In Silico Design Vaksin Promiscuous Chimeric Multi-epitop Terhadap Mycobacterium Tuberculosis Bagian 1

Abstrak

Tuberkulosis (TB) merupakan ancaman kesehatan global, membunuh sekitar 1,5 juta orang setiap tahun. Pemberantasan Mycobacterium tuberculosis, agen penyebab utama TB, semakin menantang karena munculnya strain resisten obat yang luas. Vaksinasi dianggap sebagai cara yang efektif untuk melindungi inang dari patogen, tetapi satu-satunya vaksin TB yang disetujui secara klinis, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), memiliki perlindungan yang terbatas pada orang dewasa. Vaksin multi-epitop telah ditemukan untuk meningkatkan kekebalan terhadap penyakit dengan menggabungkan epitop secara selektif dari beberapa kandidat protein.

Tuberkulosis adalah penyakit menular yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis yang terutama menyerang paru-paru tetapi dapat juga menyerang organ lain. Kekebalan memainkan peran penting dalam perkembangan dan pengobatan TB.

Dalam kasus kekebalan yang tidak mencukupi, Mycobacterium tuberculosis dapat dengan mudah menyerang tubuh manusia dan berkembang menjadi tuberkulosis. Misalnya, sistem kekebalan yang terganggu akibat penyakit tertentu atau perawatan medis meningkatkan risiko infeksi TB. Selain itu, faktor-faktor seperti kekurangan gizi, kualitas hidup yang buruk, dan stres yang berlebihan juga dapat melemahkan kekebalan tubuh, yang menyebabkan berkembangnya TB.

Oleh karena itu, menjaga kesehatan dan memperkuat kekebalan tubuh sangat penting untuk mencegah tuberkulosis. Kekebalan tubuh dapat ditingkatkan melalui pola makan sehat, pola hidup teratur, olahraga teratur, dan tidur yang cukup, yang secara efektif dapat mengurangi risiko tertular berbagai penyakit, termasuk tuberkulosis.

Kekebalan juga penting untuk pengobatan dan pemulihan ketika TB sudah terjadi. Semakin kuat sistem kekebalan tubuh, semakin efektif tubuh dapat mempertahankan diri terhadap serangan basil TB dan menghasilkan antibodi yang cukup untuk melawan penyakit tersebut. Oleh karena itu, menjaga nutrisi yang cukup, olahraga yang tepat, dan sikap positif dapat meningkatkan kekebalan dan mempercepat pemulihan.

Kesimpulannya, ada hubungan yang kuat antara kekebalan dan TB. Menjaga kesehatan dan meningkatkan kekebalan tubuh merupakan salah satu cara penting untuk mencegah dan mengobati tuberkulosis. Mari kita hadapi hidup secara positif, jaga pola hidup sehat, dan jauhi penyakit. Dari sudut pandang ini, kita perlu meningkatkan kekebalan kita. Cistanche dapat meningkatkan kekebalan secara signifikan, karena abu daging mengandung berbagai komponen aktif biologis, seperti polisakarida, dua jamur, Huang Li, dll. Komponen ini dapat merangsang sistem kekebalan Berbagai jenis sel dalam sistem, meningkatkan aktivitas kekebalannya.

Klik manfaat kesehatan dari cistanche

Penelitian ini bertujuan untuk merancang vaksin multiepitop terhadap TB dengan menggunakan pendekatan imunoinformatika. Melalui pengayaan fungsional, kami mengidentifikasi delapan protein yang disekresikan oleh M. tuberculosis yang diperlukan untuk patogenesis, disekresikan ke ruang ekstraseluler, atau keduanya. Kami kemudian menganalisis epitop protein ini dan memilih 16 epitop limfosit T helper dengan aktivitas penginduksi interferon, 15 epitop limfosit T sitotoksik, dan 10 epitop Bcell linier, dan mengkonjugasikannya dengan adjuvant dan Pan HLA DR-binding epitop (PADRE) menggunakan yang sesuai linker.

Selain itu, kami memperkirakan struktur tersier dari vaksin ini, potensi interaksinya dengan Toll-Like Receptor-4 (TLR4), dan respons imun yang mungkin ditimbulkannya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa vaksin ini memiliki afinitas yang kuat terhadap TLR4, yang secara signifikan dapat merangsang sel CD4 plus dan CD8 plus untuk mensekresikan faktor imun dan limfosit B untuk mensekresi imunoglobulin, untuk mendapatkan imunitas humoral dan seluler yang baik. Secara keseluruhan, protein multi-epitop ini diperkirakan stabil, aman, sangat antigenik, dan sangat imunogenik, yang berpotensi sebagai vaksin global melawan TB.

1. Perkenalan

Tuberkulosis (TB), penyakit yang sangat menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, diurutkan oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) sebagai penyebab kematian tertinggi dari agen infeksi tunggal [1-3]. Pada tahun 2021, perkiraan jumlah kematian TB dan kasus baru masing-masing mencapai 1,6 juta dan 10,6 juta [4]. Saat ini, pengobatan klinis TB relatif jarang, dan kombinasi beberapa obat antimikroba banyak digunakan.
Siklus kemoterapi ini sangat panjang, biasanya memakan waktu sembilan hingga dua belas bulan, atau bahkan lebih lama [5], yang meningkatkan risiko mutasi yang resistan terhadap obat pada M. tuberculosis [6,7]. Dalam beberapa tahun terakhir, kemoterapi telah menjadi kurang efektif karena munculnya dan meningkatnya proporsi M. tuberculosis yang resistan terhadap obat dan multi-obat [6]. Mencegah berkembangnya TB mungkin lebih efektif daripada mengobatinya. Vaksinasi dikenal sebagai cara yang efektif untuk melindungi inang dari bakteri patogen [8].

Saat ini, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), yang dikembangkan lebih dari 100 tahun yang lalu, merupakan satu-satunya vaksin TB yang disetujui secara klinis [9]. Sayangnya, BCG hanya melindungi bayi baru lahir dan bayi dan sebagian besar tidak efektif terhadap remaja dan orang dewasa [2,10], meskipun WHO melaporkan bahwa 89 persen kasus TB pada tahun 2021 adalah orang dewasa [4]. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk mengembangkan vaksin anti-TB yang baru dan efektif, terutama untuk remaja dan orang dewasa.

Pengembangan vaksin TB diperumit oleh banyak fitur mikobakteri, seperti infeksi laten, persistensi, dan penghindaran kekebalan [11-13]. Vaksin TB yang ideal harus dirancang untuk menargetkan protein/jalur yang bertanggung jawab atas sifat-sifat ini pada M. tuberculosis dan mampu secara efisien menginduksi respon imun yang diperantarai sel CD4 plus dan CD8 plus [14].

Selain itu, vaksin yang efektif juga harus menargetkan kompleks histokompatibilitas utama (MHC) inang, yang sangat polimorfik [15]. Karakteristik ini mengajukan persyaratan yang sangat tinggi untuk keserbagunaan vaksin, yang jelas tidak dapat dicapai oleh satu protein alami saja. Vaksin multi-epitop, protein rekombinan yang terdiri dari serangkaian epitop (peptida) yang tumpang tindih [16], adalah jenis kandidat vaksin baru yang dapat mengatasi masalah di atas.

Dalam beberapa tahun terakhir, vaksin multi-epitope telah menarik banyak perhatian karena keunggulan kekebalan yang lebih tinggi dan alergenisitas yang lebih rendah daripada vaksin konvensional [17,18]. Saat ini, vaksin multi-epitop telah dirancang melawan banyak mikroorganisme patogen, termasuk Shigella spp. [19], virus penyakit mulut dan kuku [20], Helicobacter pylori [21,22], virus hepatitis B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], virus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28], dan virus leukosis [29].

Secara khusus, munculnya pandemi COVID-19 telah memperkuat penerapan teknologi ini [16,30–32]. Adapun TB, beberapa vaksin multi-epitop telah dirancang untuk menargetkan TB aktif [33-39] dan TB laten [40,41]. Diantaranya, tiga kandidat vaksin dirancang dalam bentuk DNA [34,36,40], dan dua di antaranya memasukkan epitop ke dalam tulang punggung protein untuk menghasilkan vaksin rekombinan [34,36].

Perlu dicatat bahwa kandidat protein untuk beberapa vaksin multi-epitop di atas dipilih secara acak, dan cakupan populasi dari vaksin ini memerlukan studi lebih lanjut.

Selain itu, dirancang dua kandidat vaksin TB multi-epitop dengan cakupan populasi yang luas, satu epitop dipilih dari protein vesikel eksosom imunogenik dengan sifat patogenik [39], dan yang lainnya tidak berfokus pada kandidat protein, tetapi langsung memilih yang sangat terkonservasi dan divalidasi secara eksperimental. epitop dari Immune Epitope Database (IEDB) [38]. Namun, calon protein ini kekurangan pengayaan fungsional, dan kemampuan calon vaksin untuk menginduksi sekresi interferon- (IFN-) masih harus ditingkatkan.

Sebuah studi sebelumnya telah menyimpulkan bahwa optimalisasi rasional epitop dapat dicapai dengan kombinasi kapasitas pengikatan MHC dan kemampuan epitop untuk bereaksi dengan reseptor sel T [42]. Selain itu, mereka memperkirakan bahwa vaksin dengan epitop pengikat limfosit T sitotoksik (CTL) A1, A2, A3, A24, dan B7 akan memiliki cakupan hampir 100 persen pada kelompok etnis utama (Kulit Hitam, Asia, Hispanik, dan Kaukasia).

Namun, hingga saat ini belum ada pendekatan serupa untuk merancang vaksin TB. Dalam penelitian ini, kami merancang vaksin TB multi-epitop yang sangat promiscuous menggunakan berbagai fitur antigenik dari delapan protein yang diperkaya fungsi. Kandidat vaksin chimeric memiliki 15 epitop CTL, 16 epitop limfosit T pembantu (HTL) dengan sifat penginduksi IFN- -, dan 10 epitop sel-B linier. Analisis imuno-informatika menunjukkan bahwa kandidat vaksin ini 'mencakup semua', menjadikannya landasan potensial untuk mencapai 'Strategi Akhir TB'.

2. Bahan dan metode

2.1. Seleksi protein dan pengambilan urutan

Untuk membuat vaksin multi-epitop melawan TB, pertama-tama kami memilih protein dari kompleks M. tuberculosis, yang disimpan dalam database IEDB [43] dan telah divalidasi sebagai epitop pengikat MHC kelas I dan II. Urutan asam amino (struktur primer) protein dari strain M. tuberculosis H37Rv diperoleh dari database UniProt [44]. Prediksi bebas-alignment dari calon antigen berdasarkan sifat fisikokimia diperoleh dari server VaxiJen 2.0 [45], yang mengalami transformasi sekuens protein otomatis dan lintas kovarians (ACC) menjadi vektor seragam asam amino utama sifat, dengan ambang batas antigenisitas ditetapkan pada 0.4 untuk setiap protein bakteri [45,46].

Anotasi fungsional protein dinilai menggunakan Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 [47]. Protein yang disekresikan selanjutnya diperkaya menggunakan dua kategori: ruang ekstraseluler dan patogenesis melalui database DAVID dan BioCyc [48]. Proteom Homo sapiens GRCh38.p13 diunduh dalam format FASTA dari database National Center for Biotechnology Information (NCBI) [49]. BLASTp digunakan untuk memprediksi homologi (nilai-E =1e-5) antara protein yang disekresikan dan protein H. sapiens.

2.2. Prediksi epitop sel-T

Prediksi dan pemilihan epitop adalah langkah penting dalam pembuatan vaksin multi-epitop. Molekul MHC I mengikat peptida pendek (9-11 asam amino) karena celah pengikat peptida dari molekul MHC I yang terdiri dari rantai tunggal tertutup [50]. NetMHCpan-4.1 [51] yang dapat diakses secara bebas digunakan untuk prediksi epitop CTL, yang menggunakan NNAlign_MA untuk menghasilkan peringkat persentase ( peringkat persen) berdasarkan kombinasi afinitas pengikatan MHC I dan ligan yang dielusi .

"Peringkat persen" urutan kueri ditentukan dengan membandingkan skor prediksinya dengan distribusi skor prediksi untuk MHC relevan yang dihitung menggunakan serangkaian peptida asli yang dipilih secara acak. Epitop dengan peringkat persen < 0.5 persen dianggap pengikat kuat, sedangkan epitop dengan peringkat persen < 2 persen dianggap pengikat lemah [51].

Meskipun hingga 12 epitop MHC kelas I supertipe dapat diprediksi di server, kami hanya menggunakan A1, A2, A3, A24, dan B7 karena kelima supertipe ini mencakup 100 persen ras manusia utama [42] . Kami memilih pengikat yang kuat dan memprediksi antigenisitasnya menggunakan VaxiJen2.0 [45], kemudian, kami memprediksi imunogenisitas kelas I menggunakan International Epitope Database (IEDB) [52], yang menggunakan 3-fold cross-validation.

Akhirnya, kami mengatur epitop yang bersifat antigenik dan imunogenik menurut peringkat persen dan memilih 15 epitop dengan skor rendah, tiga untuk setiap supertipe dan setidaknya satu untuk setiap protein kandidat, kecuali untuk protein kandidat yang tidak dapat memiliki epitop pengikat CTL yang kuat. yang bersifat antigenik dan imunogenik. Terakhir, nilai IC50 untuk setiap epitop CTL diprediksi dari NetMHC-4.0 [53].
Molekul MHC Kelas II berikatan dengan peptida antigenik, dan kompleks yang dihasilkan dapat dikenali oleh HTL. Biasanya, panjang peptida antigenik berkisar dari 12 hingga 20 residu asam amino, tetapi panjang peptida antara 13 dan 16 residu sering diamati [54].

{{0}}mer adalah epitop MHC II yang paling melimpah untuk M. tuberculosis dan telah disimpan di IEDB. Hasilnya, kami menggunakan NetMHCIIpan-4.0 [51,55] untuk memprediksi pengikatan 15-mer peptida ke Human Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, dan alel H-2–1. Prediksi tersebut juga didasarkan pada NNAlign_MA dengan peringkat persen < 2 persen dan < 10 persen masing-masing dianggap sebagai pengikat kuat dan lemah [51].

Selain itu, kami memperkirakan 15-epitop penginduksi IFN lainnya untuk calon protein menggunakan server IFNepitope [56], yang menggunakan pendekatan hibrid mesin vektor dukungan yang memungkinkan penyaringan virtual IFN- -penginduksi peptida/epitop dalam peptida perpustakaan yang terdiri dari pengikat MHC II IFN- -inducible dan non-inducible yang mengaktifkan sel T-helper. Kami kemudian memprediksi antigenisitas dari epitop penginduksi IFN [45], dan akhirnya, kami memilih 16 epitop yang paling promiscuous yang mengikat MHC-II kuat, penginduksi IFN, dan antigenik.

Penting untuk dicatat bahwa peptida sinyal telah dihapus dari protein kandidat sebelum prediksi epitop. Dalam penelitian ini, peptida sinyal disaring menggunakan SignalP 5.0 [57] dan TargetP2.0 [58].

2.3. Prediksi epitop sel-B linier

Epitop sel-B linier (16-mer) diprediksi menggunakan ABCpred [59,60] dengan ambang default 0.51. Selain itu, untuk meningkatkan keandalan hasil prediksi, kami juga menggunakan BepiPred 2.0 [61] untuk memprediksi epitop sel-B linier. Epitop yang diperoleh dari kedua perangkat lunak ini selanjutnya dilakukan prediksi antigenisitas menggunakan VaxiJen2.0 [45]. Akhirnya, kami memilih sepuluh epitop sel B linier berdasarkan skor tinggi ABCpred dan antigenisitas, dengan setidaknya satu epitop dipilih untuk setiap calon protein.

2.4. Konstruksi kandidat vaksin multi-epitop dengan sifat chimeric

Vaksin multi-epitop yang dirancang mengandung satu adjuvant HBHA (heparin-binding hemagglutinin), satu Pan HLA DR-binding epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 epitop sel-B linier, dan satu tag His× 6 (Gbr. 1). 3). Linker digunakan untuk bergabung dengan epitop, mencegah produksi epitop persimpangan, dan meningkatkan prosesi dan regenerasi epitop individu dalam vaksin chimeric [62].

Untuk pembuatan kandidat vaksin ini, adjuvan HBHA (UniProt ID: P9WIP9) ditempatkan di N-terminus dan dihubungkan ke hilir PADRE melalui linker EAAAK. Kemudian, epitop HTL yang digabungkan oleh penaut GPGPG ditautkan ke PADRE. Selain itu, epitop CTL yang digabungkan oleh penaut AAY dihubungkan ke epitop HTL melalui penaut HEYGAEALERAG, yang juga menggabungkan unit epitop CTL ke epitop sel-B linier yang dihubungkan menggunakan penaut KK. Terakhir, tag His× 6 dilekatkan pada ujung-C dari protein kimerik.

2.5. Antigenisitas, alergenisitas, dan sifat fisikokimia

Antigenisitas vaksin multi-epitop dan delapan komponen protein diprediksi oleh server VaxiJen 2.0 [45], sedangkan alergenisitas protein ini diprediksi oleh server AllerTOP 2.0 [ 63]. AllerTOP 2.0 menggunakan deskriptor E asam amino, transformasi ACC dari sekuens protein, dan k-nearest neighbor (kNN) untuk klasifikasi alergen.

Metode ini mencapai akurasi 85,3 persen dengan 5-fold cross-validation. Untuk prediksi sifat fisikokimia seperti waktu paruh, titik isoelektrik, indeks ketidakstabilan, indeks alifatik, dan rata-rata besar hidropatisitas (GRAVY) dari vaksin multi-epitop ini, server ExPASy ProtParam [64] digunakan.
Selanjutnya, kelarutan peptida vaksin multi-epitop dinilai menggunakan server proteinSol (PROSO II) [65] berdasarkan pengklasifikasi yang mengeksploitasi perbedaan halus antara protein tak larut terkenal dari TargetDB dan protein larut dari TargetDB dan PDB [ 66]. Saat dievaluasi menggunakan 10-fold cross-validation, akurasinya mencapai 71.0 persen (area di bawah kurva ROC=0.785).

2.6. Simulasi kekebalan

Untuk mengkarakterisasi profil respon imun dan imunogenisitas vaksin, simulasi imun silico dilakukan dengan menggunakan server C-ImmSim [67]. C-ImmSim memprediksi interaksi kekebalan menggunakan matriks penilaian khusus posisi yang berasal dari teknik pembelajaran mesin untuk prediksi peptida.
Ini secara bersamaan mensimulasikan tiga kompartemen yang mewakili tiga wilayah anatomi terpisah yang ditemukan pada mamalia: (i) sumsum tulang, tempat sel punca hematopoietik disimulasikan untuk menghasilkan limfosit dan sel myeloid baru; (ii) timus, di mana sel T naif dipilih untuk menghindari autoimunitas; dan (iii) organ limfatik seperti kelenjar getah bening.

Untuk meningkatkan dan meningkatkan vaksin secara efektif, kami mengikuti pendekatan [68] di mana dua suntikan diberikan dengan jarak empat minggu. Semua parameter simulasi diatur ke nilai default, dengan langkah waktu diatur ke 10 dan 94 (setiap langkah waktu adalah delapan jam).

2.7. Prediksi wilayah yang tidak teratur

Daerah yang tidak teratur secara intrinsik (IDR) hadir dalam banyak protein. Wilayah yang tidak teratur diprediksi menggunakan DISOPRED3 [69], yang menggunakan DISOPRED2 dan dua modul berbasis pembelajaran mesin lainnya yang dilatih dengan IDR besar untuk mengidentifikasi residu yang tidak teratur. Mereka kemudian mengumumkan

2.8. Prediksi struktur sekunder dan tersier

Struktur sekunder dari vaksin yang dirancang diprediksi oleh server PSIPRED 4.0 [70], yang pertama kali menggunakan PSI-BLAST untuk mengidentifikasi urutan yang terkait erat dengan protein kueri. Struktur tersier vaksin ini diprediksi menggunakan server Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER) [71].

Ada empat langkah utama dalam pemodelan ITASSER; a) identifikasi templat penguliran; b) simulasi perakitan struktur berulang; c) pemilihan dan penyempurnaan model; dan d) anotasi fungsional berbasis struktur [72,73].

I-TASSER menghasilkan lima model, yang disaring menggunakan ProSA-web [74], dan model dengan Z-score terendah dipilih untuk penyempurnaan lebih lanjut. ProSA-web membandingkan skor model yang diperoleh dari struktur yang diverifikasi secara eksperimental yang disimpan dalam PDB. Plot skor kualitas lokal membantu mengidentifikasi area bermasalah dalam model, dan skor yang sama direpresentasikan menggunakan kode warna pada presentasi struktur 3D. Ini berguna untuk penentuan dan penyempurnaan struktural awal.

2.9. Penyempurnaan struktur tersier

Model 3D "kasar" dari kandidat vaksin yang diperoleh ITASSER disempurnakan dalam dua langkah menggunakan dua server; pertama dengan ModRefiner [75] diikuti oleh GalaxyRefine [76]. ModRefiner menggunakan jejak C untuk memengaruhi konstruksi dan penyempurnaan protein yang diperoleh dengan minimisasi energi tingkat atom dua langkah.

Pertama, jejak C digunakan untuk membangun rantai utama, diikuti dengan penyempurnaan rotamer rantai samping dan atom tulang punggung menggunakan medan gaya komposit berbasis fisika dan pengetahuan. GalaxyRefine menggunakan beberapa template untuk menghasilkan struktur inti yang andal, sementara loop atau terminal yang tidak dapat diandalkan dihasilkan oleh pemodelan berbasis pengoptimalan.

2.10. Validasi struktur tersier

Struktur kandidat vaksin yang disempurnakan divalidasi oleh plot Ramachandran yang dihasilkan dari database PROCHECK [77] dan MolProbity [78]. Plot Ramachandran mengevaluasi konformasi tulang punggung protein dengan membagi residu asam amino menjadi dua wilayah: diizinkan dan tidak diizinkan. PROCHECK menggunakan stereokimia untuk menilai kualitas bersih struktur protein dengan membandingkannya dengan struktur halus pada resolusi yang sama dan kemudian menyajikan wilayah yang memerlukan analisis lebih lanjut.

Molprobity memvalidasi model makromolekul (protein dan asam nukleat) lokal dan global dengan campuran kriteria sinar-X, NMR, komputasi, dan cryoEM [79]. Kekuatan dan sensitivitas untuk mengoptimalkan penempatan hidrogen dan analisis kontak semua atom banyak digunakan dalam versi terbaru dari kriteria geometri kovalen dan sudut torsi [80].

2.11. Epitop sel B terputus-putus

Epitop sel B terputus-putus dalam struktur protein asli diprediksi menggunakan ElliPro [81]. ElliPro menerapkan tiga algoritme untuk memperkirakan bentuk protein sebagai ellipsoid, menghitung indeks penonjolan residu (PI), dan mengelompokkan residu yang berdekatan berdasarkan nilai PI-nya. ElliPro memberikan setiap epitop keluaran dengan skor yang digambarkan sebagai nilai PI rata-rata untuk residu epitop. Ellipsoid dengan nilai PI 0.9 terdiri dari 90 persen residu protein yang terkandung, sedangkan 10 persen sisanya berada di luar ellipsoid. Untuk setiap residu epitop, nilai PI dihitung dari pusat massa residu yang berada di luar ellipsoid terbesar yang mungkin.

2.12. Docking molekul protein chimeric

Docking molekuler dari vaksin yang dirancang (ligan) dengan Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) reseptor imun dilakukan menggunakan Patchdock [82]. 10 model teratas kemudian disempurnakan menggunakan FireDock [83]. PatchDock menggantikan representasi permukaan titik Connolly dari molekul dengan tambalan cekung, cembung, dan datar.

Model kemudian diberi skor berdasarkan kecocokan geometris dan desolvasi atom. [82]. FireDock mengoptimalkan konformasi rantai samping dan orientasi bodi tegar serta menghasilkan keluaran kompleks 3D yang disempurnakan berdasarkan energi pengikatan [83]. Kami memilih model pertama Firedock berdasarkan energi global sebagai kompleks dok. Terakhir, kandungan energi pengikatan dan disosiasi dalam kompleks docking diprediksi menggunakan server PRODIGY [84].

2.13. Simulasi dinamika molekul

Simulasi dinamika molekuler dilakukan pada protein menggunakan server web yang cepat dan dapat diakses secara bebas, server analisis mode normal koordinat internal (iMODS) [85], dan hasil docking yang konsisten dan optimal diperoleh dari server PatchDock-FireDock. Dalam koordinat internal, Normal Mode Analysis (NMA) menghasilkan gerakan kolektif yang penting untuk fungsi makromolekul. iMODS menyajikan mekanisme untuk menjelajahi mode ini sebagai analisis getaran, animasi gerak, dan lintasan morphing yang dilakukan hampir secara interaktif pada resolusi yang berbeda [85].

2.14. Terjemahan terbalik, optimalisasi kodon, dan kloning vaksin secara in silico

Untuk mengekspresikan kandidat vaksin secara efektif dalam sel Escherichia coli, cDNA dihasilkan secara in silico melalui pengoptimalan kodon dan terjemahan balik menggunakan Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Optimasi yang terlibat (i) menghindari terminator transkripsi independen rho, ii) menghindari situs pengikatan ribosom prokariotik, (iii) menghindari situs pembelahan enzim restriksi NcoI dan XhoI, yang berfungsi sebagai situs restriksi terminal-N dan terminal-C untuk penyisipan cDNA templat vaksin, dan (iv) hanya pengoptimalan parsial untuk menerapkan mutagenesis yang diarahkan ke lokasi. Indeks Adaptasi Kodon (CAI) dan konten GC memprediksi kualitas cDNA dengan kodon stop opal (TGA) yang dimasukkan setelah tag His× 6. Kemudian, fragmen DNA yang dioptimalkan dari kandidat vaksin chimeric diintegrasikan ke dalam untai terbalik pET-28a( plus ) menggunakan alat SnapGene [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com