ot.org/uniprot/) dalam format FASTA (diakses pada 21.{{16} }3.2022). Seperti disebutkan sebelumnya, semua protein ini dilaporkan sebagai kandidat vaksin yang imunogenik, sangat terkonservasi, dan potensial, seperti yang ditemukan dalam penelitian imunologi sebelumnya yang melibatkan model hewan atau metode prediksi komputasi in silico. Antigenisitas protein yang dipilih dihitung dengan menggunakan server ANTIGENpro (// scratch.proteomics.ics.uci.edu/) yang menghitung antigenisitas rangkaian protein masukan dengan memanfaatkan pengklasifikasi dua tahap berbasis SVM yang divalidasi sepuluh kali lipat. pendekatan validasi silang [25]. Protein tersebut kemudian dilakukan analisis peptida sinyal menggunakan server SignalP 4.1 (SignalP—4.1— Services—DTU Health Tech) untuk membedakan antara protein sekretori klasik dan non-sekretori (transmembran). Metode ini menggabungkan prediksi situs pembelahan dan prediksi peptida sinyal/peptida non-sinyal berdasarkan kombinasi beberapa jaringan saraf tiruan [26]. Prediksi lokalisasi untuk semua protein dilakukan selanjutnya menggunakan DeepLoc (DeepLoc—1.0—Layanan—DTU Health Tech), algoritma bebas templat yang menggunakan jaringan saraf dalam untuk memprediksi lokalisasi subseluler protein hanya dengan mengeksploitasi informasi urutan, mencapai akurasi yang baik [27]. Semua rangkaian protein fungsional, yang diperoleh dari server SignalP 4.1, selanjutnya diprediksi keberadaan determinan antigenik (epitop) yang akan dikenali oleh reseptor sel B dan T. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa konstruksi vaksin yang dirancang hanya mengandung epitop sel T dan sel B yang imunodominan sehingga mampu mendorong respons imun yang efisien yang melibatkan jalur mekanisme imun yang dimediasi humoral dan sel.

Prediksi epitop limfosit T sitotoksik (CTL).

Prediksi epitop limfosit T sitotoksik (CTL) merupakan aspek penting dalam merancang peptida yang ideal [28]. Server web yang dapat diakses secara bebas, yaitu NetCTL1.2 (//www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL), digunakan untuk memprediksi epitop CTL untuk semua protein yang dipilih. Metode ini mengintegrasikan prediksi pengikatan peptida MHC kelas I, pembelahan terminal proteasomal C, dan efisiensi transpor TAP [29], yang semuanya merupakan fitur penting yang harus dimiliki oleh rangkaian epitop pengikat CTL. Server memungkinkan prediksi epitop CTL terbatas pada 12 supertipe MHC kelas I, di antaranya hanya supertipe A1 yang digunakan untuk penelitian ini. Pengikatan MHC kelas I dan pembelahan proteasomal dilakukan menggunakan jaringan saraf tiruan. Efisiensi transportasi TAP diprediksi menggunakan matriks bobot [29]. Urutan dengan skor pengikatan yang lebih tinggi dianggap sebagai epitop CTL yang kuat. Selain NetCTL 1.2, pendekatan berbasis server web lain yang tersedia untuk umum, yaitu, SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm), juga digunakan untuk prediksi epitop CTL dari semua protein Leishmania yang dipilih. Perkiraan ini didasarkan pada motif yang dipublikasikan dan mempertimbangkan asam amino pada posisi jangkar dan jangkar tambahan serta asam amino lain yang sering digunakan [30]. Dari daftar tipe MHC yang disediakan di server ini, HLA-A*01, HLA-A*02:01, dan HLA-A*03 dipilih untuk prediksi. Pencarian epitop ditentukan untuk urutan nonamer untuk perbandingan seragam dengan hasil yang diberikan oleh server NetCTL 1.2. Hanya epitop umum dari masing-masing protein (jika ada), yang diprediksi oleh server NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI dengan skor kompatibel yang lebih tinggi, yang dipilih untuk pembuatan vaksin akhir.

Prediksi epitop limfosit T pembantu (HTL).

Limfosit T pembantu adalah sel imun yang paling penting karena dibutuhkan dalam semua jenis respons imun adaptif. Oleh karena itu, prediksi epitop HTL (terutama tipe Th-1) menjadi elemen penting dalam merancang vaksin peptida yang efektif. Dalam penelitian ini, alat analisis pengikatan MHC-II di server IEDB (Immuno Epitope Datan base and Analysis) (http://tools.iedb.org/mhcii/) digunakan untuk prediksi 15-mer HTL epitop untuk sekumpulan tiga alel manusia, yaitu HLA-DRB1*01:01, HLADRB1*01:02, dan HLA-DRB1*01:03. Alel HLA manusia dipilih untuk estimasi yang lebih realistis mengenai afinitas pengikatan MHC-II pada epitop saat vaksin sedang dirancang untuk melawan leishmaniasis manusia. Output yang diprediksi diberikan dalam satuan IC50nM untuk perpustakaan kombinatorial dan penyelarasan SMM. Oleh karena itu, angka yang lebih rendah menunjukkan afinitas yang lebih tinggi. Metode prediksi yang direkomendasikan IEDB digunakan dalam pendekatan ini di mana peringkat penyesuaian yang rendah merupakan indikasi pengikat MHC-II yang sesuai dan, karenanya, dapat didefinisikan sebagai epitop HTL yang kuat.

Identifikasi dan pemilihan epitop HT yang menginduksi sitokin

Sitokin sangat penting untuk berfungsinya sistem kekebalan tubuh. Serangkaian sitokin seperti IL-2, IL-4, IL-6, dan interferon- dapat menginduksi respons imun yang dimediasi CTL dan humoral [31]. Oleh karena itu, epitop HTL yang dapat memicu produksi sitokin lebih disukai untuk merancang vaksin profilaksis kekebalan. Dengan pandangan ini, server IFNepitope (http://crdd.osdd.net/raghava/ ifnepitope/) digunakan untuk mengidentifikasi epitop HTL yang memiliki kemampuan menginduksi sitokin. IFNepitope adalah server prediksi online yang bertujuan untuk memprediksi peptida dari rangkaian protein yang dapat menginduksi IFN-gamma yang dilepaskan dari sel T CD4+. Server web telah dikembangkan berdasarkan kumpulan data yang terdiri dari pengikat MHC kelas II yang menginduksi IFN-gamma dan non-induksi [32]. Epitop HTL yang diprediksi oleh server IEDB dengan afinitas pengikatan MHC-II yang lebih tinggi (peringkat yang disesuaikan lebih rendah) diberikan sebagai masukan untuk memeriksa kemampuan memproduksi sitokinnya oleh server IFNepitope. Epitop yang diidentifikasi kemudian dikenakan analisis tingkat berikutnya oleh server IL4pred (IFNepitope(iiitd.edu.in) dan juga oleh server IL10Pred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/il10pred/predict3 .php) untuk memastikan bahwa epitop HTL yang dipilih juga akan membangkitkan sekresi masing-masing IL-4 dan IL-10. Mereka juga mempertimbangkan konservasi posisi residu asam amino dan komposisi asam amino dari peptida untuk prediksi yang lebih akurat.33, 34 Epitop HTL pengikat MHC-II yang diprediksi positif oleh ketiga server dipilih untuk digabungkan dalam pembuatan vaksin akhir.Strategi ini diadopsi untuk meningkatkan kemanjuran vaksin karena dapat memicu respons intens yang melibatkan beragam sitokin (IFN-gamma, IL-4, dan IL-10), yang menghasilkan kekebalan yang dipercepat dan bertahan lama.

Analisis konservasi epitop

Epitope conservation analysis becomes essential to check whether the chosen epitope(s) is conserved across different species of Leishmania proteins. Designing a subunit vaccine consisting of conserved epitopes offers a promising scope for broad-spectrum protective immunity against leishmaniasis. Conservation analysis for each of the selected CTL and HTL epitopes was done by using the IEDB "Epitope Conservation Analysis" tool available within the IEDB portal (http://tools.iedb.org/conservancy/). This tool calculates the degree of conservation of the target epitope (e) within a set of homologous protein sequences (P) as the fraction of {p} that matched the aligned e above the chosen identity level while considering that the target epitope is sequential [35]. Firstly, the corresponding source proteins from which the CTL and HTL epitopes were finally selected were subjected to a BLAST search, for which we used the Uniprot BLAST tool (https://www.uniprot.org/blast/). From the BLAST result, the aligned protein sequences (belonging to the genus Leishmania) that showed significantly high similarity with the query sequence (>40%) were selected. Such sequences were compiled to constitute an epitope-specific dataset, and the same was provided as the input set of proteins (P) to be used for conservation analysis by the tool. Next, the sequences for selected CTL and HTL epitopes were screened individually against their respective datasets that revealed the relative conservation of the epitopes across a set of related Leishmania proteins. The threshold identity level was set at>100% (standar).

Merancang rangkaian vaksin multi-epitop

Berdasarkan analisis imunoinformatik, rangkaian primer vaksin subunit dibuat dengan menggabungkan rangkaian epitop CTL dan HTL yang dipilih. Epitop ini masing-masing dihubungkan oleh linker AAY dan GPGPG [28, 31]. Tautan dimasukkan untuk pemisahan yang tepat dari masing-masing epitop yang diperlukan agar konstruksi vaksin dapat berfungsi secara efisien [28, 36]. Kedua, penambahan bahan pembantu yang tepat sangat penting dalam subunit vaksin untuk meningkatkan respon imun [31]. Pemilihan bahan pembantu yang sesuai merupakan hal penting dalam merancang vaksin untuk uji coba pada manusia. IL-12 yang diproduksi oleh berbagai sel imun sangat penting dalam mengembangkan imunitas seluler terhadap leishmaniasis, dan potensi IL-12 sebagai bahan pembantu dalam vaksin melawan leishmaniasis telah dilaporkan pada model murine [3, 37, 38]. IL-12 ini dipilih sebagai bahan pembantu untuk merancang vaksin, dan urutannya dimasukkan dalam terminal N konstruksi vaksin menggunakan tautan EAAK [28, 31]. Urutan rantai alfa IL-12 manusia diambil dari database Uniprot (www.uniprot.org; Nomor Akses P29459). Terakhir, konstruksi vaksin peptida diperoleh dengan epitop adjuvan, penghubung, CTL, dan HTL (dengan penghubung AAY dan GPGPG intra-epitopik) dalam urutan yang berpindah dari terminal N ke terminal C.

Prediksi epitop sel B konformasional dan linier

Imunitas humoral melibatkan sintesis dan sekresi antibodi spesifik oleh sel B yang teraktivasi, yang memerlukan adanya determinan antigenik yang dikenali oleh reseptor sel B yang terdapat pada permukaan limfosit B. Vaksin peptida pelindung kekebalan yang ideal harus memiliki komponen-komponen tersebut agar dapat berinteraksi dan merangsang sel B. Oleh karena itu, dua server, yaitu ABCpred dan BepiPred 2.0, diterapkan untuk prediksi epitop sel B yang tepat dalam urutan primer vaksin yang dirancang. Server ABCpred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ abcpred/ABC_submission.html) adalah pendekatan berbasis jaringan syaraf tiruan (JST) yang memprediksi epitop sel B dalam rangkaian antigen tertentu menggunakan parameter panjang tetap. Dataset pelatihan yang digunakan dalam metode ini berisi epitop sel B dari database epitop sel B (BCIPEP). Server mampu memprediksi epitop dengan akurasi 65,93% menggunakan jaringan saraf berulang [39]. Urutan utama dari konstruksi vaksin akhir diberikan sebagai masukan dalam format biasa, dan parameter default server ABCpred, termasuk nilai ambang batas 0.51 dengan panjang jendela 16 residu asam amino, digunakan untuk prediksi. Server BepiPred 2.0 (BepiPred—2.0—Layanan—DTU Health Tech), di sisi lain, memprediksi epitop sel B berurutan dari urutan masukan dengan algoritme hutan acak yang dilatih pada epitop dan asam amino non-epitop ditentukan dari struktur kristal diikuti dengan pemulusan prediksi berurutan [40]. Urutan utama vaksin diberikan dalam format FASTA sebagai masukan. Penerapan dua server berbeda yang memprediksi epitop sel B berdasarkan dua algoritma berbeda membuat prediksi lebih realistis. Sebagian besar determinan antigenik yang dikenali oleh reseptor sel B dan antibodi bersifat diskontinyu, yang berarti mereka mengandung residu asam amino yang terletak berjauhan dalam struktur primer imunogen namun berdekatan satu sama lain selama pelipatan protein [41]. Prediksi epitop sel B yang terputus-putus dalam struktur tersier vaksin yang divalidasi dilakukan dengan memanfaatkan server ElliPro (//tools.iedb.org/ellip ro/) yang tergabung dalam portal IEDB. ElliPro adalah alat web yang dapat diakses secara bebas yang mengimplementasikan metode Thronton yang dimodifikasi dan memperhitungkan pusat massa setiap residu, bukan atom C. Melakukan hal ini akan menghubungkan masing-masing epitop dengan skor yang ditetapkan sebagai PI (indeks tonjolan) yang dirata-ratakan terhadap residu epitop. Epitop terputus-putus ditentukan berdasarkan nilai PI masing-masing dan dikelompokkan berdasarkan jarak antara pusat massa residu (R). Nilai R yang lebih besar berkorelasi dengan prediksi epitop terputus yang lebih signifikan (42). Pada saat yang sama, epitop sel B linier dalam model protein masukan juga dapat diprediksi dan divisualisasikan dengan menggunakan ElliPro. Deteksi epitop sel B linier dan terputus-putus dalam model vaksin 3D yang disempurnakan memastikan keberhasilan strategi perancangan vaksin.

Profil antigenisitas, alergenisitas, dan toksisitas konstruksi vaksin

Antigenisitas merupakan kriteria penting untuk vaksin profilaksis imun. Untuk memastikan bahwa konstruksi vaksin yang dirancang akan menghasilkan respons imun jangka panjang melalui interaksi dengan reseptor sel B dan T, antigenisitasnya dievaluasi menggunakan server ANTIGENpro dan VaxiJen 2.0. Server ANTIGENpro (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) dengan tepat mengklasifikasikan 82% antigen pelindung yang diketahui ketika dilatih hanya menggunakan kumpulan data protein microarray. Keakuratan kumpulan data gabungan diperkirakan mencapai 76% melalui sepuluh kali lipat eksperimen validasi silang yang memungkinkan pengenalan peptida antigenik dengan lebih baik secara signifikan. Ini berjalan pada arsitektur dua tahap, termasuk pengklasifikasi tahap kedua berbasis SVM. Untuk rangkaian protein masukan baru, probabilitas yang dihitung oleh prediktor SVM tahap kedua adalah skor prediksi akhir ANTIGENpro [25]. VaxiJen2.0 (http://www.dog-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html) adalah server web lain yang dapat diakses publik yang mengevaluasi antigenisitas rangkaian protein dengan pendekatan bebas penyelarasan yang didasarkan pada pada transformasi auto cross-covariance (ACC) sekuens protein menjadi vektor seragam dari sifat asam amino utama dan memungkinkan klasifikasi antigen hanya berdasarkan berbagai sifat fisikokimia protein tanpa mengacu pada penyelarasan sekuens [43]. Kedua, untuk mengesampingkan kemungkinan bahwa pembuatan vaksin dapat memicu respons alergi pada seseorang, server AlgPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpr ed/submission.html) digunakan untuk menentukan alergenisitasnya. Alat server menyediakan berbagai pendekatan, termasuk pemetaan epitop IgE, motif MEME/MAST, metode SVM berdasarkan komposisi dipeptida, dan BLAST ARP, yang semuanya dimanfaatkan untuk prediksi yang akurat. Ambang batas ditetapkan pada 0.4 (default) untuk presisi prediksi yang lebih tinggi. Selain itu, AllerTop v.2.{{20}} (https://www.dog-pharmfac.net/AllerTOP/index.html), alat berbasis server web yang dapat diakses secara bebas, juga diterapkan untuk memastikan sifat non-alergi dari pembuatan vaksin. Metode ini didasarkan pada transformasi urutan protein auto-kovarians (ACC) menjadi vektor seragam dengan panjang yang sama. Ini telah diterapkan pada studi hubungan struktur-aktivitas kuantitatif (QSAR) peptida dengan panjang berbeda, dan protein diklasifikasikan berdasarkan algoritma k-nearest neighbour (44). Toksisitas, jika ada, diprediksi dengan memanfaatkan server ToxinPred (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/prote in.php). Alat prediksi ini bekerja berdasarkan teknik pembelajaran mesin dan metode kuantitatif yang dilatih pada kumpulan data berbagai peptida beracun dan tidak beracun yang diperoleh dari SwissProt dan TrEMBL [45]. Profil toksisitas sangat penting untuk menilai keamanan vaksin dan peptida imunoterapi lainnya yang dimaksudkan untuk uji coba pada manusia. Analisis dilakukan dengan memilih pendekatan SVM (TrEMBL)+motif-based pada ambang nilai E sebesar 10.0 untuk metode berbasis motif dan ambang batas SVM sebesar 0,1.

Evaluasi sifat fisikokimia

Menjelaskan ciri-ciri fisik dan kimia dari peptida chimeric menjadi penting karena, ketika diberikan sebagai vaksin, peptida tersebut harus mampu menginduksi respon imun yang tepat. Server ProtParam yang tersedia dengan portal ExPASY (Expert Protein Analysis System) (https://web.expasy.org/ program/) digunakan untuk menghitung berbagai parameter fisikokimia dari konstruksi vaksin utama yang mencakup fitur seperti berat molekul, pI teoretis, indeks ketidakstabilan, indeks alifatik, waktu paruh in vivo dan in vitro, rata-rata hidrofobisitas (GRAVY), dan lain-lain.

Prediksi struktur sekunder peptida vaksin

Elemen struktur sekunder dari konstruksi vaksin yang dirancang diprediksi dengan menerapkan server PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) dan server properti RaptorX (http://raptorx.uchicago.edu/StructurePropertyPred/ prediksi/) keduanya merupakan server analisis struktur protein online yang dapat diakses secara bebas. Urutan utama peptida vaksin diberikan sebagai masukan. PSIPRED memprediksi struktur sekunder dari urutan protein masukan dengan mengeksploitasi dua jaringan saraf feed-forward yang berfungsi berdasarkan matriks penilaian posisi spesifik (PSSM) yang dihasilkan oleh PSI-BLAST [46]. Hal ini mencakup identifikasi rangkaian yang homolog dengan pembuatan vaksin kami melalui PSI-BLAST, diikuti dengan pembuatan PSSM. PSIPRED 3.2 dan versi yang lebih tinggi ditemukan mencapai skor rata-rata Q3 sebesar 81,6% sebagaimana dievaluasi dengan metode validasi silang tiga kali lipat yang ketat yang membuat pendekatan ini sangat tepat dan akurat. Server web properti RaptorX menggunakan teknik pembelajaran mesin terbaru yang disebut DeepCNF (bidang saraf konvolusional dalam) untuk memprediksi berbagai fitur seperti struktur sekunder, aksesibilitas pelarut, dan wilayah yang tidak teratur secara bersamaan. DeepCNF adalah pendekatan terintegrasi yang menggabungkan bidang acak bersyarat (CRF) dan jaringan saraf dangkal yang memodelkan hubungan urutan-struktur yang kompleks dengan arsitektur hierarki yang dalam dan dapat memperoleh sekitar 84% akurasi Q3 untuk struktur sekunder kelas 3-[47] .

Prediksi struktur tersier

Struktur tersier dari peptida vaksin akhir diprediksi menggunakan server web online I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/). I-TASSER adalah pendekatan pemodelan struktur protein hierarki berdasarkan penyelarasan threading profil-profil (PPA) dan simulasi perakitan struktur berulang yang diikuti dengan penyempurnaan struktur tingkat atom. Ia bekerja dalam tiga tahap: identifikasi templat struktural, perakitan struktur berulang, dan anotasi fungsi berbasis struktur. Model struktur peringkat teratas dengan estimasi akurasi global dan lokal dikembalikan dengan skor C dan skor TM yang representatif, yang berkorelasi dengan kualitas model yang diprediksi. Program I-TASSER mewakili salah satu metode paling sukses yang ditunjukkan dalam CASP untuk prediksi otomatis struktur dan fungsi protein [48, 49].

Penyempurnaan struktur tersier vaksin

Pemodelan komputasi konvensional dari suatu struktur protein saja tidak menjamin keaslian dan keakuratan model yang diprediksi karena strategi pemodelan tersebut sangat bergantung pada tingkat kemungkinan masukan (target) dengan struktur templat yang tersedia. Oleh karena itu, peningkatan kualitas model berbasis templat di luar akurasi dianggap perlu, dan ini dapat dicapai dengan menyempurnakan seluruh struktur protein. Dengan perspektif ini, keluaran model tridimensi dari server I-TASSER dengan skor C terbaik dilakukan penyempurnaan lebih lanjut oleh server GalaxyRefne (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type{ {4}} MEMPERBAIKI). Ini adalah pendekatan penyempurnaan yang telah teruji CASP10-di mana rantai samping protein dibangun kembali terlebih dahulu, lalu pengemasan ulang rantai samping dan pelonggaran struktur keseluruhan dilakukan dengan simulasi dinamika molekuler. Hal ini mengarah pada perbaikan yang tepat pada struktur tersier lokal dan global dari protein target (50).

manfaat suplemen cistanche—Anti-inflamasi

Validasi struktur tersier vaksin

Struktur tersier vaksin yang telah disempurnakan perlu divalidasi untuk menemukan potensi kesalahan yang mungkin terjadi dalam model 3D yang diprediksi. Model halus yang diperoleh dari server GalaxyRefne disediakan sebagai struktur masukan dalam format a.pdb. Selain itu, plot Ramachandran adalah pendekatan lain yang sangat berguna untuk memvisualisasikan daerah sudut dihedral phi (ϕ) dan psi (ψ) yang diperbolehkan dan tidak diperbolehkan secara energetik dari rantai samping asam amino yang dianggap sebagai komponen penting untuk validasi struktur protein. Oleh karena itu, server MolProbity [Halaman utama—MolProbity (duke.edu)] digunakan untuk menghasilkan plot Ramachandran untuk model vaksin tertentu berdasarkan validasi Phenix gaya MolProbity berbasis Python [51]. Kami selanjutnya menggunakan server ERRAT [SAVESv6.0—Structure Validation Server (UCLA.edu)] yang menganalisis statistik interaksi tidak terikat antara atom-atom berbeda dalam model dan memplot nilai fungsi kesalahan versus {{ 6}}residu meluncur [52]. Server web ProSA (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php), sebuah platform berbasis web interaktif berdasarkan program ProSA standar, digunakan untuk tujuan ini [53]. Langkah ini dilakukan untuk mendapatkan validasi struktur model yang lebih canggih dan tepat.

Rekayasa disulfida dari peptida vaksin

Ikatan disulfida berkontribusi terhadap stabilitas protein dengan menurunkan entropi konformasi dan juga dengan meningkatkan energi bebas dari keadaan terdenaturasi. Pengenalan ikatan disulfida baru telah dianggap sebagai alat bioteknologi penting untuk meningkatkan termostabilitas protein asli yang terlipat. Server Disulfide by Design 2 (DbD 2) v 2.12 digunakan untuk meningkatkan stabilitas struktural keseluruhan dari vaksin yang dirancang dengan memperkenalkan hubungan disulfida. Metode ini menggunakan geometri asli dan menghitung nilai energi untuk setiap potensi disulfida, sehingga memberikan cara untuk menentukan peringkat calon ikatan disulfida. Ikatan disulfida yang memberikan stabilitas maksimum adalah kandidat dengan nilai chi3, energi ikatan, dan faktor B yang tinggi [54]. Daerah fleksibel peptida dipilih berdasarkan parameter yang disebutkan sebelumnya, dan mutasi penstabil yang sesuai dibuat dengan membentuk hubungan disulfida antara pasangan residu yang dipilih.

Docking molekuler konstruksi vaksin dengan reseptor imun (TLR Manusia‑2, 4, 5, 8, dan TLR‑9 tikus)

Reseptor mirip tol (TLR) adalah atribut utama respons imun seluler yang mengenali pola molekuler terkait patogen (PAMP) dan membangkitkan respons imun bawaan terhadap infeksi. Aktivasi langsung TLR-2 dengan komponen Leishmania kemudian dilaporkan [55]. Dalam penelitian eksperimental terkait lainnya, kurangnya TLR-4 mengakibatkan peningkatan pertumbuhan parasit dan tertundanya penyembuhan lesi kulit yang disebabkan oleh infeksi L. mayor yang menunjukkan kemungkinan peran TLR-4 dalam menginduksi kekebalan terhadap Leishmania [56 ]. Di sisi lain, TLR-2, 4, dan 9 ditemukan terlibat dalam spektrum imunopatologis CL yang disebabkan oleh L. braziliensis dan L. amazonensis [57]. TLR-9 juga dievaluasi sebagai pemain kunci dalam aktivasi sel dendritik dalam patogenesis VL pada manusia [58]. Beberapa komponen turunan Leishmania telah terbukti mengaktifkan TLR-2, 4, dan 9 di sebagian besar penelitian yang dilakukan di bidang ini. Pengamatan ini menekankan fakta bahwa berbagai TLR terlibat dalam memicu kekebalan protektif terhadap Leishmania. Oleh karena itu, interaksi antara TLR dan rancangan vaksin dianggap perlu untuk memperoleh kekebalan efektif terhadap infeksi Leishmania. Hal ini diperiksa dengan melakukan docking molekuler peptida vaksin multi-epitopik dengan TLR manusia-2, 4, 5, 8, dan TLR tikus-9 menggunakan server PatchDock [PatchDock Server (tau.ac.il )]. Algoritma PatchDock memiliki tiga tahapan utama yaitu representasi bentuk molekul, pencocokan patch permukaan, serta filtering dan scoring. Ini adalah algoritma docking molekuler berbasis geometri yang pada prinsipnya beroperasi pada komplementaritas bentuk molekul antara reseptor dan ligan. Patch pelengkap dicocokkan, dan kandidat transformasi dihasilkan. Masing-masing transformasi ini diperingkat lebih lanjut dengan menetapkan fungsi penilaian yang mempertimbangkan energi desolvasi atom dan kaki geometri [59, 60]. Dalam penelitian kami, TLR manusia-2 (ID PDB: 6NIG), TLR-4 (ID PDB: 4G8A), TLR-5 (ID PDB: 3J0A), dan TLR-8 (ID PDB: 4QC0), dan TLR mouse-9 (id PDB: 3WPF) dipilih sebagai reseptor, dan file PDB terpisah diambil dari Protein DataBank (www .rcsb.org). Model 3D peptida vaksin yang disempurnakan digunakan sebagai ligan untuk semua simulasi docking. Server PatchDock disetel pada parameter default (pengelompokan RMSD: 4.0). Kami selanjutnya menganalisis model docking terbaik menggunakan server Cluspro berdasarkan kemungkinan algoritma rotasi obligasi, dan obligasi dievaluasi menggunakan perangkat lunak PyMOL [61].

Optimasi kodon, prediksi struktur mRNA, dan kloning in silico untuk ekspresi protein vaksin

Optimalisasi kodon diperlukan untuk mencapai ekspresi maksimum gen asing dalam organisme inang ketika penggunaan kodon oleh inang berbeda secara signifikan dari inang asli yang urutan aslinya untuk pembuatan vaksin akhir telah dimusnahkan. JCat (Alat Adaptasi Kodon Java), tersedia untuk umum di (http://www.jcat.de/), digunakan untuk penerjemahan terbalik dan optimasi kodon dengan memberikan urutan utama dari konstruksi vaksin akhir sebagai masukan. Penggunaan kodon dioptimalkan untuk organisme prokariotik yang paling berurutan, E. coli K12 [6]. Tiga opsi tambahan yang disediakan oleh alat ini dipilih untuk menghindari terminator transkripsi rho-independen, situs pengikatan ribosom prokariotik, dan situs pembelahan restriksi yang tidak diinginkan. Indeks adaptasi kodon (CAI) dan konten GC, yang dihitung dengan alat JCat, menunjukkan seberapa baik optimasi tersebut. Optimalisasi yang lebih baik memastikan ekspresi protein vaksin yang lebih tinggi. Selanjutnya, situs restriksi untuk enzim XhoI dan NdeI dimasukkan ke dalam urutan cDNA yang dioptimalkan yang disediakan oleh alat JCat untuk memfasilitasi kloning. Urutan yang dimodifikasi (dengan situs restriksi) kemudian dimasukkan ke dalam vektor plasmid E. coli pET 28-a(+) dengan menggunakan modul kloning restriksi alat SnapGene [6, 31, 62, 63]. Perangkat lunak SnapGene tersedia di web di (https://www.snapgene.com/). Selain itu, kami juga menggunakan server web mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi ng-Form) untuk prediksi struktur sekunder mRNA yang dikodekan oleh gen peptida chimeric. Urutan optimalisasi terjemahan terbalik yang diperoleh dari alat JCat disediakan sebagai masukan. Program mfold didasarkan pada algoritma inti yang memprediksi energi bebas minimum, ∆ G, dan energi bebas minimum untuk lipatan yang mengandung pasangan basa tertentu. Berbagai batasan pelipatan juga diterapkan untuk memprediksi energi pelipatan secara akurat. Energi pelipatan untuk pelipatan RNA ditetapkan pada 37 derajat, sedangkan kondisi ionik ditetapkan pada [Na+]=1 M dan [Mg++]=0 [64].

Simulasi imun berbasis C‑immsim

C-immsim (https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/index.php?page=1) adalah alat prediksi respons imun berbasis server yang memanfaatkan kelas berbasis agen, dan prediksinya bergantung pada jaringan saraf. Ini dapat memprediksi respons imun humoral dan seluler. C-immsim menggunakan model Celda Seiden, model kisi poliklonal bit-string, dan indeks Simpson untuk mengkarakterisasi prediksi sel aktif, istirahat, dan memori serta umur panjangnya. Ini membantu untuk memprediksi profil sitokin dari reaksi tertentu untuk mengevaluasi respon inflamasi [65].

Bubuk ekstrak Cistanche

Simulasi dinamika molekul

Simulasi dinamika molekuler dilakukan untuk mengevaluasi stabilitas kompleks terbaik kami, yaitu TLR, dengan vaksin yang diusulkan menggunakan server iMOD (iMod Server home page (csic.es). Server berbasis web ini menggunakan peningkatan analisis mode normal (NMA) untuk karakterisasi berbagai sifat dinamis biomolekul, seperti fleksibilitas dan stabilitas protein, melalui medan gaya intra-atom.Dalam penelitian ini, kami menganalisis deformitas rantai utama, faktor B, nilai eigen, faktor kovarians, dan model jaringan elastis sebagai parameter NMA standar untuk evaluasi kompleks protein-protein yang diperoleh dengan pendekatan in silico [66-69].

Hasil

Seleksi dan pengambilan rangkaian protein antigenik Leishmania

The amino acid sequences of twelve Leishmania proteins were retrieved from the Uniprot database in FASTA format and subjected to further analysis for the purpose of designing a multi-subunit peptide vaccine against leishmaniasis. These proteins were selected based on previous studies that reported them as potential vaccine candidates as evaluated in experimental animal models or in silico prediction tools. Antigenicity analysis by the ANTIGENpro server showed all the chosen proteins as potential antigens with varying degrees of antigenicity, keeping with the information obtained from literature mining. However, ten among the twelve proteins were presented with relatively higher prediction scores (>0.51), mencerminkan potensinya yang lebih tinggi untuk desain vaksin (Tabel 1). Protein dibedakan menjadi sekretori dan non-sekretori berdasarkan prediksi situs pembelahan peptida sinyal oleh server SignalP 1.4. Dua dari protein Leishmania terpilih yaitu. L. mexicana cysteine ​​proteinase A (Uniprot id: P25775) dan L. amazoensis permukaan glikoprotein GP-46/M2 (Uniprot id: P21978) ditemukan mengandung peptida sinyal dan, karenanya, diprediksi sebagai protein sekretorik. Sepuluh antigen Leishmania lainnya tidak ditemukan memiliki sinyal peptida yang menunjukkan sifat non-sekretorinya. Analisis lokalisasi memperkirakan bahwa protein sistein proteinase A dari L. mexicana (Uniprot id: P25775) akan terlokalisasi dalam lisosom/vakuola, protein leishmanolysin C1 dan proteofosfoglikan dari L. mexicana (Uniprot id: P43150 dan Q9TW13, masing-masing) menjadi protein membran , KURANGNYA antigen pelindung L. donovani (Uniprot id: Q9BIJ5) berada di dalam nukleus dan kejutan panas 70 protein terkait 1 L. mayor (Uniprot id: P12076) terlokalisasi di mitokondria. Semua protein lainnya diprediksi sebagai sitoplasma (Tabel 1). Selain itu, rangkaian asam amino rantai alfa IL-12 manusia juga diperoleh dari database Uniprot (ID Uniprot: P29459) untuk digunakan sebagai bahan pembantu dalam pembuatan vaksin akhir.

Prediksi epitop CTL dan HTL

Dari semua protein yang diselidiki, sejumlah 59 epitop CTL nonamerik umum diidentifikasi bersama oleh server NetCTL 1.2 dan SYFPEITHI. Masing-masing epitop CTL yang diprediksi diberi skor tertentu yang dihitung oleh server masing-masing. Hanya 26 dari motif 9-mer CTL umum ini yang dipilih karena skornya lebih tinggi (menunjukkan afinitas pengikatan MHC I yang lebih tinggi). Dua puluh enam epitop CTL ini diidentifikasi secara umum oleh kedua server dengan skor kompatibel yang lebih tinggi dimasukkan dalam konstruksi vaksin akhir (tambahan Tabel S1). Demikian pula, alat analisis pengikatan MHCII IEDB memperkirakan epitop HTL 15-mer dari semua protein yang dipilih terhadap sekumpulan tiga alel HLA manusia (HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*01:02 dan HLADRB1* 01:03). Epitop HTL yang diprediksi dengan peringkat penyesuaian terendah untuk masing-masing alel ini didokumentasikan seperti pada Tabel S2 tambahan. Dari kumpulan ini, sejumlah sembilan sekuens dipilih berdasarkan peringkat rendahnya yang disesuaikan (Tabel 2) yang menjadikan epitop HTL ini sebagai pengikat MHC-II paling kuat untuk salah satu dari tiga alel HLA. Epitop HTL yang dipilih selanjutnya dilakukan analisis komputasi lebih lanjut untuk memprediksi kemampuan memproduksi sitokinnya.

Tabel 1 Dua belas peptida antigenik potensial dari spesies Leishmania berbeda telah dieksploitasi untuk pembuatan vaksin dan dipilih berdasarkan skor antigen tinggi seperti yang diprediksi oleh server ANTIGENpro

Skrining untuk epitop HTL dengan kemampuan menginduksi sitokin

Kesembilan epitop HTL yang dipilih (Tabel 2) dievaluasi kemampuannya dalam menghasilkan interferon dengan menggunakan server IFNepitope. Server memperkirakan (IFN- vs. nonIFN, menggunakan SVM dan analisis hibrid berbasis motif) hanya tiga peptida seperti FRRLYKTLGQLVYKK dari protein batang parafagellar 2C dari L. mayor, DNGAYLGMEPSSVAA dari proteofosfoglikan L. mexicana, dan RLHFFMMGFAPLTSR dari rantai beta tubulin dari L. mexicana sebagai "positif" dengan skor kurang dari 1.0 (Tabel 3). Ketiga peptida ini diperiksa lebih lanjut untuk kemampuan memproduksi IL-4 dan IL-10-menggunakan server IL4pred dan server IL10pred. Kedua server menggunakan pengklasifikasi SVM dan mempertimbangkan berbagai parameter masukan SVM seperti komposisi asam amino, komposisi dipeptida, kecenderungan asam amino, dan sifat fisikokimia untuk prediksi [32, 33]. Server masing-masing memperkirakan bahwa ketiga epitop penghasil 15-mer IFN- -ini juga merupakan penginduksi untuk IL-4 dan IL-10 (Tambahan Tabel S3). Oleh karena itu, ketiga epitop HTL 15-mer HTL yang mengikat MHC-II ini akhirnya dipilih untuk pembuatan vaksin mengingat kemampuannya dalam menghasilkan produksi sitokin IFN-, IL-4, dan IL{{24 }} sehingga memediasi respons imun yang meningkat.

Analisis konservasi epitop

Modul IEDB "konservasi lintas antigen" yang tersedia dalam server IEDB digunakan untuk mengetahui tingkat konservasi epitop CTL dan HTL terpilih yang akan dimasukkan dalam pembuatan vaksin akhir. Masing-masing dari dua puluh enam epitop CTL dan tiga epitop HTL disaring secara individual terhadap serangkaian rangkaian protein homolog tertentu yang diperoleh oleh Uniprot BLAST. Hasil BLAST menunjukkan tingkat konservasi yang tinggi dari protein terpilih pada berbagai spesies Leishmania dan juga pada protozoa parasit terkait lainnya, kebanyakan Trypanosoma. Semua epitop HTL ditemukan sangat terkonservasi (100%) di seluruh rangkaian protein Leishmania terkait yang digunakan dalam analisis, sementara rentang konservasi untuk epitop CTL terpilih bervariasi dari 0 hingga 100% (Tabel Tambahan S4). Penggabungan epitop CTL dan HTL yang dilestarikan dalam pembuatan vaksin akhir akan memastikan imunitas silang spektrum luas terhadap berbagai spesies Leishmania patogen yang umumnya menginfeksi manusia.

Tabel 2 Rincian epitop HTL terpilih (15 mer) dengan protein sumbernya, alel pengikat yang sesuai, dan peringkat yang disesuaikan yang diprediksi oleh alat pengikat IEDB MHC-II

Tabel 3 Server IFNepitope memperkirakan epitop penginduksi MHC II yang mampu memproduksi interferon

Pembuatan rangkaian vaksin multi-epitop

Urutan utama vaksin peptida multi-subunit dibuat dengan menggabungkan urutan dua puluh enam epitop CTL dan tiga epitop HTL yang dipilih berdasarkan antigenisitasnya, afinitas pengikatan MHC, dan kemampuan penginduksi sitokin. Masing-masing epitop CTL dan HTL digabungkan dengan menggunakan penghubung AAY dan GPGPG, dan panjang keseluruhan peptida vaksin yang dihasilkan adalah 369 asam amino. Bahan pembantu, 219 asam amino rantai alfa panjang IL-12 manusia (Uniprot id: P29459), ditambahkan ke terminal N dari peptida yang dirancang oleh EAAK linker. Penambahan IL-12 sebagai bahan pembantu alami diharapkan dapat meningkatkan efektivitas vaksin dengan mempercepat respon imun, sebagaimana telah divalidasi dalam penelitian pada hewan [3, 37]. Selain itu, tag 6XHis juga ditambahkan ke terminal C peptida untuk memfasilitasi identifikasi dan pemurnian protein setelah produksinya dengan teknologi DNA rekombinan. Setelah penambahan linker, adjuvant, dan tag histidin, panjang peptida vaksin akhir ditemukan 598 residu asam amino (Gbr. 1).

Prediksi epitop sel B linier, kontinu, dan terputus-putus

Kehadiran determinan antigenik dalam urutan primer vaksin yang dirancang diidentifikasi dengan menggunakan dua server berbeda, yaitu ABCpred dan BepiPred 2.0, untuk prediksi yang lebih efektif. Server ABCpred memprediksi epitop sel B dengan menggunakan jaringan saraf berulang yang terlatih dan mewakili urutan kandidat sebagai 16-mer peptida yang diberi peringkat berdasarkan skor pengikatannya (Tambahan Tabel S5). Skor peptida yang lebih tinggi berarti kemungkinan menjadi epitop yang lebih tinggi. Peptida vaksin yang dirancang ternyata memiliki tujuh peptida 16-mer yang tidak tumpang tindih dengan skor prediksi sebesar 0.90 dan lebih tinggi pada nilai ambang batas default sebesar 0.51 , mencerminkan potensinya yang sangat tinggi untuk mengikat dan menstimulasi sel B. Server lainnya, BepiPred 2.0, memprediksi probabilitas setiap residu asam amino dalam urutan masukan untuk menjadi bagian dari epitop sel B dan menggambarkan keluaran sebagai ilustrasi dengan gradasi warna oranye yang menunjukkan derajat kemungkinan. Residu yang diprediksi milik epitop sel B ditandai sebagai "E." Server mengidentifikasi sejumlah besar residu sebagai epitop sel B linier dengan probabilitas tinggi dalam rentang residu 380–53{{20}} posisi peptida (Gbr. 2) ketika ambang batas epitop ditetapkan pada 0,5 (default). Dengan demikian, identifikasi faktor penentu antigenik untuk reseptor sel B oleh dua server independen membuktikan fakta bahwa peptida, ketika diberikan sebagai vaksin, akan mampu merangsang produksi antibodi oleh sel B untuk melindungi individu dari infeksi Leishmania. Ellipro suit (tersedia dalam portal IEDB) memperkirakan total 323 residu asam amino yang terletak di delapan epitop sel B yang terputus-putus dalam struktur tersier vaksin peptida yang disempurnakan, dengan skor berkisar antara 00,509 hingga 0,802. Diantaranya, epitop konformasi terbesar mengandung 107 residu asam amino dengan skor prediksi 0,772. Parameter default server digunakan untuk analisis. Ellipro juga memperkirakan dua belas epitop sel B linier dengan jumlah total 324 residu dalam rentang skor 0,535-0,885 (Tabel Tambahan S6 dan gambar tambahan M1).

Profil antigenisitas, alergenisitas, dan toksisitas dari konstruksi vaksin

Antigenisitas rangkaian vaksin akhir (dengan bahan pembantu) dievaluasi oleh server ANTIGENpro dan VaxiJen 2.0. Server ANTIGENpro memperkirakan hal yang sama sebagai antigen yang mungkin dengan skor antigenisitas 0.745396. Server VaxiJen 2.0 mengevaluasi peptida vaksin sebagai kemungkinan antigen dengan skor 0.5325 pada ambang batas {{10}}.5 ketika organisme target terpilih menjadi parasit (Tabel 4). Namun, ketika urutan vaksin asli tanpa bahan pembantu dianalisis oleh VaxiJen 2.0, urutan tersebut juga diprediksi sebagai kemungkinan antigen dengan skor 00,5768 pada model parasit. Skor prediksi ANTIGENpro untuk sequence aslinya adalah 0.714582. Oleh karena itu, kedua urutan vaksin yang dibuat (dengan dan tanpa bahan pembantu) ditemukan bersifat antigenik, mendukung fakta bahwa komponen peptida vaksin itu sendiri bersifat antigenik, bahkan tanpa adanya bahan pembantu tambahan (Tabel 4). Dalam hal alergenisitas, urutan vaksin akhir ditemukan non-alergen oleh AlgPred dengan skor prediksi sebesar 0.4018 pada ambang batas 0.4. Selain itu, urutan protein tidak ditemukan mengandung epitop IgE yang terbukti secara eksperimental, dan tidak ditemukan hasil BLAST untuk peptida yang mewakili alergen (ARP), yang menunjukkan sifat non-alergen dari vaksin tersebut. Server AllerTOP v.2.0 juga mendefinisikan protein tersebut sebagai kemungkinan non-alergen. Analisis toksisitas oleh server ToxinPred memperkirakan peptida tersebut tidak beracun ketika pendekatan berbasis SVM (TrEMBL)+ berbasis motif diadopsi pada ambang batas SVM 0,1, dan batas nilai E untuk berbasis motif ditetapkan pada 10,0. Oleh karena itu, urutan vaksin yang dihasilkan diperkirakan memiliki kemungkinan antigen, non-alergen, dan tidak beracun, yang semuanya merupakan kriteria penting untuk vaksin peptida multi-subunit yang ideal.

Gambar 1 Penggambaran skema vaksin peptida multi-epitop yang dirancang mengandung total 598 rangkaian asam amino yang mewakili kemungkinan pembuatan vaksin dengan bahan pembantu alami terminal N (hijau) yang dihubungkan dengan EAAK (ungu) dengan 26 CTL (oranye) menggunakan tautan AAY (biru) , dan 3HTL (kuning) terhubung dengan linker GPGPG (merah). Itu diakhiri dengan 6-Tagnya di terminal C untuk tujuan pemurnian

Gambar 2 Epitop sel B diprediksi oleh server Bepipred 2.0. Peregangan pada titik berbeda dari 1 hingga 590 rangkaian asam amino diprediksi dengan epitop potensial di atas tingkat ambang batas default. Baris pertama yang diberi tanda E menunjukkan prediksi lokasi epitop

Evaluasi parameter fisikokimia

Parameter fisikokimia dari konstruksi vaksin akhir dihitung oleh server Protparam berdasarkan residu asam amino yang ada dalam urutan yang diberikan. Berat molekul (MW) peptida yang dirancang dihitung sebesar 65,68 kDa sehingga cocok untuk menginduksi respons imunogenik. PI teoretis (titik isoelektrik) dihitung sebesar 5,98, yang menunjukkan bahwa peptida bersifat sedikit asam. Jumlah residu bermuatan positif dan negatif dalam peptida masing-masing adalah 48 dan 55. Waktu paruh dihitung sebagai 30 jam pada retikulosit mamalia in vitro, lebih dari 20 jam pada ragi, dan lebih dari 10 jam pada E. coli in vivo. Persistensi protein selama 30 jam dalam sel mamalia (termasuk manusia) sudah cukup untuk menimbulkan respons imun yang diinginkan karena mekanisme tersebut memerlukan pemrosesan dan penyajian protein oleh sel imun. Indeks alifatik (volume relatif yang ditempati oleh rantai samping alifatik) diperkirakan sebesar 78,34, menunjukkan bahwa protein bersifat termostabil karena indeks alifatik dapat dianggap sebagai faktor positif yang berkontribusi terhadap peningkatan termostabilitas protein globular. Indeks ketidakstabilan dihitung menjadi 47,10. Nilai prediksi grand average of hydropathy (GRAVY) dari konstruksi vaksin diperkirakan sebesar −0,140; nilai negatif mendefinisikannya sebagai bersifat hidrofilik dan akan berinteraksi dengan molekul air [28, 70–72]. Sebagai kesimpulan, analisis imunoinformatik memperkirakan konstruksi peptida yang dirancang bersifat antigenik, termostabil, persisten dalam sel mamalia, dan hidrofilik. Semua faktor ini berdampak pada efektivitas konstruksi sebagai kandidat vaksin.

Prediksi struktur sekunder

Prediksi struktur sekunder untuk 592 residu peptida chimeric panjang oleh server PSIPRED mengungkapkan keberadaan 45,77% alpha helix, 4,89% beta-sheet, dan 49,32% koil, seperti yang digambarkan pada Gambar 3 berikut. Selain itu, struktur RaptorX server prediksi menganalisis aksesibilitas pelarut yang relevan untuk peptida di mana 36% residu diperkirakan akan terekspos, 28% diperkirakan terkubur dalam medium, dan 35% residu diperkirakan terkubur, menunjukkan bahwa protein tersebut akan memiliki kontak yang adil secara keseluruhan. dengan air (pelarut). Hanya 32 residu (5% dari peptida) yang diperkirakan berada dalam domain protein yang tidak teratur oleh server RaptorX.

Prediksi struktur tersier

I-TASSER web server was utilized for the prediction of the 3-D structure of the designed vaccine. The server predicted five models for the said peptide on the basis of multiple threading alignments using ten different templates, among which the template with PDB id 7e2cl showed the best alignment with an TM score of 0.931 and an RMSD value of 2.75. The top-ranked model exhibiting the highest confidence score (C-score) of−1.11 and an estimated RMSD of 10.3±4.6 Å (Fig. 4a) was selected for further refinement. A higher C-score indicates a higher level of confidence with which the server predicts the tertiary structure of the target protein based on the predictions obtained from modeling simulations [46, 66]. The C-score has a strong correlation with the overall quality of the tertiary structure, and it has been used widely for quantitative estimation of the RMSD and TM scores of predicted models in comparison with the native models; further, the estimated TM score of the chosen model was found to be 0.58±0.14 which is another strong indicator of good modeling strategy since a TM score of>0.5 menunjukkan model dengan lipatan yang benar. Skor TM adalah parameter independen panjang urutan untuk mengukur kesamaan struktural model yang diprediksi dengan protein identik lainnya dalam keluarga lipatan SCOP/CATH yang sama (47).

Tabel 4 Hasil antigenisitas dihitung dari server ANTIGENpro dan server Vaxijen2.0 dengan dan tanpa antigen

Gambar 3 Prediksi struktur sekunder terhadap urutan vaksin linier oleh server PSIPRED

Gambar 4 Prediksi dan penyempurnaan struktur tersier 3-Pemodelan struktur vaksin seperti yang diprediksi oleh server I-TASSER. b Penyempurnaan model 3-D mentah oleh server GalaxyRefne

Penyempurnaan dan validasi model vaksin 3‑D

Model tersier "kasar" untuk vaksin peptida disempurnakan secara sub-berurutan dengan memprosesnya melalui server GalaxyReone. GalaxyRefne menghasilkan lima model, dimana model 1 ditemukan sebagai yang terbaik setelah evaluasi dan perbandingan parameter terkait seperti GDT-HA (0.8826); RMSD (0.608); MolProbity (2.398); skor bentrokan (21.1); rotamer yang buruk (0.6); dan wilayah yang disukai Rama (88,8) dengan model lainnya (Gbr. 4b). Plot Ramachandran yang dihasilkan oleh server MolProbity menunjukkan bahwa model 3-D yang disempurnakan memiliki 88,8% residu di wilayah yang disukai, 98,6% residu di wilayah yang diizinkan, dan hanya 00,013% outlier. Sebaliknya, model kasar awal ditemukan memiliki residu masing-masing sebesar 77,1%, 94,2%, dan 0,057% di wilayah yang disukai, diperbolehkan, dan outlier. Hasil ini dengan jelas menyimpulkan bahwa kualitas model tersier yang disempurnakan telah meningkat secara signifikan. Server ERRATA juga dieksploitasi untuk validasi tambahan pada model yang disempurnakan. Server ERRATA menganalisis model dengan faktor kualitas keseluruhan sebesar 43,542, yang sebenarnya mewakili persentase model protein masukan yang berada di bawah batas penolakan 95%. Oleh karena itu, kami berhasil memperoleh struktur tersier yang cukup disempurnakan dan divalidasi untuk pembuatan vaksin. Struktur tersier vaksin yang disempurnakan, bersama dengan plot yang diperoleh dari server MolProbity dan server ERRAT, ditunjukkan pada Gambar. 5. Server web ProSA telah menunjukkan skor Z sebesar−1,08 (gambar tambahan M2), yang mana negatif Nilai ini menunjukkan bahwa model tersebut berada di luar kisaran skor protein serupa dengan ukuran sebanding yang strukturnya telah ditentukan oleh difraksi sinar-X atau NMR [51].

Rekayasa disulfida dari peptida vaksin

Server Disulfide by Design 2.12 mengembalikan 45 pasang residu asam amino yang kemungkinan merupakan lokasi pembentukan ikatan disulfida. Kami telah mengidentifikasi empat kandidat pasangan residu paling penting yang mungkin terletak di wilayah loop fleksibel protein vaksin berdasarkan energi ikatan tinggi dan nilai Chi3 (Tambahan Tabel S7). Residu ini, THR58-PHE61 (chi3:+126.18), LEU216-ALA234 (chi3:+125.92), THR323-GLU359 (chi3 :+121.54), dan TYR472-ARG504 (chi3: + 125.75), digantikan dengan sistein dalam model tersier yang disempurnakan dari protein vaksin akhir, sehingga meningkatkan stabilitas termal peptida (Gbr. 6). Namun keakuratan faktor B terbatas pada pelemahan hamburan neutron atau sinar-X oleh gerakan termal molekul dalam kristalografi protein. Oleh karena itu, kami secara ketat memilih nilai energi ikatan dan Chi3 yang tinggi dibandingkan faktor B untuk model vaksin olahan berbantuan komputer ini [73, 74].

Analisis interaksi docking peptida vaksin dengan TLR

Interaksi peptida chimeric dengan reseptor imun (TLR manusia{{0}}, 4, 5, 8 dan TLR tikus-9) dipelajari dengan melakukan analisis docking menggunakan server PatchDock tempat pengikatan dilakukan. afinitas vaksin (ligan) dengan berbagai TLR (reseptor) dievaluasi. Sepuluh model teratas yang dihasilkan oleh PatchDock untuk setiap docking dipertimbangkan, di antaranya model dengan peringkat terbaik dengan skor docking tertinggi dipilih untuk setiap kasus. Skor tersebut mewakili bentuk dan sifat komplemen elektrostatis antara reseptor dan ligan. Komplementaritas terbaik ditemukan pada kasus TLR-2 manusia (ID PDB: 6NIG) dengan skor 18.714, luas permukaan 3963,10, dan energi kontak atom (ACE) 217,99 (Gbr. 7a) . Vaksin ini juga menunjukkan pengikatan yang efisien dengan TLR-5 (ID PDB: 3J0A) dan TLR-9 (id PDB: 3WPF) dengan skor docking sebesar 18.258; luas permukaan 2879,80 dan ACE −666,94 dan skor docking 18,164; dan luas permukaan masing-masing 4090,70 dan ACE 495,74. Docking dengan TLR lain menunjukkan afinitas pengikatan yang lebih lemah sebagaimana tercermin dari skor docking yang lebih rendah yang dihasilkan oleh PatchDock, 16.708 untuk TLR-4 (ID PDB: 4G8A), dan 17.800 untuk TLR-8 (ID PDB: 4QC0). Oleh karena itu, konstruksi vaksin kami mampu berikatan dengan reseptor imun berbeda dengan afinitas pengikatan yang berbeda-beda. Hal ini sangat diperlukan untuk mendapatkan vaksin yang efektif dalam hal meningkatkan kekebalan yang tepat dan tinggi untuk mencegah infeksi Leishmania. Selanjutnya, alat web FireDock digunakan untuk menyempurnakan dan menilai ulang kompleks terbaik (kompleks vaksin TLR-2), yang menyempurnakannya dengan energi global minimum−19,01, asosiasi Van Der Waals (−25,74), kontak atom energi (−0,03), dan energi bebas pengikatan (−24,26). Hasil ini menguatkan fakta bahwa peptida vaksin berinteraksi paling efisien dengan TLR manusia-2 dan, dengan demikian, membentuk kompleks yang cukup stabil yang mungkin menghasilkan respons imun yang nyata terhadap parasit Leishmania. Selain itu, kami menyelidiki lebih lanjut docking antara TLR-2 dan vaksin; menggunakan server web Cluspro, model teratas (Gbr. 7b) dipilih berdasarkan FFT rotasi 5D dan CAPRI (penilaian kritis terhadap prediksi interaksi) dengan skor tertimbang seimbang−1192,5 yang memiliki ukuran cluster terbesar yaitu 42 anggota. Tabel 5 berisi daftar 10 residu asam amino yang berinteraksi dari Gambar 7b yang membentuk kompleks reseptor-ligan yang stabil.

Gambar 5 plot Ramachandran untuk model GalaxyRefne. b Server ERRAT memperkirakan penilaian kualitas struktur protein

Gambar 6 Disulfida menurut desain 2.0 memperkirakan empat (dilambangkan dengan panah) potensi pembentukan ikatan disulfida untuk meningkatkan stabilitas termal konstruksi vaksin akhir

Optimalisasi kodon dan kloning in silico untuk ekspresi protein vaksin

Dalam upaya mengatasi masalah bias kodon, alat JCat digunakan untuk optimasi kodon yang mengembalikan masukan rangkaian asam amino peptida vaksin dalam bentuk rangkaian cDNA yang diterjemahkan secara terbalik dengan nilai CAI yang dioptimalkan sebesar 1. Nilai ini terletak dalam rentang nilai CAI yang diterima sebesar 0.8–1.0 [28], memastikan tingkat ekspresi gen yang tinggi pada organisme inang, E. coli K12. Semakin tinggi nilai CAI maka semakin baik pula tingkat ekspresi gen asing tersebut. Selain itu, kandungan GC dari rangkaian yang ditingkatkan ditemukan sebesar 51,85%, menunjukkan optimasi kodon yang baik. Untuk ekspresi gen yang lebih baik, diperlukan konten GC 35-70% (63). Situs restriksi untuk enzim XhoI dan NdeI dibuat pada ujung 5/ dan 3/ dari rangkaian, diikuti dengan penyisipan rangkaian yang dimodifikasi ke dalam vektor pET28 a(+). Sisipan yang dikloning, diwakili dalam warna merah, terletak di antara situs pembatasan yang ditentukan dalam vektor. Bentangan enam residu histidin juga terletak di kedua ujung rangkaian kloning untuk memfasilitasi proses pemurnian setelah produksi protein vaksin rekombinan [6, 31]. Ukuran konstruksi vektor plasmid akhir dengan fragmen gen yang disisipkan adalah sekitar 7 kb (Gbr. 8). Server web mfold memperkirakan jumlah total lima puluh konformasi lipatan mRNA, di antaranya struktur teratas dipilih karena skor energi terendahnya (ΔG= −492.50). Konformasi terlipat khusus ini diperkirakan mengandung satu loop eksternal dan empat tumpukan dengan energi bebas minimum yang menunjukkan kestabilan konformasi. Lingkaran tersebut dibentuk dengan 21 basa beruntai tunggal dan dua heliks penutup. Plot titik energi menghitung energi optimal (δG) menjadi 494,4 kkal/mol. Titik-titik berwarna berbeda di lapangan mengacu pada tingkat energi berbeda dari pasangan basa tertentu yang ada dalam mRNA dengan mempertimbangkan δG yang dihitung oleh server [64]. Menurut plotnya, energi bebas dari sebagian besar pasangan basa berada dalam kisaran −487.5<δg <="−485.8" kcal/mol="" range="" (supplementary="" image="" m3).="" conclusively,="" a="" thermodynamically="" favored="" and="" energetically="" stable="" secondary="" structure="" of="" the="" mrna="" was="" predicted="" (supplementary="" image="" m4).="" all="" the="" folding="" constraints="" were="" set="" at="" their="" default="" values,="" and="" the="" rna="" was="" considered="" to="" be="" linear="" in="">

Tabel 5 PyMOL menghasilkan sepuluh residu asam amino yang berinteraksi dari reseptor dan ligan dari Gambar 7b, dan angka di () menunjukkan posisi masing-masing asam amino dalam reseptor dan ligan

Simulasi kekebalan tubuh

Simulasi imun silico menggunakan server web C-immsim memperkirakan jumlah antigen mencapai hingga 6,9× 105 /ml dalam waktu 2 hari sejak dosis awal penyuntikan, dan tingkat antigen turun menjadi 0 pada hari keempat dan seterusnya. Peningkatan jumlah antigen ini berkorelasi dengan peningkatan yang luar biasa dalam konsentrasi tingkat IgM IgG dan tingkat IgM saja selama periode awal infeksi dan mencapai tingkat puncak kira-kira dalam waktu 12 hari dari siklus infeksi dalam skala yang berubah-ubah. Subtipe lain dari tingkat IgG1+IgG2 dan IgG1 meningkat secara nyata sebagai akibat dari respon imun sekunder (Gbr. 9a). Profil sitokin menunjukkan mediator inflamasi seperti INF yang mencapai tingkat hingga 4×106 ng/ml pada hari ke-12, sementara tingkat sitokin lainnya masih cukup rendah (Gambar 9b). Respon imunologi yang diperantarai sel ditunjukkan dengan adanya peningkatan limfosit T sitotoksik aktif dan istirahat setelah 2-3 hari setelah injeksi awal, dan adanya sel T pembantu memori proliferatif juga menonjol (Gambar 9c dan d). Total populasi sel B juga meningkat dalam 2-3 hari, seiring dengan pembentukan sel B memori setelah 1 minggu pemberian dosis primer (Gambar 9e).

Gambar 8 Sistem ekspresi vaksin Leishmania menggunakan vektor pET28 a(+), daerah berwarna merah menunjukkan sisipan rangkaian asam nukleat vaksin yang diapit oleh situs restriksi NdeI dan XhoI

Interpretasi simulasi dinamika molekuler

Skor docking terbaik yang dicapai oleh kompleks vaksin TLR2-dianalisis lebih lanjut dengan simulasi dinamika molekuler yang dibantu NMA. Deformabilitas rantai utama diwakili oleh engsel yang tinggi (Gbr. 10a), yang berarti deformabilitas tinggi. Faktor B (Gambar 10b) dihitung dengan NMA, yang menandakan fleksibilitas protein berdasarkan parameter perpindahan atom [73]. Nilai eigen (Gbr. 10c) menggambarkan energi yang dibutuhkan untuk merusak struktur. Kompleks vaksin TLR-2 menunjukkan nilai eigen sekitar 7,778× 10−7. Varians (Gbr. 10d) berbanding terbalik dengan nilai eigen. Matriks kovarians (Gbr. 10e) menggambarkan apakah pasangan residu berkorelasi (merah), tidak berkorelasi (putih), atau anti-berkorelasi (biru). Model jaringan elastis (Gbr. 10f) menghitung pegas antara pasangan atom yang bersesuaian, titik-titik pada grafik diwakili oleh gradien warna yang menunjukkan kekakuan atau fleksibilitas pegas, dan warna yang lebih gelap mencerminkan pegas yang lebih kaku. Dengan demikian, hasil simulasi dinamika molekuler menunjukkan bahwa vaksin peptida yang kami usulkan stabil.

Diskusi

Leishmaniasis dianggap sebagai salah satu penyakit tropis yang paling terabaikan dan terutama menyerang masyarakat yang tinggal di daerah miskin di negara-negara berkembang, termasuk India [2]. Menurut laporan WHO, India merupakan negara endemis kedua jenis penyakit ini, CL dan VL. CL yang disebabkan oleh L. tropica dan L. mayor terjadi di negara bagian barat laut India, Punjab, dan Rajasthan menjadi fokusnya (https://www.who.int/leishmaniasis/ beban/Leishmaniasis_India/en/ ). Selain itu, dengan meningkatnya epidemi human immunodeficiency virus (HIV) di seluruh dunia, leishmaniasis telah muncul sebagai patogen oportunistik yang muncul kembali pada pasien AIDS sehingga menjadikan situasi ini semakin mengerikan [22, 38]. Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk merancang vaksin umum polivalen baru untuk leishmaniasis yang mungkin memberikan perlindungan heterolog dari spesies parasit patogen umum. Kami memilih dua belas protein spesifik Leishmania yang mencakup lima strain parasit patogen yang menyebabkan infeksi VL dan CL pada manusia. Protein ini telah dinilai perannya dalam virulensi dan imunogenisitas serta potensinya sebagai kandidat vaksin dalam berbagai penelitian imunologi[1, 8–10, 75]. Oleh karena itu, konstruksi vaksin yang dirancang secara silico dengan menggabungkan protein imunogenik yang berkarakter baik dan sangat terkonservasi dari spesies patogen Leishmania yang berbeda mungkin memberikan kekebalan silang terhadap semua bentuk leishmaniasis pada manusia (terutama VL dan CL) dan, oleh karena itu, dapat digunakan untuk program vaksinasi umum untuk mencegah infeksi Leishmania pada manusia. Protein yang dipilih terutama disaring untuk mengetahui keberadaan epitop CTL dan HTL potensial. Deteksi epitop sel T penting karena sel T hanya dapat mengenali antigen jika diproses melalui jalur endogen atau eksogen, dikomplekskan dengan molekul MHC kelas I atau MHC kelas II, dan kemudian dipresentasikan ke reseptor sel T oleh sel penyaji antigen (antigen-presenting cell). APC). MHC-I khusus untuk CD8+CTL, sedangkan MHC-II berikatan khusus pada reseptor CD4+HTL. Identifikasi epitop CTL dilakukan secara ketat dengan menggunakan dua server independen secara bersamaan. Hanya epitop yang diprediksi oleh kedua server dengan afinitas pengikatan MHC yang jauh lebih tinggi yang akhirnya dimasukkan ke dalam peptida vaksin. Epitop HTL yang teridentifikasi dievaluasi lebih lanjut untuk kemampuannya menginduksi sitokin dengan memanfaatkan tiga server web. Bahan-bahan yang dapat merangsang produksi berbagai macam sitokin, yaitu IFN-, IL{{20}}, dan IL-10, dipilih untuk merancang vaksin peptida chimeric untuk memastikan bahwa itu akan memicu produksi semua sitokin spesifik parasit di inang. Hal ini sangat penting karena Kedzierski dan rekannya telah mengusulkan bahwa sekresi IL-10 sama pentingnya dengan sekresi IFN- untuk menentukan apakah suatu vaksin dapat menimbulkan respon imun protektif dan bahwa imunitas yang tepat tidak diinduksi jika IL -10 levelnya tidak meningkat secara proporsional [8, 75]. Epitop CTL dan HTL eksklusif selanjutnya digabungkan dengan menggunakan penghubung AAY dan GPGPG untuk membuat peptida chimeric. Tautan AAY dan GPGPG sebelumnya telah dilaporkan berguna untuk desain vaksin multi-epitop karena memungkinkan imunogenisitas fungsional yang minimal dan memfasilitasi pemrosesan dan penyajian epitop terpilih oleh MHC-II [6, 28, 71]. Rantai alfa adjuvan IL-12 manusia dihubungkan ke terminal N dari peptida yang dihasilkan melalui penghubung EAAK. IL-12 dipilih sebagai bahan pembantu karena merupakan salah satu bahan pembantu yang paling efektif untuk vaksin Leishmania pada model hewan, seperti yang didokumentasikan dalam penelitian imunogenik sebelumnya [3, 37, 71]. Karena vaksin ini ditujukan untuk pemberian pada manusia, penggunaan IL-12 manusia sebagai bahan pembantu alami dan bukan agonis TLR sintetik diharapkan dapat meningkatkan kekebalan tanpa menimbulkan efek samping yang merugikan. Peran IL-12 sebagai adjuvan umum untuk vaksin juga digarisbawahi karena potensinya dalam meningkatkan respon antibodi vaksin protein dan polisakarida dan menginduksi peradangan lokal yang memadai yang memungkinkan eksudasi IgG yang menyebabkan peningkatan respon imun [72]. Linker EAAK ditambahkan untuk mencapai tingkat ekspresi yang lebih tinggi dan untuk meningkatkan fungsi biologis peptida fusi dengan membatasi interaksi antar domain vaksin [76, 77]. Analisis imunoinformatik menunjukkan bahwa konstruksi vaksin kami memiliki banyak epitop sel B linier yang sangat diinginkan untuk vaksin yang dibuat untuk penggunaan imunoprofilaksis. Sekali lagi, kami menggunakan dua alat berbeda untuk prediksi yang lebih akurat. Kedua server memperkirakan epitop sel B yang cukup dalam rangkaian vaksin. Vaksin yang dirancang diperkirakan tidak menyebabkan alergi, tidak beracun, dan cukup imunogenik untuk memicu reaksi kekebalan yang tepat. Analisis fisikokimia selanjutnya menunjukkan bahwa peptida vaksin bersifat sedikit asam (pI 5,98) dengan indeks alifatik yang jauh lebih tinggi (78,34), menunjukkan sifat termostabilnya. Nilai GRAVY negatif (−0,14) menunjukkan bahwa peptida tersebut bersifat hidrofilik, yang selanjutnya berkontribusi terhadap potensinya sebagai vaksin. Elemen struktur sekunder vaksin ditentukan oleh server PSIPRED v 4.0, yang merupakan salah satu metode komputasi paling akurat dan banyak digunakan untuk prediksi struktur sekunder protein. Selain itu, struktur 3D untuk peptida yang dirancang juga diprediksi menggunakan server I-TASSER yang memberikan informasi rinci tentang koordinat residu penting protein, yang sangat penting untuk mempelajari dinamika, bioaktivitas, dan interaksi vaksin. dengan ligan lain. Struktur tersier awal disempurnakan dan divalidasi dengan menggunakan alat validasi struktur protein untuk menemukan dan memperbaiki potensi kesalahan pada rantai samping atau tulang punggung model yang diprediksi. Analisis plot Ramachandran menunjukkan bahwa lebih dari 90% residu model yang disempurnakan berada dalam wilayah yang diizinkan dengan persentase outlier yang kecil, sedangkan server ERRAT menunjukkan faktor kualitas sebesar 43,542 yang semuanya berimplikasi pada kualitas model yang memuaskan. Model 3D yang divalidasi ditemukan memiliki jumlah epitop sel B konformasi yang memadai oleh server ElliPro, yang menyiratkan bahwa model tersebut mungkin menghasilkan respons sel B yang diinginkan dan merangsang produksi antibodi spesifik pada inang. Aktivasi sel B juga penting dalam memori imunologis dan bertanggung jawab atas kekebalan jangka panjang pada individu yang divaksinasi. Interaksi vaksin dengan reseptor imun (TLR) juga dievaluasi dengan melakukan analisis docking. Peptida vaksin ditemukan memiliki afinitas tertinggi terhadap TLR-2, diikuti oleh TLR-5, meskipun ia mampu berikatan dengan TLR lain pada tingkat yang lebih rendah. Interaksi dengan TLR sangat penting untuk menghasilkan kekebalan protektif karena penelitian sebelumnya yang melibatkan model hewan mendokumentasikan bahwa spesies Leishmania yang berbeda atau komponen antigeniknya berinteraksi dengan berbagai TLR yang menyebabkan respons imun yang kuat pada inang yang tertantang. Untuk memenuhi persyaratan ekspresi protein vaksin rekombinan yang memuaskan dalam sistem inang E. coli (K12), optimasi kodon dilakukan dengan menerapkan alat JCat yang menyesuaikan konten CAI dan GC dari urutan tersebut, sehingga cocok untuk ekspresi dalam E.coli. Kloning in silico juga dilakukan menggunakan vektor ekspresi berbasis plasmid pET28a(+) untuk menunjukkan kelayakan rangkaian kloning dan ekspresi berlebih untuk mencapai peningkatan produksi protein vaksin rekombinan. Prediksi struktur sekunder mRNA yang dikodekan oleh sekuens gen chimeric dilakukan untuk menunjukkan kestabilan konformasi lipatan mRNA yang akan mempengaruhi efisiensi proses translasi pada inang bakteri. Mutasi penstabil diciptakan dengan menambahkan hubungan disulfida baru pada protein vaksin karena hal ini akan berkontribusi pada kekuatan protein asli, sehingga dapat menerima eksplorasi biokimia, imunologi, dan bioteknologi tambahan.

Gambar 9 Simulasi imun berbasis server C-immsim. a Total antigen dan pembentukan antibodi masing-masing, b profil produksi sitokin, pembentukan sel T helper c dan d dan jumlah limfosit T sitotoksik total (aktif dan istirahat), respon sel e B setelah pemberian vaksin

Gambar 10 Simulasi dinamika molekul. a Deformabilitas rantai utama ditunjukkan oleh engsel, b NMA menghasilkan faktor B yang menunjukkan stabilitas protein, c nilai eigen untuk mendeformasi struktur kompleks docking, d individu (ungu) % varians dan kumulatif (hijau) struktur, e matriks kovarians berkorelasi (merah), tidak berkorelasi (putih) atau anti berkorelasi (biru) antar pasangan atom, model jaringan elastis f menunjukkan pegas yang terhubung antar pasangan atom, abu-abu yang lebih gelap menunjukkan pegas yang kaku dan sebaliknya

manfaat suplemen cistanche-meningkatkan kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami telah mengeksploitasi pendekatan vaksinologi terbalik untuk perancangan in silico dari vaksin peptida multi-subunit polivalen terhadap leishmaniasis manusia (baik visceral maupun kulit) yang mungkin dapat memberikan perlindungan heterolog dari parasit Leishmania umum yang menginfeksi manusia dan, dengan demikian, dapat dianggap bersifat spektrum luas. Hal yang sama dapat digunakan untuk program vaksinasi umum untuk mengendalikan dan memberantas penyakit sebagai strategi pelengkap bersama dengan agen kemoterapi yang tersedia saat ini. Selain itu, kami telah menggunakan IL-12 sebagai bahan pembantu alami, bukan peptida sintetik yang tidak dimanusiakan. Penggunaan IL-12 sebagai adjuvan akan meningkatkan imunogenisitas vaksin tanpa menimbulkan efek samping yang merugikan pada tubuh inang. Asalkan peptida vaksin terdiri dari berbagai peptida yang sangat terkonservasi dan berpotensi imunogenik yang diperoleh dari lima spesies Leishmania patogen, hal ini berguna untuk memperoleh kekebalan silang pada individu yang divaksinasi, sehingga juga memiliki keuntungan terapeutik dan profilaksis. Berbagai analisis imunoinformatika yang ketat menggunakan beberapa alat komputasi telah menemukan bahwa vaksin yang diusulkan bersifat imunogenik, stabil, dan dapat direproduksi sebagai protein rekombinan dan aman untuk uji coba pada manusia. Meskipun demikian, validasi eksperimental masih harus dilakukan untuk menjamin perolehan kekebalan yang protektif dan tahan lama serta menyingkirkan toksisitas.

Referensi

1. De-Brito RCF, Cardoso JMO, Reis LES, Vieira JF, Mathias FAS, Roatt BM, Agiuar-Soares RDDO, Ruiz JC, Resende DM dkk. (2018) Vaksin peptida untuk leishmaniasis. Imunol Depan 9:1043

2. Okwor I, Uzonna J (2016) Beban sosial dan ekonomi leishmaniasis manusia. Am J Trop Med Hyg 94(3):489–493. https://doi. org/10.4269/ajtmh.15-0408

3. Mutiso JM, Macharia JC, Gicheru MMJ (2010) Biomed Res 24(1):16–25. https://doi.org/10.1016/S1674-8301(10)60004-8

4. Gillespie PM, Beaumier CM, Strych U, Hayward T, Hotez PJ, Bottazzi ME (2016) Status penelitian vaksin dan pengembangan vaksin leishmaniasis. Vaksin 34(26):2992–2995. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2015.12.071

5. Joshi S, Rawat K, Yadav NK, Kumar V (2014) Siddiqi MI dan Dube A (2014) Visceral leishmaniasis: kemajuan dalam pengembangan vaksin melalui pendekatan klasik dan molekuler. Imunol Depan 5:380. https://doi.org/10.3389/fmmu.2014.00380

6. Khatoon N, Pandey RK, Prajapati VK (2017) Menjelajahi protein sekretori Leishmania untuk merancang vaksin subunit multi-epitop sel B dan T menggunakan pendekatan imunoinformatika. Rep Sains 7:8285

7. Goto Y, Bhatia A, Raman VS, Liang H, Mohammad R, Picone AF, Vidal SEZ, Vedvick TS dkk (2011) KSAC, kandidat vaksin poliprotein pertama yang ditetapkan untuk leishmaniasis visceral. Imunol Vaksin Klinik 18(7):1118–1124. https://doi.org/10.1128/CVI. 05024-11

8. Kedzierski L (2010) Vaksin Leishmaniasis: dimana kita saat ini? J Glob Menginfeksi Dis 2(2):177–185. https://doi.org/10.4103/0974- 777X.62881

9. Nagill R, Kaur S (2011) Kandidat vaksin untuk leishmaniasis: tinjauan. Imunofarmakol Int 11(10):1464–1488. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2011.05.008

10. Coler RN, Reed SG (2005) Vaksin generasi kedua melawan leishmaniasis. Tren Parasitol 21(5):244–249

11. Fernández L, Carrillo E, Sánchez-Sampedro L, Sanchez C, Ibarra Meneses AV, Jimenez MA, Almeida VDA, Esteban M dkk (2018) Antigenisitas antigen c-kinase teraktivasi Leishmania (LACK) pada mononuklear darah tepi manusia sel, dan efek perlindungan dari vaksinasi prime-boost dengan pCI-neo-LACK plus virus vaccinia yang mengekspresikan LACK yang dilemahkan pada hamster. Imunol Depan 9:843. https://doi.org/10.3389/fmmu.2018.00843

12. Kelly BL, Stetson DB, Locksley RM (2003) Antigen LACK Leishmania mayor diperlukan untuk parasitisasi vertebrata yang efisien. J Exp Med 198(11):1689–1698. https://doi.org/10.1084/jem.20031 162

13. De Mendonça SC, Cysne-Finkelstein L, Matos DC (2015) Protein membran Kinetoplastid-11 sebagai kandidat vaksin dan faktor virulensi pada Leishmania. Imunol Depan 6:524. https://doi.org/10.3389/fmmu.2015.00524

14. Joshi PB, Kelly BL, Kamhawi S, Sacks DL, McMaster WR (2002) Penghapusan gen yang ditargetkan pada Leishmania mayor mengidentifikasi leishmanolysin (GP63) sebagai faktor virulensi. Mol Biokimia Parasitol 120(1):33–40. https://doi.org/10.1016/s0166-6851(01)00432-7

15. McMahon-Pratt D, Rodriguez D, Rodriguez JR, Zhang Y, Manson K, Bergman C, Rivas L, Rodriguez JL dkk (1993) Virus vaccinia rekombinan yang mengekspresikan GP46/M-2 melindungi terhadap infeksi Leishmania. Menginfeksi Imun 61(8):3351–3359

16. Holakuyee M, Mahdavi M, Zuhair MH, Abolhasani M (2012) Promastigote yang diperkaya protein kejutan panas dari Leishmania mayor menginduksi respons imun Th2 pada tikus BALB/c. Biomed Iran J 16(4):209–217. https://doi.org/10.6091/ibj.1098.2012

17. MacLean L, Price H, O'Toole P (2016) Menjelajahi jalur ekspor protein permukaan terasilasi hidrofilik B (HASPB) Leishmania dengan metode pencitraan sel hidup. Metode Mol Biol 1459:191–203. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-3804-9_13

18. Maharana BR, Tewari AK, Singh V (2015) Gambaran umum batang parafagellar kinetoplastid. J Parasit Dis 39(4):589–595. https://doi.org/10.1007/s12639-014-0422-x

19. Mahmoudzadeh NH, McKerrow JH (2004) Leishmania tropica: protease sistein sangat penting untuk pertumbuhan dan patogenisitas. Exp Parasitol 106(3–4):158–163. https://doi.org/10.1016/j.exppara. 2004.03.005

20. Mundodi V, Kucknoor AS, Gedamu L (2005) Peran Leishmania (Leishmania) chagasi amastigote sistein protease dalam kelangsungan hidup parasit travellular: studi tentang gangguan gen dan penghambatan mRNA antisense. BMC Mol Biol 6:3. https://doi.org/10.1186/ 1471-2199-6-3

21. Rogers ME (2012) Peran leishmania proteo fosfoglikan dalam penularan lalat pasir dan infeksi inang mamalia. Mikrobiol Depan 3:223. https://doi.org/10.3389/fmicb.2012.00223

22. Bhowmick S, Ali N (2009) Identifikasi antigen baru Leishmania donovani yang membantu menentukan korelasi perlindungan yang dimediasi vaksin pada leishmaniasis visceral. PLoS Satu 4(6):e5820. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005820

23. Assis TM, Mancini DT, Ramalho TC, da Cunha EFF (2014) Studi in silico Leishmania donovani - tubulin dan inhibitor. J Kimia. https://doi.org/10.1155/2014/492579