Konjugasi Antibodi yang Merangsang Kekebalan Menghasilkan Aktivasi Myeloid yang Kuat Dan Kekebalan Antitumor yang Tahan Lama (Bagian 2)

Untuk mempelajari info lebih lanjut, silakan hubungi{0}}

Diskusi:

Hasil yang disajikan di sini memberikan bukti kuat yang mendukung ISAC sebagai teknologi baru untuk imunoterapi tumor. Pemodelan in vitro ISAC menunjukkan kemampuan mereka untuk mengaktifkan APC myeloid manusia primer dengan cara yang bergantung pada Fc R dan TLR dan untuk meningkatkan presentasi silang antigen menggunakan sistem model OVA murine. Aktivasi melalui upregulasi molekul kostimulatori CD40 tidak hanya diamati secara in vitro tetapi juga terlihat pada APC myeloid tumor pada model tumor xenograft dan syngeneic. Salah satu temuan mencolok dari penelitian ini adalah bahwa perlekatan kovalen dari agonis TLR ke a antibodi monoklonal bertarget tumor dalam bentuk ISAC mengubah hasil imunostimulasi dan kemanjuran keseluruhan yang biasanya diantisipasi dengan agonis TLR. Perbandingan pengiriman trastuzumab lokal yang dikombinasikan dengan T785 dengan pengiriman sistemik T785-ISAC menunjukkan bahwa hanya ISAC yang berhasil mengurangi beban tumor. Pengiriman lokal campuran tidak memberikan manfaat dalam model xenograft tumor HCC1954, dengan efek yang sebanding dengan trastuzumab saja. Temuan ini mendukung bahwa tidak hanya pengiriman lokal tetapi juga pengiriman simultan antibodi dan agonis TLR sangat penting untuk kemanjuran terapeutik yang diamati dengan ISAC. Data mekanistik yang dihasilkan dalam model xenograft tumor HCC1954 menunjukkan persyaratan in vivo untuk keterlibatan Fc R dan keterlibatan TLR untuk kemanjuran, karena TLRnull-ISAC dan ISAC tidak aktif Fc gagal mengendalikan pertumbuhan tumor. Lebih lanjut, pemberian ISAC secara sistemik menghasilkan kemanjuran anti-tumor yang berkelanjutan pada model tumor HER2 plus syngeneic tikus dan HER2 manusia plus xenografts kanker payudara yang resisten terhadap pengobatan dengan antibodi tak terkonjugasi. HER2 dipilih sebagai antigen target untuk studi praklinis in vivo karena neoadjuvant, adjuvant, dan terapi lini pertama untuk pasien dengan kanker payudara stadium lanjut atau metastasis lokal didominasi oleh antibodi target HER2-yang tidak dirancang untuk merangsang sistem imun. sistem dan antibodi penghambat penghambat sel T yang disetujui telah minimal efektif pada pasien ini. Pasien-pasien ini dapat memperoleh manfaat dari ISAC yang mempertahankan fungsionalitas antibodi induk dan menambah potensi imunostimulator yang signifikan. Seperti halnya imunoterapi, kemungkinan untuk menghasilkan atau memperburuk antibodi anti-obat ada dan, dalam kasus ISAC, pada akhirnya mungkin bergantung pada imunogenisitas antibodi induk. Penilaian ini paling baik dilakukan secara klinis dan trastuzumab mungkin cocok untuk pemeriksaan karena tingkat imunogenisitas Herceptin™ yang dilaporkan pada pasien kurang dari 1 persen . Data in vivo yang menunjukkan persyaratan untuk pengiriman antibodi dan adjuvant secara simultan selanjutnya didukung oleh pekerjaan yang merinci pensinyalan intraseluler yang mengatur aktivitas ISAC melalui pensinyalan Fc R dan TLR simultan. Sementara studi tambahan dapat lebih menjelaskan dinamika pensinyalan ISAC intraseluler, studi yang dijelaskan di sini menyoroti keuntungan pensinyalan potensial dari konjugasi agonis TLR ke antibodi, seperti yang biasanya diamati ketika antibodi melibatkan patogen selama kekebalan protektif. Analisis berbasis CyTOF dari pensinyalan intraseluler di PBMC manusia digunakan untuk lebih lanjutmemahami dan membedakan aktivitas campuran dan ISAC. Hasilnya mengungkapkan tanda tangan yang diperkuat setelah stimulasi ISAC dibandingkan dengan yang ditimbulkan oleh campuran komponen individu, yang selanjutnya mendukung potensi peningkatan aktivitas melalui konjugasi kimia antibodi dan agonis TLR. Sementara TLR7 dan TLR8-potensi spesifik ISAC tidak dapat diukur menggunakan sel reporter HEK293, demonstrasifosforilasi IRF yang diinduksi ISAC-7 menunjukkan agonisme TLR7/8 aktif, karena IRF-7 diketahui berada di hilir pensinyalan yang digerakkan oleh TLR7 dan TLR8 MyD88-30. Data menunjukkan bahwa ISAC tidak hanya memunculkan peningkatan pensinyalan jalur kanonik yang terkait dengan jalur TLR dan Fc R tetapi juga mengurangi ambang aktivasi berpasangan yang diperlukan untuk memicu fosforilasi protein pensinyalan hilir seperti protein ribosom S6, pengatur utama translasi protein dalam sel. Skor DREMI yang tinggi, terutama yang diukurdi monosit serta di DC, mendukung ketergantungan bersyarat yang kuat yang disebabkan oleh stimulasi dengan ISAC yang tidak terlihat dengan campuran. Fenomena ini mungkindifasilitasi oleh perubahan intraseluler dalam kelimpahan, lokalisasi, dan / atau perekrutan reseptor dalam endosom, tetapi penyelidikan lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi mekanisme yang tepat. Yang penting, analisis DREMI mengidentifikasi hubungan yang konsisten dengan mitra pensinyalan yang diketahui sebagai hasil dari stimulasi ISAC. Dengan penghambatannya yang diketahuiperan dalam pensinyalan NF-κB kanonik 49, kami mengamati pengurangan ketergantungan (yaitu skor DREMI)antara pIRF7 dan inhibitor kappa B (IκB) ketika sel-sel myeloid dirangsang dengan ISAC. Secara kolektif, hasil ini mendukung respons intraseluler yang diperkuat dan berkelanjutan melalui molekul jalur transduksi sinyal yang relevan di hilir stimulasi ISAC di samping sinergi antara jalur pensinyalan terkait TLR dan Fc R.

Klik di sini untuk mempelajari lebih lanjut tentang Cistanche

Hasil kami mengungkapkan bahwa interaksi Fc-Fc R fungsional sangat penting untuk aktivasi APC myeloid yang dimediasi ISAC. IgG1 Fc asli, yang memiliki afinitas tertinggi untuk Fc Rs pengaktif dari isotipe IgG yang ada secara alami, lebih unggul daripada isotipe IgG lain dengan afinitas lebih rendah untuk pengaktifan Fc Rs. Peningkatan lebih lanjut dari interaksi Fc-Fc R melalui fukosilasi meningkatkan potensi sementara pengurangan interaksi Fc-Fc R melalui glikosilasi mengurangi potensi. Seperti yang diharapkan, pensinyalan Syk di hilir keterlibatan Fc R selain agonis TLR berikutnya diperlukan untuk ISAC untuk memperoleh stimulasi maksimal. Temuan ini didukung oleh penelitian yang menunjukkan peningkatan dramatis stimulasi myeloid setelah co-stimulasi dengan IgG terikat pelat dan agonis TLR PAM3CSK 50. Mereka juga menyarankan bahwa ikatan silang Fc yang lebih luas, pada permukaan sel target atau dalam pengaturan pelat in vitro , mungkin terjadi, atau jaringan pensinyalan diferensial diaktifkan, mengikuti stimulasi ISAC sebagai lawan dari campuran komponen. Terjemahan platform ISAC in vivo pertama kali dinilai dengan HER2 manusia ditambah garis sel tumor pada tikus yang tidak memiliki sel B, T, dan NK yang berfungsi penuh. Hebatnya, trastuzumab ISAC secara signifikan lebih efektif daripada trastuzumab di beberapa tumor dengan berbagai tingkat ekspresi HER2. Lebih lanjut, data menunjukkan ketergantungan pada penargetan tumor untuk efek anti-tumor ISAC, karena isotipe-ISAC tidak dapat menginduksi regresi dan pembersihan tumor. Sementara pemodelan in vitro menunjukkan perlunya aktivitas TLR dan Fc R untuk mengaktifkan potensi ISAC, model tersebut tidak berhasil mengukur ketergantungan pada penargetan antigen ISAC. Tidak ada perbedaan yang diukur antara target dan isotipe T785-ISAC dalam uji berbasis pelat dengan APC myeloid manusia sehat yang dikultur bersamadengan sel tumor (data tidak ditampilkan).Kurangnya ketergantungan target yang diukur secara in vitro dapat dikaitkan dengan beberapa faktor: APC myeloid ditemukan meningkatkan regulasi Fc Rs pada permukaan sel setelah kultur in vitro, yang dapat meningkatkan kemampuan IgG terlarut untuk mengikat Fc R, yang mengarah ke sinyal yang diperkuat dari isotipe ISAC.Selain itu, budayasistem tidak memiliki IgG endogen dan faktor serum tambahan hadir in vivo yang dapat bersaing untuk Fc R in vivo dan meredam efek terlihat dengan isotipe ISAC.Meskipun demikian, model in vivo menunjukkan ketergantungan ISAC pada penargetan tumor untuk kemanjuran anti-tumor.ISAC isotipe tidak hanya menunjukkan sedikit dampak pada pertumbuhan tumor dalam studi kemanjuran, tetapi mereka juga ditemukan tidak menimbulkan dampak pada tingkat genetik pada tumor, seperti yang ditunjukkan pada model tumor xenograft dan syngeneic.Selain menunjukkan kemanjuran yang bergantung pada target in vivo, T785-ISAC ditoleransi oleh hewan dan menginduksi penurunan berat badan minimal, menunjukkan sedikit tanda efek di luar target dan efek samping pada tikus.Data ini lebih lanjut mendukung kemampuan ISAC penargetan tumor yang dikirim secara sistemik untuk melakukan perjalanan ke tumor dan menginduksi respons anti-tumor pro-inflamasi lokal.

Pentingnya fungsi efektor yang dimediasi sel myeloid ditunjukkan dalam studi penipisan sel, di mana penipisan fagosit clodronate menghilangkan kemampuan ISAC untuk menginduksi pembersihan tumor.Menariknya, meskipun tumor awalnya mengalami kemunduran setelah penipisan sel positif Gr1, tumor kemudian tumbuh.Fenomena ini mungkin terjadi sebagai akibat dari penipisan prekursor fagosit seperti monosit, yang mungkin kemudian berdiferensiasi menjadi sel fagosit fungsional dan dewasa.Wawasan molekuler dan seluler lebih lanjut diperoleh setelah mengukur tingkat dan perubahan mRNA setelah perawatan ISAC.Data ini selanjutnya dikuatkan oleh imunohistokimia serta kuantifikasi protein, yang menunjukkan infiltrasi sel myeloid ke dalam tumor di sepanjangdengan produksi sitokin pro-inflamasi TNF dan myeloid chemoattractants CCL2 (MCP-1) dan CCL4 (Mip1b).

Gambar 2: ISACS memunculkan pola pensinyalan yang berbeda dalam APC myeloid. (ad) PBMC manusia yang baru diisolasi distimulasi dengan 1 M rituximab-ISAC atau setara ekuimolar dari campuran dengan adanya CD20 plus sel tumor Toledo pada 1:1 rasio selama 15 menit. ( a ) Rasio busur rata-rata ISAC atas pensinyalan diukur mengikuti stimulasi campuran untuk berbagai fosfoprotein seperti yang digambarkan oleh peta panas, dengan indikasi kuning peningkatan pensinyalan dan biru indikasi pengurangan sinyal. ( b ) Plot sitometri aliran representatif untuk pIRF7 dan pRPS6 dalam monosit dan cDC. (c) Perubahan lipat dari pensinyalan yang diinduksi dihitung sebagai rasio arcsinh di atas kontrol yang tidak distimulasi. Fosforilasi IRF7 dan ERK1/2 diukur dalam monosit dan cDC setelah ISAC atau stimulasi campuran. Data berasal dari satu percobaan dengan enam donor (mean dan SEM); *P<0.05,><0.01,><0.001,><0.0001. (d)="" representative="" drevi="" plots="" following="" dremi="" analysis="" with="" the="" area="" under="" the="" curve="" (auc)="" and="" inflection="" point="" (ip)="" denoted.="" drevi="" plots="" were="" visually="" inspected="" for="" curve="" fit="" and="" signal-to-noise,="" and="" inflection="" points="" were="" calculated="" for="" those="" with="" proper="" sigmoidal="" curve="" fits="" (n/a="" indicates="" no="" curve="">

Reseptor untuk CCL2 dan CCL4, CCR2 dan CCR5 masing-masing diekspresikan pada monosit dan makrofag, menunjukkan jenis sel ini dapat direkrut ke tumor yang diobati dengan ISAC.Lebih lanjut, mRNA Cxcl9 dan Cxcl11, yang mengkodekan kemokin spesifik sel T dan diekspresikan oleh DC dalam TME, juga diregulasi oleh pengobatan ISAC trastuzumab (Gambar Tambahan 23) 52,53.ISAC trastuzumab dengan potensi yang meningkat, menggunakan agonis CL264, menunjukkan peningkatan kemanjuran dalam model tumor yang mengekspresikan lebih sedikit HER2.Ini penting mengingat bahwa pasien yang tumornya mengekspresikan HER2 rendah memiliki pilihan pengobatan yang lebih terbatas dan tidak memenuhi syarat untuk trastuzumab atau terapi yang mengandung trastuzumab lainnya.Penurunan berat badan sementara sekitar 5-10 persen dan peningkatan sekresi sistemik TNF diamati pada hewan yang diobati dengan CL264-ISAC yang ditargetkan dan isotipe, yang menunjukkan kemungkinan efek di luar target selain anti-antibodi yang kuat. aktivitas tumor diamati.Data kolektif yang disajikan dalam model xenograft menunjukkan bahwa fagositosis yang dimediasi ISAC adalah mekanisme yang efektif untuk menghilangkan tumor, tetapi mekanisme ini dapat ditingkatkan setelah presentasi antigen neoantigen tumor ke sel T pada inang yang imunokompeten.Menjelang akhir ini, kemampuan ISAC untuk mempromosikan kekebalan anti-tumor pada tikus tipe liar diselidiki dengan ISAC anti-rHER2 di dua berbedarHER2-mengekspresikan model syngeneic (MMC dan CT26-rHER2). Baik T785 dan CL264 yang mengandung ISAC dinilai dalam model MMC syngeneic yang diberikan ekspresi antigen rHER2 yang tinggi, karena ISAC dengan potensi yang lebih rendah dan lebih tinggi didalilkan berkhasiat dengan kepadatan antigen yang tinggi pada sel tumor. Kedua ISAC rHER2 menyebabkan pembersihan tumor lengkap pada hewan yang membawa tumor besar (350-950 mm3) dalam model MMC sedangkan antibodi tak terkonjugasi gagal mengendalikan pertumbuhan tumor. Analisis tingkat transkrip mRNA dalam model MMC mengungkapkan perubahan dramatis dalam regulasibanyak gen pada 24 jam setelah pengobatan dengan target rHER2 T785-ISAC relatif terhadap antibodi rHER2 atau isotipe ISAC, termasuk dalam gen yang terlibat dalam biologi sel myeloid, biologi TLR, dan respons imun adaptif. Peningkatan infiltrat sel pengekspres CD11c- dan F4/80-terlihat oleh imunohistokimia, mirip dengan tren yang terlihat pada model tumor xenograft HCC1954. Selanjutnya, infiltrasi sel T CD8 diamati denganimunohistokimia, mendukung generasi respon imun adaptif setelah pengobatan ISAC.

Selain pentingnya fagosit yang ditunjukkan dalam model xenograft, studi penipisan dalam model tumor syngeneic MMC mengungkapkan ketergantungan yang kuat pada fagosit, karena penipisan menggunakan liposom bermuatan clodronate menghentikan efek anti-tumor yang dimediasi ISAC. Selain itu, studi syngeneic menunjukkan peran penting untuk sel T dalam kemanjuran ISAC. Pembersihan tumor yang digerakkan oleh ISAC sangat bergantung pada aktivitas sel T CD8, karena penipisan sel T CD8 menghambat kemanjuran anti-tumor. Data menunjukkan bahwa aktivitas sel T didorong melalui aktivasi yang dimediasi TLR dari sel myeloid yang distimulasi ISAC. Persyaratan untuk sel T tersebut, mungkin terkait dengan presentasi antigen terkait tumor oleh sel myeloid yang distimulasi ISAC, mendukung bahwa ISAC kemungkinan memediasi aktivitas anti-tumor mereka melalui setidaknya dua mekanisme: fagositosis dan presentasi antigen. Sementara fagosit memberikan respons anti-tumor awal setelah pengobatan ISAC, antigen priming sel T pada akhirnya memberikan pembersihan tumor dan efek tahan lama yang diukur dalam model imunokompeten sepenuhnya. Kombinasi ini akan sangat diinginkan untuk pasien kanker karena pengobatan ISAC dapat menghasilkan kekebalan anti-tumor yang kuat dan tahan lama. Untuk mengeksplorasi lebih lanjut pentingnya aktivasi sel T yang dimediasi ISAC, tikus yang disembuhkan dari tumor CT26- rHER2 setelah rHER2 CL 264-Pengobatan ISAC ditantang ulang, setelah 30 hari bebas tumor, dengan garis sel induk CT26 non-rHER2 yang mengekspresikan. rHER2-hewan yang disembuhkan CT26 dilindungi dari tantangan dengan CT26 sedangkan hewan naif tumor tidak dapat menolak pertumbuhan tumor. Selain itu, untuk menunjukkan bahwa perlindungan khusus untuk garis sel tumor CT26, 4T1 secara bersamaan ditanamkan di sisi kontralateral tikus yang ditantang CT26 induk. Meskipun tumor CT26 gagal tumbuh pada tikus yang disembuhkan-CT26, pertumbuhan tumor 4T1 tidak terbebani dan dengan demikian memberikan bukti bahwa kekebalan spesifik antigen dan bergantung pada respons imun adaptif. Lebih lanjut, penelitian ini menyarankan ISAC yang ditargetkan tumor memediasi memori imunologis tidak hanya pada antigen tumor yang awalnya ditargetkan tetapi juga pada antigen yang tidak ditargetkan. Data ini juga menunjukkan bahwa sel myeloid dapat menghadirkan antigen terkait tumor yang mendorong respons CTL tambahan. Implikasi dari temuan ini menunjukkan bahwa, bahkan jika antigen tumor yang ditargetkan kemudian diturunkan regulasinya atau tidak dapat berikatan dengan ISAC, memori imunologis telah dipanggil dan mampu mempertahankan respons yang tahan lama. Tanggapan ini tidakterbatas pada antigen yang ditargetkan oleh ISAC tetapi juga pada antigen tambahan yang tidak teridentifikasi, yang diekspresikan tumor.Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa ISAC menghasilkan biologi yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif yang berkaitan dengan aktivasi seluler dan presentasi antigen, proliferasi sel T, dan kekebalan anti-tumor yang tahan lama.

Methods and Materials: Antibody Conjugation & Characterization For conjugation of adjuvants to the antibody, adjuvants were first synthesized to include a linker flanked by a reactive group. Conjugates produced using two-step methods were first synthesized through the modification of mAb lysine residues with a heterobifunctional crosslinker SATA. Deprotection of the acetylated thiol exposed a reactive thiol which was then reacted at room temperature for 2-4 hours with an adjuvant-linker flanked by a thio-reactive maleimide. For constructs produced using a single-step conjugation method, TFP esters were then conjugated to an IgG1 antibody. The TFP esters were dissolved in anhydrous DMSO to make a 20 mM stock solution and 5-10 molar equivalents (relative to the antibody) were added to the IgG antibody at 10 mg/mL in PBS. The conjugation reaction was performed at 4-40°C for 2-12 hours. The resulting immunoconjugates were buffer exchanged into PBS (pH 7.4) through desalting (Zeba Columns, Thermo Fisher Scientific) or dialysis to remove excess small molecular weight impurities. The final protein concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm on a Nanodrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). The yields were >75 persen berdasarkan protein yang dipulihkan. Analisis SEC mendeteksi keberadaan agregat minimal dan DAR ditentukan dengan analisis LC/MS. ISAC yang dimurnikan disaring melalui filter steril 0.2 m dan disimpan pada 20 derajat hingga digunakan.HEK Reporter AssayHEK293 sel reporter yang mengekspresikan TLR7 manusia atau TLR8 manusia dibeli dari Invivogen (hub-htlr7 atau hub-htlr8) dan protokol vendor diikuti untuk propagasi dan eksperimen seluler. Secara singkat, sel-sel ditumbuhkan menjadi 80-85 persen pertemuan pada 5 persen CO2 dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS, Zeocin, dan Blasticidin. Sel kemudian diunggulkan dalam 96-pelat datar sumur pada 4x104 sel/sumur dengan substrat yang mengandung media deteksi HEK dan molekul imunostimulator. Aktivitas diukur menggunakan pembaca pelat pada panjang gelombang 620-655 nm. Analisis Biacore Protein Reseptor Fc Gamma (FCGR) yang diberi tag-Nya diperoleh dari Sistem R&D (FCGR1 (CD64, cat# 1257-FC{{23} }), FCGR2A (CD32a, cat# 1257-FC-050), FCGR2B (CD32b, cat# 1875-FC-050), FCGR3A (CD16a, cat# {{34 }}FC-050).Analisis pengikatan dilakukan pada instrumen Biacore T200 dalam buffer HBS-EP plus (GE BR100669) menggunakan chip CM5 (GE BR100530) yang mengandung antibodi anti-HIS amobil (HIS Capture kit, GE 28995056 ). Rituximab atau Rituximab-ISAC telah menyuntikkan sel aliran yang mengandung FCGR yang ditangkap atau hanya antibodi anti-Hi permukaan referensi. Data direferensikan ganda denganpermukaan anti-Nya dan injeksi buffer-only. Metode titrasi kinetik digunakan dan permukaan diregenerasi antara siklus dengan injeksi 10 mM glisin, pH 1,5. Data dicocokkan menggunakan perangkat lunak evaluasi Biacore T200 (V3.1) menggunakan kecocokan kinetik (1:1) untuk FCGR1 dan FCGR3A (rata-rata 6 run) dan afinitas kondisi mapan (1:1) untuk FCGR2A dan FCGR2B (rata-rata 3 run ).

Human Myeloid APC Isolation Myeloid APCs, which predominantly consisted of monocytes (>95%), were isolated from the whole blood of healthy donors (Stanford Blood Center) by density gradient centrifugation using a RosetteSep Human Monocyte Enrichment Cocktail (Stem Cell Technologies). Myeloid APCs were further isolated using a negative selection Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 depletion (Stem Cell Technologies) to a final purity of >90 persen sebagaimana ditentukan oleh flow cytometry berdasarkan ekspresi CD14, CD16, CD11c, dan HLA-DR. Persiapan Sel Tumor Toledo Sel Toledo (ATCC) dikultur dalam media yang direkomendasikan vendor dan dipertahankan pada kepadatan sel yang direkomendasikan vendor (ATCC). Sel dikeluarkan dari kultur, dicuci, dan disuspensikan kembali dalam PBS dengan 2 persen FBS dan 2 mM EDTA pada 1-10x106 sel/mL. Dalam beberapa kasus, sel kemudian diberi label dengan 2 M CFSE selama 2 menit dan kemudian dicuci sekali dengan RPMI-1640 (Lonza) yang dilengkapi dengan 10 persen FBS (Atlanta Biologicals) dan 100 U/mL Pena/Strep (Lonza). Sel kemudian difiksasi dalam paraformaldehida 2 persen dan dicuci tiga kali dengan PBS sebelum digunakan lebih lanjut. Pengujian Aktivasi Seluler PBMC atau monosit terisolasi masing-masing dilapisi pada sel 3x105 atau 2x105 per sumur, di pelat sumur 96-dasar datar di IMDM dilengkapi dengan 10 persen FBS (Atlanta Biologicals), 1 mM Sodium Pyruvate (Lonza), 100 M asam amino non-esensial (Lonza), dan 100 U/mL Pena/Strep (Lonza). Untuk percobaan kultur bersama monosit dan tumor, monosit dikultur dengan sel tumor alogenik tetap dengan rasio 3 banding 1. Sel kemudian diinkubasi dengan agen imunostimulator atau kontrol selama 18-36 jam pada suhu 37 derajat dengan 10 persen CO2. Aktivasi seluler diukur melalui ekspresi permukaan sel dari penanda aktivasi dan produksi sitokin. Level ekspresi penanda permukaan diukur dengan flow cytometry dengan antibodi terhadap CD40 (5C3, BD), CD86 (IT2.2, BD), HLA-DR (L243, BD), dan CD16 (3G8, BD), CD14 (MΦP9, BD), dan CD123 (7G3, BD). PBMC dianalisis dengan flow cytometry dengan antibodi terhadap penanda aktivasi yang disebutkan di atas serta penanda garis keturunan CD19 (HIB19, BD), CD56 (B159, BD), CD3 (SK7, BD), CD4 (OKT4, BioLegend), CD8 (SK1, BD) dan CD69 (FN50, BD). Dalam semua kasus, supernatan kultur sel dikumpulkan setelah inkubasi 18 atau 36-jam, dan produksi sitokin diukur menggunakan kit susunan manik sitokin (Human Inflammatory Cytokine Kit, BD Biosciences) dan ELISA (TNF Human ELISA kit, eBiosciences) .Sitometri MassaPBMC diisolasi dari darah donor yang sehat dan distimulasi dengan ISAC, campuran antibodi dan adjuvant, atau tanpa stimulus selama 5-15 menit pada suhu 37 derajat . Setelah stimulasi, sel-seldifiksasi dengan menambahkan 16 persen PFA (Ilmu mikroskop elektron) ke konsentrasi akhir 1,6 persen dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar (RT). Sel tetap dicuci dengan media pewarnaan sel (CSM; PBS dengan 0.5 persen BSA dan 0,02 persen natrium azida (semua Sigma) dan diberi kode batang menggunakan pendekatan berbasis paladium seperti yang dijelaskan sebelumnya 54. Sampel berkode digabungkan menjadi satu sampel komposit untuk pewarnaan permukaan.

Pewarnaan permukaan dilakukan dengan menambahkan antibodi (Tabel Tambahan 2) di CSM dan diinkubasi selama 3{{1{0}} menit di RT. Antibodi anti-manusia dibeli terkonjugasi (Fluidigm) atau terkonjugasi ke isotop logam berat menggunakan kit pelabelan antibodi MaxPar X8 (Fluidigm) sesuai dengan rekomendasi pabrikan. Sel-sel yang diwarnai permukaan dicuci sekali dalam CSM dan ditembus dengan MeOH selama 10 menit di atas es. Sel permeabilisasi dicuci dua kali dengan CSM dan antibodi terhadap antigen intraseluler ditambahkan selama 30 menit di RT. Sel dicuci dengan CSM dan akhirnya disuspensikan kembali dalam larutan interkalasi (1,6 persen PFA dalam PBS, 0,02 persen saponin (Sigma), dan 0,5 M iridium-intercalator (Fluidigm)) semalam pada 4 derajat. Sebelum akuisisi data, sampel dicuci sekali dalam CSM dan dua kali dalam ddH2O. Semua sampel disaring melalui saringan sel (Falcon) dan disuspensikan kembali pada 1x106 sel/mL dalam ddH2O yang dilengkapi dengan manik-manik kalibrasi empat elemen 1x EQ (Fluidigm) dan data yang diperoleh pada sitometer massa CyTOF2 (Fluidigm). Tanggapan pensinyalan dievaluasi menggunakan implementasi SPADE di Citibank 29. Analisis dijalankan pada semua sel (tanpa down-sampling), memilih jumlah klaster yang disebutkan dan menggunakan semua penanda permukaan yang relevan tetapi tidak ada penanda intraseluler untuk pengelompokan. Garis keturunan sel kekebalan dijelaskan berdasarkan pola ekspresi protein permukaan dimensi tinggi mereka. Analisis statistik dilakukan di R, lingkungan perangkat lunak statistik sumber terbuka. Dalam setiap subset sel, kelompok perlakuan, dan donor, perubahan lipatan rata-rata dihitung untuk dua puluh penanda fosfo-protein berikut: p-Src, p-STAT5, p-cMET, p-AKT, p-MAPKAPK2, p-SHP2, p -SLP76, p-IRF-7, p-ZAP70/SYK, p-CREB, p-NFKB, p-PI3K, IKB (total), p-PLCG1, p-ERK1/2, p-p38, p -BTK/ITK, p-S6, p-STAT3, dan p-JNK/SAPK. Perubahan lipatan rata-rata dibobot dengan jumlah total sel di setiap cluster, seperti yang didefinisikan berikut pengelompokan SPADE. Uji-t berpasangan dilakukan untuk memperkirakan perbedaan rata-rata perubahan lipatan, dan untuk menguji hipotesis nol bahwa tidak ada perbedaan rata-rata perubahan lipatan masing-masing penanda pada kondisi perlakuan dan kontrol.

Prosedur Eksperimental Model Tumor XenograftGaris sel tumor dibeli dari ATCC (NCI-N87, HCC1954, dan COLO205) atau AddexBio (JIMT-1) dan ditanam sesuai dengan pedoman pabrik. Sel dipanen ketika mereka mencapai 80-90 persen pertemuan dengan memisahkan dengan Accutase (Stemcell), dicuci dengan PBS, disuspensikan kembali pada 40 x 106 sel/mL dalam PBS, dan ditempatkan di atas es selama tidak lebih dari dua jam. Segera sebelum implantasi, sel-sel tersuspensi dicampur dengan volume yang sama dari Cultrex PathClear BME, Tipe 3 (Sistem R&D), dan 100 L campuran (2 x 106 sel) ditanamkan secara subkutan ke sisi kanan 6-8-minggu -tikus betina tua sebagai berikut: Sel NCI-N87 dan COLO205 ditanamkan pada tikus NSG (Jackson Laboratory), sel HCC1954 dan JIMT-1 ditanamkan pada Rag2/IL2rg double knockout (Taconic), dan HCC1954 (untuk penilaian dengan T785-ISAC) ditanamkan di NSG atauSCID/tikus krem ​​(Jackson Laboratory atau Taconic and Envigo). Ukuran tumor dicatat dua kali seminggu dan diperkirakan menggunakan rumus berikut: (panjang x lebar2)/2. Setelah tumor mencapai 50-100 mm3, biasanya dalam waktu satu minggu dari implantasi tumor, perawatan dimulai. Tikus diacak berdasarkan ukuran tumor ke dalam kelompok perlakuan sebelum perawatan awal. Trastuzumab (EirGenix; EG12014), Trastuzumab ISAC, atau Isotype ISAC disiapkan dalam PBS pada 1 mg/mL dan diberikan pada 5 mg/kg secara intraperitoneal setiap lima hari (Q5D) dengan total enam dosis. Tikus yang tumornya melebihi 2000 mm3 di-eutanasia.

Prosedur Eksperimen Penipisan Seluler HCC1954 dan MMC Untuk menguras makrofag dan sel fagositik lainnya, tikus yang mengandung tumor HCC1954 atau MMC dirawat melalui injeksi intraperitoneal dua hari sebelum pengobatan ISAC awal dengan liposom clodronate atau liposom kontrol yang tidak mengandung clodronate sebagai kontrol negatif (Encapsula, Katalog # CLD-8901) dan kemudian dirawat dua kali seminggu dengan total tiga minggu. Untuk menguras neutrofil, tikus diobati dengan antibodi penipisan 1A8 untuk menguras Ly6G plus neutrofil saja (BioXCell Catalog # BE0075-1) atau RB6-8C5 untuk menguras sel Gr1 plus, yang mencakup Ly6G plus neutrofil dan Ly6C plus sel (BioXCell Catalog # BE0075) atau kontrol isotipe 2A3 dan LTF-2 (BioXCell Catalog # BE0089 dan BE0090, masing-masing) dua hari sebelum pengobatan ISAC awal, kemudian dirawat dua kali seminggu selama tiga minggu. Penipisan sel dalam darah dikonfirmasi oleh flow cytometry (Gambar Tambahan 24). Prosedur Analisis Sitokin Tumor & mRNA Tumor ditanamkan seperti yang dijelaskan sebelumnya dan dikumpulkan untuk analisis pada titik waktu yang ditunjukkan pasca perawatan. Untuk analisis imunohistokimia dan mRNA, tumor dipecah, dan mRNA dianalisis dengan panel profil kekebalan pan-kanker tikus NanoString. Analisis data dilakukan dengan nSolver Advanced Analysis Software sesuai dengan rekomendasi pabrikan. Plot gunung berapi digambar dengan paket ggplot2 di R. Untuk mendapatkan lisat tumor untuk analisis sitokin, fragmen tumor disimpan dalam buffer yang telah dibuat sebelumnya (1 Tablet Inhibitor Protease Pierce (Thermo Fisher, Katalog #A32965) yang dilarutkan dalam 20 mL T- PER Reagen Ekstraksi Protein Jaringan, Thermo Fisher, Katalog #78510) di GentleMACS M Tubes (Miltenyi, Katalog #130-093-236) segera setelah nekropsi. Sampel tumor kemudian dipisahkan menggunakan GentleMACS Octo Dissociator. Semua sampel dipintal selama 5 menit pada 300g setelahnya. Supernatan kemudian dikumpulkan ke dalam tabung microfuge dan dipintal lagi dengan microcentrifuge. Analisis sitokin dilakukan pada supernatan dengan MSD. Imunohistokimia dilakukan menggunakan hematoxylin dan eosin untuk mengidentifikasi arsitektur jaringan, serta untuk penanda berikut yang ditunjukkan dalam penelitian: CD11c (Katalog CST #87585) dan CD8 (Katalog CST #98941).

Gambar 4: T785-ISAC menghasilkan kekebalan antitumor yang kuat pada model xenograft tumor yang resisten terhadap trastuzumab.(ad) Tikus SCID/Beige atau NSG ditanamkan dengan garis sel tumor HCC1954 dan diacak ketika volume tumor mencapai 50 – 75mm3. (a) Tikus diperlakukan sekali secara intraperitoneal (IP) dengan 5 mg/kg trastuzumab T785-ISAC atau trastuzumab, atau dengan dosis setara molar dengan campuran trastuzumab dan T785 ke ISAC melalui injeksi intratumoral (IT). Data berasal dari satu percobaan dengan n=3-5 tikus per kelompok. (b) Tikus dirawat melalui injeksi intraperitoneal dengan 5 mg/kg trastuzumab, trastuzumab-ISAC,rituximab, atau rituximab-ISAC Q5DX6 (n= 5 tikus per kelompok). (c) Tikus dirawat melalui injeksi intraperitoneal dengan 5 mg/kg trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab N297A-ISAC, atau trastuzumab TLRnull-ISAC (n=5 tikus per kelompok). ( d ) Sel tumor HCC1954 ditanamkan ke dalam tikus SCID / Beige, dan sel-sel yang diinginkan habis sebelum dan selama pengobatan trastuzumab T785-ISAC (5 mg/kg, Q5DX3) menggunakan antibodi anti-Ly6G (kontrol IgG2a tikus) , liposom clodronate (kontrol liposom sebagai kontrol) atau antibodi anti-Gr1 (kontrol IgG2b tikus). Data berasal dari satu percobaan dengan n=4-6 tikus per kelompok. ( e , f ) tikus knockout ganda NSG atau Rag2 / IL2rg ditanamkan dengan garis sel tumor JIMT -1 dan diacak ketika volume tumor mencapai 50 - 75 mm3. Tikus kemudian diobati dengan perawatan yang ditunjukkan pada 5 mg / kg secara intraperitoneal dengan frekuensi (e) Q5DX6atau (f) Q5DX5 (n=3-6 tikus per kelompok). (bf) Data yang ditampilkan mewakili setidaknya dua percobaan. (gj) Tumor HCC-1954 dipanen dari kohort tikus pada titik waktu yang ditunjukkan setelah pengobatan dengan dosis tunggal 5 mg/kg ISAC atau antibodi kontrol. Tumor diproses untuk analisis flow cytometry, kuantifikasi mRNA NanoString, atau formalin-fixed dan paraffin-embedded untuk imunohistokimia. ( g ) Plot gunung berapi menggambarkan perubahan log2 kali lipat dari ekspresi gen pada tumor kontrol vs isotipe yang diobati yang diukur dengan NanoString pada 24 jam (n=5 tikus per kelompok). Perubahan dengan nilai p yang disesuaikan < 0.05="" ditampilkan="" dalam="" warna="" merah.="" (h)="" skor="" tanda="" tangan="" gen="" yang="" diukur="" dengan="" nsolver="" advanced="" analysis="" pathway="" score="" untuk="" tumor="" yang="" dianalisis="" 24="" jam="" setelah="" pengobatan="" (n="5" tikus="" per="" kelompok).="" (i)="" analisis="" aliran="" sitometri="" dari="" komposisi="" seluler="" tumor="" 24="" jam="" dan="" 7="" hari="" setelah="" pengobatan="" (n="2-4" tikus="" per="" kelompok).="" data="" mewakili="" setidaknya="" 2="" percobaan.="" (j)="" gambar="" representatif="" serta="" kuantifikasi="" f4/80="" dan="" cd11c="" ihc="" tumor="" dipanen="" 9="" hari="" setelah="" setiap="" pengobatan="" yang="" ditunjukkan.="" bilah="" skala="" adalah="" 50="" m.="" (aj)="" data="" ditampilkan="" sebagai="" mean="" dengan="" sem="" dan="" statistik="" ditampilkan="" dengan=""><0.05,><0.01,><0.001,><>

Prosedur Eksperimen Model Tumor Syngeneic Sel MMC diperoleh dari Dr. Disis (University of Washington) dan dikultur dalam RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 20 persen FBS, 1 persen penisilin-streptomisin, dan L-glutamin pada 37 derajat dan 5 persen CO2 sampai {{8 }} persen konfluen. Sel CT26 (ATCC) yang ditransfeksi untuk mengekspresikan protein HER2 tikus secara stabil ditanam di RPMI 1640 yang dilengkapi dengan 10 persen FBS dan 600 ug/mL antibiotik selektif G418 (Thermo) pada 37 derajat dan 5 persen CO2 hingga 80-90 persen konfluen. Setelah cukup konfluen, sel dipanen dengan memisahkan dengan Accutase (Stemcell) dan mencuci dengan PBS. Sel yang dipanen disuspensi ulang pada 20 x 106 sel/mL (MMC)atau 5 x 106 sel/mL (CT26-rHER2) dalam PBS dan disimpan pada suhu 4 derajat /di atas es sampai digunakan. 100 Lsel tersuspensi ditanamkan secara subkutan ke dalam 6-8-FVB/N-TgN(MMTV- Erbb2) NK1Mul/Jmice (model MMC, The Jackson Laboratory) atau tikus BALB/c betina (model CT26, The Jackson Laboratory) . Ukuran tumor diukur dan dicatat dua kaliseminggu selama penelitian berlangsung. Volume tumor diperkirakan menggunakan rumus berikut: (panjang x lebar2)/2. Setelah tumor mencapai 200-500 mm3 (MMC) atau 50-100 mm3 (CT26-rHER2), biasanya dalam waktu satu minggu dari implantasi tumor, perawatan dimulai. Tikus diacak berdasarkan ukuran tumor ke dalam kelompok perlakuan sebelumperlakuan. Anti-rHER2 mAb (BioXCell; 7.16.4) atau anti-rHER2-ISAC diberikan secara intraperitoneal (frekuensi seperti yang ditunjukkan pada gambar legenda) selama penelitian.Tikus yang tumornya melebihi 2000 mm3 di-eutanasia. Penipisan sel T dinilaipada hewan yang menggunakan CD4 (BioXCell; GK1.5) atau CD8 (BioXCell; YTS 169.4) antibodi penipisan sel. Penipisan dimulai sebelum implantasi tumor dan dilanjutkan dengan pemberian 200 ug per antibodi dua kali seminggu. Untuk tantangan tumor, garis sel CT26 dan 4T1 ditanamkan pada 5 x 106 sel per garis tumor, dan tikus naif tumor ditantang dengan kedua garis sel sebagai kontrol.

Bahan Tambahan Lihat versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan. Ucapan Terima Kasih: Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada P. Basto, NE Reticker-Flynn, T. Prestwood, dan B. Mallet atas diskusi mereka yang bermanfaat. Kami juga berterima kasih kepada Stanford Blood Center Flow Cytometry Core, khususnya L. Tolentino, O. Choi, dan N.Wu. Kami juga menyampaikan penghargaan kami kepada Dr. Mary L. (Nora) Disis dan Denise Cecil dari University of Washington yang menyediakan lini sel tumor MMC.

Pendanaan: SE Ackerman didukung oleh Stanford BioX Bowes Fellowship.

Referensi:1. Davis TA dkk. Terapi antibodi monoklonal anti-CD20 Rituximab pada limfoma non-Hodgkin: keamanan dan kemanjuran pengobatan ulang. J Clin Oncol 18, 3135–3143, doi:10.1200/JCO.2000.18.17.3135 (2000). [PubMed: 10963642]2. Grillo-Lopez AJ dkk. Rituximab: antibodi monoklonal pertama yang disetujui untuk pengobatan limfoma. Curr Pharm Biotechnol 1, 1–9 (2000). [PubMed: 11467356]3. Lizotte PH dkk. Profil multiparametrik dari kanker paru-paru non-sel kecil mengungkapkan imunofenotipe yang berbeda IHSG Insight 1, e89014, doi:10.1172/jci.insight.89014 (2016). [PubMed: 27699239]4. Spranger S dkk. Kepadatan antigen imunogenik tidak menjelaskan ada atau tidak adanya lingkungan mikro tumor yang meradang sel-T pada melanoma. Proc Natl Acad Sci USA 113, E7759– E7768, doi:10.1073/pnas.1609376113 (2016). [PubMed: 27837020]5. Beatty GL & Gladney WL Mekanisme pelarian kekebalan sebagai panduan untuk imunoterapi kanker. Clin Cancer Res 21, 687–692, doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-1860 (2015). [PubMed: 25501578]6. Fridman WH, Halaman F, Salutes-Fridman C & Galon J Konteks imun pada tumor manusia: dampak pada hasil klinis. Nat Rev Cancer 12, 298–306, doi:10.1038/nrc3245 (2012). [PubMed: 22419253]

7. Galon J & Bruni D Pendekatan untuk mengobati tumor imun panas, berubah, dan dingin dengan imunoterapi kombinasi. Nat Rev Drug Discov 18, 197–218, doi:10.1038/s41573-018-0007-y (2019). [PubMed: 30610226]8. Gabrilovich DI, Ostrand-Rosenberg S & Bronte V Regulasi terkoordinasi sel myeloid oleh tumor. Nat Rev Immunol 12, 253–268, doi:10.1038/nri3175 (2012). [PubMed: 22437938]9. Pengecualian sel T Joyce JA & Fearon DT, hak istimewa kekebalan, dan lingkungan mikro tumor. Sains 348, 74–80, doi:10.1126/science.aaa6204 (2015). [PubMed: 25838376]10.Carmi Y et al. Akt dan SHP-1 adalah pos pemeriksaan intrinsik DC untuk kekebalan tumor. IHSG Insight 1, e89020, doi:10.1172/jci.insight.89020 (2016). [PubMed: 27812544]11. Carmi Y dkk. IgG alogenik yang dikombinasikan dengan rangsangan sel dendritik menginduksi kekebalan sel T antitumor. Alam 521, 99-104, doi:10.1038/nature14424 (2015). [PubMed: 25924063]12. Allen BM dkk. Disfungsi sistemik dan plastisitas lingkungan mikro imun pada model kanker. Nat Med 26, 1125–1134, doi:10.1038/s41591-020-0892-6 (2020). [PubMed: 32451499]13. Sagiv-Barfi I et al. Pemberantasan keganasan spontan dengan imunoterapi lokal. Sci Transl Med 10, doi:10.1126/scitranslmed.aan4488 (2018).14. Spitzer MH dkk. Kekebalan Sistemik Diperlukan untuk Imunoterapi Kanker yang Efektif. Sel 168, 487–502 e415, doi:10.1016/j.cell.2016.12.022 (2017). [PubMed: 28111070]15. Milhem Mohammed M., Theresa Medina RG, Kirkwood John M., Buchbinder Elizabeth, Mehmi Inderjit, Niu Jiaxin, Shaheen Montaser, Weight Ryan, Margolin Kim, Luke Jason, Morris Aaron, Mauro David, Krieg Arthur M., Ribas Antoni CT{ {77}}Agonist reseptor seperti tol intratumoral (TLR9), CMP-001, dalam kombinasi dengan pembrolizumab dapat membalikkan resistensi terhadap penghambatan PD-1 dalam uji coba fase 1b pada subjek dengan melanoma lanjut (Pertemuan Tahunan AACR 2018, 2018).16. Benteng AH Keindahan agonis TLR untuk CTCL. Darah 119, 321–322, doi:10.1182/ darah-2011-11-391243 (2012). [PubMed: 22247516]17. Singh M dkk. Imunitas anti-melanoma bawaan dan adaptif yang efektif melalui aktivasi TLR7/8 lokal. J Immunol 193, 4722–4731, doi:10.4049/J Immunol.1401160 (2014). [PubMed:25252955]18. Zhao BG, Vasilakos JP, Tross D, Smirnov D & Klinman DM Terapi kombinasi yang menargetkan reseptor seperti tol 7, 8, dan 9 menghilangkan tumor besar yang sudah terbentuk. J Immunother Cancer 2, 12, doi:10.1186/2051-1426-2-12 (2014). [PubMed: 24982761]19. Jurk M dkk. TLR7 atau TLR8 manusia secara independen memberikan respons terhadap senyawa antivirus R-848. Nat Immunol 3, 499, doi:10.1038/ni0602-499 (2002). [PubMed: 12032557]20. Chattergoon MA dkk. HIV dan HCV mengaktifkan inflammasome dalam monosit dan makrofag melalui reseptor seperti Toll endosom tanpa induksi interferon tipe 1. PLoS Pathog 10, e1004082, doi:10.1371/journal.bat.1004082 (2014). [PubMed: 24788318]21. Eigenbrod T, Pelka K, Latz E, Kreikemeyer B & Dalpke AH TLR8 Merasakan RNA Bakteri dalam Monosit Manusia dan Memainkan Peran yang Tidak Berlebihan untuk Pengenalan Streptococcus pyogenes. J Immunol 195, 1092–1099, doi:10.4049/J Immunol.1403173 (2015). [PubMed: 26101323]22. Mattson G dkk. Sebuah pendekatan praktis untuk crosslinking. Mol Biol Rep 17, 167–183 (1993). [PubMed: 8326953]23. Gabay C, Ben-Bassat H, Schlesinger M & Laskov R Mutasi somatik dan variasi intraklonal dalam gen Vkappa yang diatur ulang dari garis sel limfoma B-non-Hodgkin. Eur J Haematol 63, 180–191, doi:10.1111/j.1600-0609.1999.tb01766.x (1999). [PubMed: 10485273]24. Alonso MN dkk. Sel T(H)1, T(H)2, dan T(H)17 menginstruksikan monosit untuk berdiferensiasi menjadi subset sel dendritik khusus. Darah 118, 3311–3320, doi:10.1182/darah-2011-03-341065 (2011). [PubMed: 21813450]25. Clarke SR dkk. Karakterisasi garis transgenik TCR spesifik ovalbumin OT-I: elemen MHC untuk seleksi positif dan negatif. Immunol Cell Biol 78, 110–117, doi:10.1046/ j.1440-1711.2000.00889.x (2000). [PubMed: 10762410]26. Zehn D, Lee SY & Bevan MJ Menyelesaikan tetapi respon sel T terbatas terhadap antigen afinitas sangat rendah. Alam 458, 211–214, doi:10.1038/nature07657 (2009). [PubMed: 19182777]27. Kondratova M dkk. Peta jaringan pensinyalan multiskala dari respons imun bawaan pada kanker mengungkapkan tanda tangan heterogenitas sel Nat Commun 10, 4808, doi:10.1038/s41467-019-12270-x (2019). [PubMed: 31641119]

28. Bendall SC dkk. Sitometri massa sel tunggal dari respons imun dan obat yang berbeda di seluruh kontinum hematopoietik manusia. Sains 332, 687–696, doi:10.1126/science.1198704 (2011).[PubMed: 21551058]29. Qiu P dkk. Mengekstrak hierarki seluler dari data sitometri dimensi tinggi dengan SPADE. Nat Biotechnol 29, 886–891, doi:10.1038/nbt.1991 (2011). [PubMed: 21964415]30. Sinyal TLR Kawai T & Akira S. Kematian Sel Berbeda 13, 816–825, doi:10.1038/sj.cdd.4401850 (2006). [PubMed: 16410796]31.Sanchez-Mejorada G & Rosales C Transduksi sinyal oleh reseptor imunoglobulin Fc. J Leukoc Biol 63, 521–533 (1998). [PubMed: 9581795]32. Krishnaswamy S dkk. Biologi sistem. Analisis berbasis kepadatan bersyarat dari pensinyalan sel T dalam data sel tunggal. Sains 346, 1250689, doi:10.1126/science.1250689 (2014). [PubMed: 25342659]33. Kiefer F dkk. Protein Syk tirosin kinase sangat penting untuk pensinyalan reseptor Fcgamma di makrofag dan neutrofil. Sel Mol Biol 18, 4209–4220 (1998). [PubMed: 9632805]34. Braselmann S dkk. R406, penghambat tirosin kinase limpa yang tersedia secara oral memblokir pensinyalan reseptor Fc dan mengurangi peradangan yang dimediasi kompleks imun. J Pharmacol Exp Ada 319, 998– 1008, doi:10.1124/jpet.106.109058 (2006). [PubMed: 16946104]35. Bruhns P et al. Spesifisitas dan afinitas reseptor Fcgamma manusia dan varian polimorfiknya untuk subkelas IgG manusia. Darah 113, 3716–3725, doi:10.1182/darah-2008-09-179754 (2009). [PubMed: 19018092]36. Nimmerjahn F & Ravetch JV Aktivitas subkelas imunoglobulin g divergen melalui pengikatan reseptor Fc selektif. Sains 310, 1510–1512, doi:10.1126/science.1118948 (2005). [PubMed: 16322460]37. Jefferis R Terapi antibodi rekombinan: dampak glikosilasi pada mekanisme aksi. Trends Pharmacol Sci 30, 356–362, doi:10.1016/j.tips.2009.04.007 (2009). [PubMed: 19552968]38. Tanji H, Ohio U, Shibata T, Miyake K & Shimizu T Reorganisasi struktural dari reseptor 8 dimer seperti Toll yang diinduksi oleh ligan agonistik. Sains 339, 1426–1429, doi:10.1126/ sains.1229159 (2013). [PubMed: 23520111]39. Shultz LD dkk. Perkembangan sel limfoid dan myeloid manusia pada tikus gamma null NOD / LtSz-kata IL2R yang dicangkokkan dengan sel induk hemopoietik manusia yang dimobilisasi. J Immunol 174, 6477–6489, doi:10.4049/J Immunol.174.10.6477 (2005). [PubMed: 15879151]40. Xia Z dkk. Respon imun bawaan terhadap implantasi sel fibroblastik sumsum tulang manusia pada tikus CB17 SCID / krem. J Cell Biochem 98, 966–980, doi:10.1002/jcb.20730 (2006). [PubMed: 16795075]41. Tanner M et al. Karakterisasi garis sel baru yang dibuat dari pasien dengan kanker payudara yang resisten terhadap Herceptin. Kanker Mol Ada 3, 1585-1592 (2004). [PubMed: 15634652]42.Luque-Cabal M, Garcia-Teijido P, Fernandez-Perez Y, Sanchez-Lorenzo L & Palacio-Vazquez I Mekanisme di Balik Resistensi terhadap Trastuzumab pada DIA2-Kanker Payudara yang Diperkuat dan Strategi Mengatasinya Dia. Clin Med Insights Oncol 10, 21–30, doi:10.4137/CMO.S34537 (2016). [PubMed: 27042153]43. Li JY dkk. HE Biparatopik2-Target Antibodi-Obat Konjugat Menginduksi Regresi Tumor pada Model Primer Refractory atau Tidak Memenuhi Syarat untuk DIA2-Terapi Bertarget. Sel Kanker 29, 117– 129, doi:10.1016/j.ccell.2015.12.008 (2016). [PubMed: 26766593]44. Ning S, Pagano JS & Barber GN IRF7: aktivasi, regulasi, modifikasi, dan fungsi. Gen Imun 12, 399–414, doi:10.1038/gen.2011.21 (2011). [PubMed: 21490621]45. CaoQ dkk. Ginjal F4/80 plus CD11c plus fagosit mononuklear menampilkan karakteristik fenotipik dan fungsional makrofag dalam kesehatan dan nefropati adriamycin. J Am Soc Nephrol 26, 349–363, doi:10.1681/ASN.2013121336 (2015). [PubMed: 25012165]46. Sheng J dkk. Subset Diskrit Sel Turunan Monosit di antara Sel Dendritik Tipe 2 Konvensional Khas Dapat Secara Efisien Cross-Present. Perwakilan Sel 21, 1203–1214, doi:10.1016/ j.celrep.2017.10.024 (2017). [PubMed: 29091760]

47. Knutson KL, Almand B, Dang Y & Disis ML varian antigen-negatif Neu dapat dihasilkan setelah terapi antibodi spesifik-neu pada tikus transgenik neu. Kanker Res 64, 1146-1151 (2004). [PubMed: 14871850]48. Moynihan KD dkk. Pemberantasan tumor besar pada tikus dengan kombinasi imunoterapi yang melibatkan respons imun bawaan dan adaptif. Nat Med 22, 1402–1410, doi:10.1038/nm.4200 (2016). [PubMed: 27775706]49.Siebenlist U, Franzoso G & Brown K Struktur, regulasi dan fungsi NF-kappa B. Annu Rev Cell Biol 10, 405–455, doi:10.1146/annurev.cb.10.110194.002201 (1994) . [PubMed: 7888182]

Gambar 6: CL264-yang mengandung ISAC menghasilkan pembersihan tumor dalam media HER2 yang mengekspresikan xenografts dan pembersihan tumor yang dimediasi sel T, memori imunologis, dan penyebaran epitop dalam model tumor syngeneic. (a) Struktur kimia bahan pembantu T785 dan CL264 yang digunakan untuk pembangkitan ISAC. ( b ) tikus NSG yang ditanamkan dengan garis sel tumor HCC1954 diacak ketika volume tumor mencapai 50 - 75 mm3. Tikus diperlakukan sekali melalui injeksi intraperitoneal trastuzumab 5 mg/kg, trastuzumab T785-ISAC atau trastuzumab CL264-ISAC. Tumor dipanen 20 jam setelah pemberian, diproses menjadi suspensi sel tunggal, dan dianalisis dengan flow cytometry untuk menilai aktivasi APC myeloid yang menginfiltrasi tumor. (cd) Tikus knockout ganda NSG atau Rag2/IL2rg ditanamkan dengan garis sel tumor manusia yang ditunjukkan dan diacak ketika volume tumor mencapai 50 – 75 mm3 (HCC1954) atau 75 – 150 mm3 (JIMT-1). Tikus diperlakukan melalui injeksi intraperitoneal dengan 5 mg/kg rituximab, trastuzumab, trastuzumab T785-ISAC, trastuzumab CL264-ISAC atau isotipe masing-masing.ISAC, setiap 5 hari dengan total 6 perawatan. (e) ekspresi rHER2 diukur pada sel tumor CT26-rHER2 dalam kultur sebelum implantasi (plot aliran kiri) dan pada tumor sembilan hari pasca-implantasi (plot aliran kanan) dengan sitometri aliran dengan antibodi anti-rHER2 terkonjugasi fluoresen (merah) atau kontrol isotipe (biru). (f) Tikus Balb/c ditanamkan dengan garis sel tumor CT26-rHER2 dan diacak ketika volume tumor mencapai 50mm3. Tikus kemudian dirawat melalui injeksi intraperitoneal dengan 10 mg/kg tikus anti-tikusHER2 atau anti-tikus HER2 CL264-ISAC setiap 5 hari dengan total 6 perawatan. Data yang ditampilkan berasal dari 1 percobaan dengan 8 tikus per lengan dan mewakili 3 percobaan.

(g) Anti-rat HER2 CL264-ISAC treated mice that experienced complete tumor regression for >21 hari setelah pengobatan terakhir mereka ditantang dengan CT26 induk (sayap kiri) dan garis sel 4T1 (sayap kanan), dengan atau tanpa penipisan sel T CD4 dan CD8 (masing-masing n =3). Tikus naif tumor (n=6) yang ditantang dengan garis sel induk CT26 dan 4T1 dimasukkan sebagai kontrol. (ai) Data ditampilkan dari eksperimen individu dengan 3-6 tikus per lengan dan mewakili eksperimen 1-4 dengan minimal 3 tikus per lengan di setiap eksperimen. Data ditampilkan sebagai mean dengan SEM dan statistik ditampilkan dengan *P<><0.01,><0.001, and=""><>

50. Vogelpoel LT dkk. FcgammaRIIa cross-talk dengan TLRs, IL-1R, dan IFNgammaR secara selektif memodulasi produksi sitokin dalam sel myeloid manusia. Imunobiologi 220, 193–199, doi:10.1016/j.imbio.2014.07.016 (2015). [PubMed: 25108563]51. Daley JM, Thomas AA, Connolly MD, Reichner JS & Albina JE Penggunaan antibodi monoklonal spesifik Ly6G untuk menguras neutrofil pada tikus. J Leukoc Biol 83, 64–70, doi:10.1189/ jlb.0407247 (2008). [PubMed: 17884993]52. Broz ML dkk. Membedah Kompartemen Myeloid Tumor Mengungkapkan Sel Penyaji Antigen Pengaktifan Langka yang Penting untuk Kekebalan Sel T. Sel Kanker 26, 938, doi:10.1016/ j.ccell.2014.11.010 (2014).53. Spranger S, Dai D, Horton B & Gajewski TF Sel Dendritik Batf3 yang Berada di Tumor Diperlukan untuk Perdagangan Sel T Efektor dan Terapi Sel T Adopsi. Sel Kanker 31, 711–723 e714, doi:10.1016/j.ccell.2017.04.003 (2017). [PubMed: 28486109]54. Zunder ER dkk. Barcoding sel tag massal berbasis paladium dengan skema penyaringan ganda dan algoritma dekonvolusi sel tunggal. Nat Protoc 10, 316–333, doi:10.1038/nprot.2015.020 (2015). [PubMed: 25612231]