Deposisi Serum Amyloid P Adalah Fitur Sensitif Dan Spesifik Glomerulopati Seperti Membran Dengan Deposit Kappa IgG Bertopeng

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Christopher P. Larsen1, Shree G. Sharma1, Tiffany N. Caza1, Daniel J. Kenan1, Aaron J. Storey2, Ricky D. Edmondson2, Christian Herzog2, dan John M. Arthur2

KATA KUNCI:glomerulonefritis; deposito bertopeng; spektrometri massa; glomerulopati seperti membran; deposit subepitel

Cistanche dapat meningkatkan fungsi ginjal

Glomerulopati mirip membran dengan deposit kappa IgG bertopeng (MGMID) adalah pola glomerulonefritis yang baru-baru ini dijelaskan dengan histopatologi yang unik. Pola ini ditandai dengan subepitel dan/atau mesangialimundeposit yang "bertopeng", untuk pewarnaan imunoglobulin dengan imunofluoresensi rutin tetapi sangat diwarnai untuk IgG dan rantai ringan kappa setelah pencernaan protease. Pasien dengan pola glomerulonefritis ini paling sering adalah wanita muda dengan proteinuria dan riwayat penyakit autoimun yang tidak jelas seperti antibodi antinuklear titer rendah. Di sini kami membandingkan profil spektrometri massa dari tangkapan laser glomeruli mikrodiseksi dari sembilan biopsi ginjal MGMID dengan delapan biopsi yang menunjukkan pola glomerulopati membranosa lainnya. Protein yang paling signifikan meningkat pada MGMID adalah serum amyloid P. Immunostaining menunjukkan serum amyloid P berkolokasi dengan IgG di glomeruli MGMID tetapi tidak dengan glomerulopati membran terkait PLA2R. Serum amiloid P positif pada glomeruli dari semua 32 biopsi MGMID tetapi negatif pada biopsi jenis glomerulopati membranosa lainnya seperti yang terkait dengan PLA2R dan THSD7A. Ada empat biopsi dengan pewarnaan amiloid P serum glomerulus di antara 173 biopsi yang tidak memenuhi kriteria untuk MGMID atau amiloidosis. Keempat biopsi ini dengan pewarnaan serum amiloid P positif memiliki pola membranosa glomerulopati dengan deposit kappa IgG yang hanya berbeda dari MGMID dengan tidak adanya "masking". Dengan demikian, pewarnaan positif dalam endapan glomerulus untuk serum amiloid P mengidentifikasi bentuk unik glomerulonefritis yang kemungkinan memiliki mekanisme patofisiologi penyakit yang sama.

Glomerulopati mirip membran dengan deposit IgG kappa bertopeng (MGMID) adalah pola histopatologi glomerulonefritis yang dijelaskan pada tahun 2014, yang merupakan deskripsi pertama dari apa yang disebut deposit glomerulus bertopeng.1 Karakteristik histopatologi penyakit ini meliputi adanya mesangial dan subepitel deposit dengan restriksi IgG kappa. Anehnya, meskipun pewarnaan komponen komplemen 3 (C3) sering terbukti dengan imunofluoresensi rutin pada jaringan beku, pewarnaan Ig sering menutupi, yang berarti menunjukkan pewarnaan negatif palsu dengan imunofluoresensi rutin tetapi pewarnaan positif ketika diulang pada jaringan tertanam parafin setelah pencernaan protease. Jadi, kecuali ahli patologi mempertahankan indeks kecurigaan yang tinggi untuk entitas ini, itu bisa salah didiagnosis sebagai glomerulopati C3. Entitas lain yang telah dijelaskan untuk menunjukkan fenomena penyembunyian ini dalam endapan glomerulus termasuk glomerulonefritis membranoproliferatif dengan endapan Ig monotip bertopeng dan glomerulonefritis cryoglobulinemic.2,3

Pasien yang ditemukan memiliki MGMID pada biopsi paling sering adalah wanita muda<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 persen) negatif untuk Ig monoklonal dengan elektroforesis protein serum, dan tidak ada kasus yang terlihat terkait dengan keganasan hematologi yang mendasarinya.4

Dihipotesiskan bahwa temuan klinikopatologis bersama di antara pasien MGMID mungkin menunjukkan mekanisme patofisiologi molekuler umum yang mendorong penyakit mereka. Niat kami dalam pelaporan pertama entitas ini adalah untuk menentukan kohort untuk analisis lebih lanjut.1 Kami menjelaskan di sini keberadaan komponen serum amiloid p (SAP) yang ditemukan secara unik dalam endapan glomeruli MGMID. Imunostaining untuk SAP dalam deposit glomerulus adalah teknik yang sensitif dan spesifik untuk diagnosis MGMID yang juga memberikan wawasan patogen.

Gambar 1|Serum amyloid P-component (SAP) secara signifikan diperkaya dalam glomeruli mikrodiseksi dari pasien dengan glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG bertopeng. Nilai kuantifikasi absolut berbasis intensitas yang dinormalisasi dari MaxQuant (Institut Biokimia Max Planck, Planegg, Jerman) digunakan untuk analisis statistik. Garis putus-putus menggambarkan cutoff heuristik untuk perubahan lipatan dan nilai-P. ( a ) Plot gunung berapi yang membandingkan 3 reseptor fosfolipase A2 (PLA2R) – kasus membran positif dengan yang lain mengidentifikasi 2 protein yang merupakan outlier yang jelas di kuadran kanan atas. ( B ) Plot gunung berapi yang membandingkan 2 kasus membran positif yang mengandung domain 7A (THSD7A) tipe 1 trombospondin tipe 1 dengan yang lain mengidentifikasi 2 protein yang merupakan outlier yang jelas dengan THSD7A yang menunjukkan perubahan lipatan terbesar. (c) Plot gunung berapi yang membandingkan sampel glomerulopati mirip membran dengan deposit kappa IgG bertopeng dengan semua jenis kasus membran lainnya mengidentifikasi 6 protein yang merupakan outlier yang jelas di kuadran kanan atas. C6, pelengkap komponen 6; C7, pelengkap komponen 7; CFHR1, melengkapi protein terkait faktor H 1; HP1BP3, protein pengikat 1 heterokromatin protein 3; HPRT1, hipoksantin fosforibosiltransferase 1; IGHG3, Ig gamma konstanta berat 3.

HASIL

Spektrometri massa glomeruli mikrodiseksi yang ditangkap dengan laser

Analisis spektrometri massa glomeruli microdissected laser-capture dari 9 kasus MGMID dibandingkan dengan 8 kasus membranous glomerulopathy (MG) termasuk 3 kasus reseptor phospholipase A2 (PLA2R)-positif MG, 2 kasus trombospondin tipe 1 domain yang mengandung 7A ( THSD7A) – MG positif, dan 3 kasus lupus MG. Sebanyak 1695 protein diidentifikasi dalam analisis ini. Analisis bukti prinsip dilakukan untuk menguji apakah protein yang terlibat dalam patogenesis penyakit MG dapat dideteksi dengan spektrometri massa. Untuk setiap jenis membran yang diketahui, kelimpahan diferensial protein dibandingkan dengan kelompok yang tersisa menggunakan nilai kuantifikasi absolut berbasis intensitas (iBAQ) yang dinormalisasi. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan uji-t Welch, dan hasilnya divisualisasikan pada plot gunung berapi. PLA2R secara signifikan lebih berlimpah dalam kasus MG terkait PLA2R dan menunjukkan perubahan lipatan terkuat (Gambar 1a). THSD7A menampilkan perubahan lipatan terkuat pada MG terkait THSD7A, meskipun dengan nilai P yang lebih besar karena ukuran sampel yang rendah dalam grup ini (n 2; Gambar 1b). Secara keseluruhan, analisis bukti prinsip ini menunjukkan bahwa spektrometri massa glomeruli mikrodiseksi laser-capture dapat mengidentifikasi protein yang signifikan terhadap patogenesis penyakit pada glomerulopati membranosa.

Kami selanjutnya berusaha mengidentifikasi protein yang berpotensi terlibat dalam patogenesis MGMID menggunakan pendekatan ini. Sebanyak 6 protein secara signifikan lebih berlimpah dalam sampel MGMID relatif terhadap kelompok lain (Tabel 1). Protein dengan perubahan lipatan tertinggi adalah SAP (Gambar 1c). Protein yang tersisa terdiri dari IgG Kappa, 3 protein komplemen, dan protein heterokromatin 1-binding protein 3 (HP1BP3). SAP dianggap sebagai kandidat teratas karena terdeteksi di semua sampel MGMID dan menunjukkan perbedaan terbesar dalam kelimpahan relatif terhadap sampel non-MGMID. Semua Ig yang diidentifikasi dengan spektrometri massa dalam glomeruli mikrodiseksi laser-capture dari kasus glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1. Hitungan spektral dengan mengambil sampel semua protein yang menunjukkan peningkatan kelimpahan $1 log2 dalam sampel MGMID dan nilai-P #0.1 ditunjukkan pada Tabel Tambahan S2.

Bentengdapat meningkatkanginjalfungsi

Pewarnaan SAP dalam kasus glomerulopati seperti membran

Antibodi kelinci poliklonal terhadap protein SAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) menunjukkan pewarnaan positif yang kuat di sepanjang membran basal glomerulus kasus dengan MGMID yang berkolokasi dengan IgG dengan analisis confocal. SAP tidak menunjukkan kolokalisasi dengan IgG di glomeruli dari MG terkait PLA2R (Gambar 2). Antibodi kelinci poliklonal terhadap HP1BP3 diuji dalam 4 biopsi dengan MGMID dan menunjukkan pewarnaan negatif pada endapan glomerulus dari semua 4 kasus.

Pewarnaan SAP dilakukan pada total 211ginjalbiopsidengan glomerulonefritis (Tabel 2). Sebanyak 36 kasus dengan deposit tipe imun bernoda positif untuk SAP. Semua kasus yang bernoda positif memiliki ciri histopatologi tertentu termasuk adanya deposit mesangial dan subepitel dengan restriksi IgG kappa dan tidak ada perubahan endokapiler atau membranoproliferatif dengan mikroskop cahaya. SAP negatif dalam semua kasus, dengan deposit bertopeng yang bukan MGMID, termasuk 3 kasus glomerulonefritis cryoglobulinemic dan 3 kasus glomerulonefritis membranoproliferatif bertopeng. Itu juga negatif di semua 19 kasus glomerulonefritis proliferatif dengan deposit Ig monoklonal (PGNMID), termasuk kasus dengan IgG1 kappa (4 kasus), IgG2 lambda (1 kasus), IgG 3 kappa (8 kasus), dan IgG3 lambda (6 kasus). ). Semua 30 kasus glomerulopati membran poliklonal (PLA2R, THSD7A, lupus, dan segmental) negatif untuk SAP. Bentuk tambahan glomerulonefritis juga dipelajari dan hasilnya negatif. Di antara glomerulonefritis terkait infeksi, ada 7 positif untuk pewarnaan IgG dan 6 yang memiliki bukti deposit punuk subepitel. Seperti yang diharapkan, semua 6 kasus amiloidosis menunjukkan pewarnaan positif pada endapan amiloid. Namun, pola deposisi yang kotor sangat kontras dengan pewarnaan granular yang ada dalam kasus MGMID. Fotomikrograf representatif glomeruli pada pewarnaan SAP dari berbagai penyakit ginjal yang berbeda ditunjukkan pada Gambar Tambahan S1.

Semua 32 kasus yang sebelumnya diidentifikasi sebagai MGMID positif untuk SAP. Selain itu, ada pewarnaan positif SAP di glomeruli dari 4 dari 25 kasus glomerulopati membranosa dengan deposisi IgG monotip yang tidak menutupi secara rutin.

imunofluoresensi, termasuk 4 dari 13 kasus dengan IgG1 kappa, 0 dari 2 kasus dengan IgG1 lambda, 0 dari 5 kasus dengan IgG2 kappa, 0 dari 4 kasus dengan IgG3 kappa, dan {{ 12}} dari 1 kasus dengan IgG4 kappa. Secara keseluruhan, 32 dari 36 (89 persen) glomerulopati SAP-positif tertutup dan sesuai dengan kategori MGMID, sedangkan 4 dari 36 (11 persen) lainnya tidak tertutup dan didiagnosis sebagai MG dengan deposit kappa IgG1. Pasien dengan glomerulopati membranosa monotipik yang tidak menutupi tetapi positif SAP memiliki usia rata-rata 33 tahun, dengan rasio wanita-pria 4:0. Kasus dengan glomerulopati membranosa monotipik yang tidak menutupi tetapi negatif untuk SAP memiliki usia rata-rata 59,3 tahun dengan rasio wanita-pria 15:4.

Tabel 1|Protein meningkat secara signifikan di glomeruli pasien denganglomerulopati seperti membranosadengan deposit kappa IgG bertopeng, seperti yang ditunjukkan oleh spektrometri massa

Reaktivitas serum terhadap SAP

Sera dari 22 pasien dengan MGMID, 12 dengan glomerulopati membran positif PLA2R, dan 6 kontrol normal diuji untuk reaktivitas IgG terhadap SAP dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Meskipun beberapa variabilitas ada di antara pasien di setiap kelompok, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam reaktivitas IgG terhadap SAP antara kelompok (Tambahan Gambar S2).

Gambar 2|Kolokalisasi IgG dan serum amyloid P-component (SAP). ( a - c ) Eksperimen imunofluoresensi yang dilakukan pada sampel biopsi ginjal dari pasien yang didiagnosis dengan glomerulopati mirip membran dengan deposit kappa IgG bertopeng menunjukkan pewarnaan membran basal glomerulus granular untuk (a) SAP dan (b) IgG. (c) Terdapat kolokalisasi SAP dan IgG yang kuat pada deposit membran basal glomerulus. (d–f) Eksperimen imunofluoresensi yang dilakukan pada sampel biopsi ginjal dari pasien dengan 3 glomerulopati membran positif reseptor fosfolipase A2 menunjukkan (d) pewarnaan membran basal glomerulus negatif untuk SAP dan (e) pewarnaan membran basal glomerulus granular positif untuk IgG. (f) Ada kurangnya kolokalisasi pada pasien ini dengan 3 glomerulopati membran terkait reseptor fosfolipase A2. Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini di Tabel 2|Hasil pewarnaan serum amyloid p component (SAP) pada biopsi ginjal

AA, amiloid A; AL, rantai ringan amiloid; C3, pelengkap komponen 3; GBM, membran basal glomerulus; MG, glomerulopati membranosa; MGMID, glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG tertutup; MPGN, membranoproliferatif; glomerulonefritis; PGMNID, glomerulonefritis proliferatif dengan deposit kappa IgG monoklonal; PLA2R, reseptor fosfolipase A2; THSD7A, domain trombospondin tipe 1 yang mengandung 7A.

DISKUSI

MGMID adalah pola glomerulopati yang baru-baru ini dijelaskan dan unik yang ditandai dengan deposit subepitel dan mesangial yang diwarnai untuk IgG kappa oleh parafin IF (Gambar 3). Pasien dengan pola glomerulopati ini cenderung perempuan muda (usia<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP adalah 25-kDa protein pentameric dalam keluarga pentraxin yang dikodekan oleh gen APCS dan berlimpah dalam serum dan sebagai komponen dari membran basal glomerulus.5 Meskipun fungsi pasti SAP tidak jelas, diketahui untuk berinteraksi dalam plasma dengan berbagai protein, termasuk komponen pelengkap, apolipoprotein, dan pengatur koagulasi dan proteolisis.6 Ini membentuk interaksi yang bergantung pada kalsium yang stabil dengan ligan, termasuk protein, lipoprotein, dan DNA, melindungi mereka dari degradasi. SAP berfungsi sebagai molekul pengenal pola larut yang terlibat dalam respon imun bawaan, mengenali berbagai pola molekul terkait patogen dan kerusakan, termasuk komponen mikroba dan puing-puing sel apoptosis.7 Interaksi SAP dengan molekul terkait patogen atau kerusakan pola mempromosikan pembersihan puing-puing sel apoptosis yang dimediasi oleh komplemen dengan pengikatan langsung ke komponen pelengkap 1q (C1q) dan aktivasi jalur komplemen klasik. Meskipun aktivasi komplemen, SAP diketahui memberikan imunoregulasi, menurunkan neutrofilikperadangandi dalam jaringan melalui pengurangan adhesi endotel,8 penurunan fungsi elastase,9 dan berkurangnya homing ke jaringan.10 SAP juga dikenal sebagai protein pengikat utama untuk DNA dan kromatin dalam plasma.11

Pada penyakit, SAP paling dikenal sebagai bagian dari deposit amiloidosis. Meskipun kurang dipelajari dengan baik, ada juga bukti bahwa itu bisa berperan dalam model penyakit autoimun pada manusia dan hewan. Antibodi SAP telah diidentifikasi pada pasien denganautoimunpenyakit, dan pengurangan ekspresi SAP telah ditunjukkan untuk mempromosikanautoimunitasdalam model murine. Antibodi terhadap SAP diidentifikasi pada 44 persen pasien dengan lupus eritematosus sistemik, dengan titer antibodi yang berkorelasi dengan aktivitas penyakit.12 Defisiensi SAP ditemukan mengakibatkan perkembangan autoimunitas spontan pada tikus C57BL/6 yang rentan autoimun, dan pada tikus non-autoimun. rawan tikus 129/Sv ketika disilangkan dengan tikus C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13 tetapi tidak pada galur 129/Sv saja, menunjukkan bahwa kerentanan genetik yang mendasari mungkin diperlukan untuk defisiensi SAP untuk menginduksi autoimunitas.14 tikus menunjukkan produksi antibodi antinuklear, DNA anti-untai tunggal, antibodi DNA anti-untai ganda, dan faktor rheumatoid. Mereka mengembangkan proliferatifimunglomerulonefritis yang dimediasi kompleks, lebih sering pada wanita.13 Dalam model murine lupus nephritis di mana glomerulonefritis diinduksi oleh injeksi DNA-diri yang diaktifkan dalam serum, terapi gen SAP oleh vektor plasmid mengurangi produksi antibodi DNA anti-untai ganda , deposisi kompleks imun, dan peradangan ginjal, dan mencegah timbulnya lupus nephritis

Gambar 3|Temuan biopsi ginjal pada glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG bertopeng. Fotomikrograf dari biopsi yang ditunjukkan pada Gambar 2 ditunjukkan di sini. (a) Paku segmental terdapat di sepanjang membran basal glomerulus, dengan pewarnaan Jones methenamine silver (perbesaran asli × 400). (b) Mikroskop elektron mengungkapkan deposit subepitel yang ada di sepanjang membran basal glomerulus (pembesaran asli×12,000). (c) Pewarnaan glomeruli negatif untuk IgG dengan imunofluoresensi rutin pada jaringan segar (imunofluoresensi langsung; perbesaran asli × 400). (d) Glomeruli dari kasus yang sama bernoda positif pada jaringan tertanam parafin setelah pencernaan protease (imunofluoresensi langsung; perbesaran asli × 400). (e) Glomeruli menunjukkan pewarnaan untuk kappa dan (f) bukan lambda pada jaringan tertanam parafin yang dicerna oleh protease (imunoflfluoresensi langsung; pembesaran asli × 400). Untuk mengoptimalkan tampilan gambar ini, silakan lihat versi online artikel ini di www.ginjal-internasional.org.

Meskipun pembatasan rantai ringan terlihat pada biopsi, saat ini tidak ada bukti entitas ini terkait dengan gangguan limfoproliferatif yang mendasari atau Igs monoklonal yang bersirkulasi. Dengan demikian, MGMID tidak boleh dianggap berada dalam spektrum gammopati monoklonal dengan signifikansi ginjal pada saat ini. waktu. Peran autoantibodi SAP juga tidak pasti. Tidak seperti bentuk lain dari glomerulopati membranosa dengan protein yang secara spesifik hadir dalam deposit imun, seperti penyakit terkait PLA2R,16 MGMID tampaknya tidak didorong oleh autoantibodi yang ditujukan terhadap SAP, karena kami gagal mendeteksi reaktivitas antibodi serum terhadap SAP pada pasien MGMID . Penjelasan alternatifnya adalah bahwa IgG kappa hadir sebagai hasil interaksi normal antara 2 protein ini daripada interaksi antigen-antibodi autoimun, karena rantai Ig kappa diketahui menjadi bagian dari interaksi normal serum SAP.6 Oleh karena itu, meskipun berguna untuk diagnostik jaringan entitas ini, pengujian antibodi SAP dalam serum tidak berfungsi sebagai diagnostik non-invasif saat ini, dan penyebab yang mendasari penyakit ini tetap menjadi misteri.

Hasil klinis di MGMID sangat bervariasi, mulai dari remisi spontan hingga perkembangan hingga stadium akhirginjalpenyakitdengan kekambuhan dalam transplantasi. Analisis retrospektif telah gagal untuk menunjukkan hubungan antara pengobatan yang digunakan dan hasil klinis.4 Penemuan keterlibatan SAP dalam penyakit ini berpotensi memiliki implikasi untuk terapi. Perawatan yang secara langsung menargetkan SAP telah menunjukkan harapan awal dalam pengobatan amiloidosis.17,18 Selain itu, hasil spektrometri massa menunjukkan bahwa terapi yang menargetkan kaskade komplemen mungkin berguna dalam mengobati bentuk glomerulonefritis ini, mengingat sebagian besar protein yang meningkat di glomeruli MGMID saling melengkapi. Studi tambahan diperlukan untuk mengidentifikasi biomarker aktivitas untuk penyakit ini, serta terapi.

Alasan untuk menutupi deposit imun dalam biopsi MGMID pada imunofluoresensi rutin tetap menjadi misteri. Kehadiran SAP dalam deposit menimbulkan kemungkinan penjelasan baru untuk fenomena ini dalam kasus MGMID. Misalnya, interaksi protein SAP diketahui sangat bergantung pada Ca2,6 dan banyak media transpor dan buffer yang digunakan dalam pemrosesan jaringan biopsi ginjal untuk imunofluoresensi tanpa Ca2. Ketiadaan Ca2þ secara in vitro ini dapat mengakibatkan terganggunya deposit imun sehingga tidak lagi tersedia untuk dideteksi oleh imunofluoresensi pada jaringan beku. Deposit kompleks imun akan tetap tersedia untuk dideteksi dalam jaringan yang difiksasi formalin, bagaimanapun, sebagai akibat dari ikatan kimia kovalen yang diinduksi formalin antara protein dalam jaringan.

Kami menjelaskan di sini, untuk pertama kalinya, kehadiran unik SAP dalam endapan glomerulus MGMID. Selain itu, kami menunjukkan bahwa pewarnaanginjalbiopsiuntuk SAP mengidentifikasi kasus dengan gambaran klinikopatologi yang serupa dengan yang ada di MGMID, tanpa penyembunyian, dengan imunofluoresensi rutin. Mengingat hasil ini, kami percaya pewarnaan positif dalam endapan glomerulus untuk SAP mengidentifikasi bentuk unik glomerulonefritis yang memiliki mekanisme patofisiologi penyakit yang sama. Sampai deskripsi MGMID baru-baru ini, kasus-kasus ini didiagnosis ke dalam berbagai kategori yang berbeda mulai dari glomerulopati C3 hingga glomerulonefritis terkait infeksi hingga glomerulopati membran atipikal.1 Evolusi cepat dari kriteria diagnostik dan pemahaman kita tentang bentuk glomerulonefritis ini menyoroti kekuatan massa spektrometri untuk memberikan wawasan patofisiologis ke glomerulonefritis yang dimediasi imun.

METODE

Teknik pemrosesan biopsi ginjal

Teknik pemrosesan biopsi ginjal standar digunakan, termasuk cahaya, imunofluoresensi, dan mikroskop elektron.19,20 Semua sampel mikroskop cahaya diwarnai dengan hematoxylin dan eosin, Jones methenamine silver, Masson trichrome, dan reagen asam-Schiff periodik. Semua bagian imunofluoresensi langsung dipotong pada 4 mm dan direaksikan dengan antibodi anti-manusia kelinci poliklonal bertanda flufluorescein terhadap IgG, IgA, IgM, C3, C1q, fibrinogen, dan rantai k-, dan l-light (Dako, Carpenteria, CA) selama 1 jam, dan dibilas; kaca penutup diaplikasikan menggunakan media pemasangan berair. Kasus-kasus tertentu diwarnai untuk antibodi anti-manusia tikus poliklonal yang ditandai fluorescein terhadap IgG1, IgG2, IgG3, dan IgG4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Imunofluoresensi parafin dilakukan setelah pencernaan protease seperti yang dijelaskan sebelumnya. 2,3 Sebanyak 9 biopsi MGMID dan 8 biopsi kontrol perbandingan dengan glomerulopati membran jenis lain dipilih untuk analisis spektrometri massa. Protokol penelitian telah disetujui oleh Solutions Institutional Review Board dan sesuai dengan prinsip Deklarasi Helsinki.

Cistanche bisamenguatkanginjal

Spektrometri massa glomeruli mikrodiseksi yang ditangkap dengan laser

Jaringan biopsi ginjal dari jaringan tertanam parafin yang difiksasi formalin dipotong pada ketebalan 1 0 mm ke slide bingkai membran PET Leica (Leica, Wetzlar, Jerman). Slide ini kemudian diwarnai dengan hematoxylin. Glomeruli dibedah mikro ke dalam tabung mikrosentrifus menggunakan mikroskop Leica DM60{{20}}0B. Glomeruli mikrodiseksi dilisiskan dalam 2 persen natrium dodesil sulfat dan 0,1M dithiothreitol pada 99 derajat selama 1 jam dan diproses dengan preparasi sampel berbantuan filter (FASP).21 Lisat yang diklarifikasi dipindahkan ke konsentrator Vivacon 500 (MWCO 30 kDa; Sartorius , Gottingen, Jerman). Natrium dodesil sulfat dihilangkan dengan pencucian berulang dengan urea 8 M dalam 0,1 M tris(hidroksimetil)-aminometana/Cl, pH 8,5; sampel kemudian dialkilasi dengan 0,05 M iodoacetamide. Iodoacetamide dihilangkan dengan 3 kali pencucian dengan 8 M urea/0,1 M tris(hidroksimetil)- aminometana/Cl, pH 8,5, diikuti dengan 3 kali pencucian dengan amonium bikarbonat 0,05 M. Protein dicerna dengan tripsin (tingkat sekuensing, Promega, Madison, WI) pada rasio 40:1 b/b pada 37 derajat selama 16 jam. Peptida dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dihilangkan garamnya pada C18-Tips tahap (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Peptida yang dicerna dianalisis dengan spektrometri massa NanoLC-tandem menggunakan spektrometer massa Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Peptida dimuat ke kolom perangkap fase terbalik (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA) yang mengandung 2,5 mm Waters XSelect (Waters Corp., Milford, MA) resin hibrida permukaan bermuatan yang digabungkan ke 150 mm X 0.0Kolom analitik 75 mm berisi resin fase terbalik yang sama seperti yang digunakan dalam perangkap. Sistem kromatografi cair kinerja ultra nanoAcquity (Waters Corp.) kemudian digunakan untuk menghasilkan gradien 60-menit dari 98:2 hingga 60:40 buffer A: B rasio (buffer A 0,1 persen asam format , 0,5 persen asetonitril; buffer B 0,1 persen asam format, 99,9 persen asetonitril).

Peptida dielusi dari kolom dengan ujung semprotan terintegrasi (Picofrit, New Objective) dan diionisasi dengan elektrospray (2.0 kV) diikuti dengan analisis spektrometri massa tandem menggunakan energi yang lebih tinggi disosiasi akibat tumbukan (HCD). Pemindaian survei prekursor peptida dilakukan pada resolusi 240K (pada 400 m/z) dengan target jumlah ion 5×10⁵. Spektrometri massa tandem dilakukan dengan isolasi pada 1,6 Th dengan quadrupole, fragmentasi HCD dengan energi tumbukan ternormalisasi 30, dan analisis spektrometri massa scan cepat dalam perangkap ion. Data spektrometri massa tandem yang diperoleh dicari terhadap database manusia Uniprot terbaru yang berisi entri Swiss Prot dan TREMBLE menggunakan

MaxQuant (Institut Biokimia Max Planck, Planegg, Jerman). Visualisasi data dilakukan dengan menggunakan Scaffold v4.6 (Proteome Software, Portland, OR). Tingkat penemuan palsu ditetapkan pada 1 persen untuk kecocokan peptida-ke-spektrum. Nilai iBAQ yang dinormalisasi dari MaxQuant digunakan untuk kuantisasi. Distribusi iBAQ untuk setiap sampel disesuaikan dengan median untuk mengontrol perbedaan dalam pemuatan. Nilai iBAQ sama dengan nol telah dihapus dari kumpulan data. Untuk pengujian hipotesis statistik, 2-sampel Welch's t-test dilakukan untuk setiap protein menggunakan nilai iBAQ yang dinormalisasi untuk 2 kelompok. Jika protein hanya terdeteksi dalam satu kelompok, 1-sampel Welch's t-test dilakukan, menggunakan nilai iBAQ terkecil yang terdeteksi sebagai hipotesis nol.

Pewarnaan SAP

Bagian tertanam parafin yang difiksasi formalin, dipotong pada 3 mm, dideparaffifinisasi, dan pengambilan antigen dilakukan pada 99 derajat. Bagian direaksikan dengan antibodi poliklonal anti-SAP poliklonal kelinci (1:400; ThermoFisher, Waltham, MA) diikuti oleh sekunder anti-kelinci terkonjugasi merah Rhodamin merah kambing yang fase padat teradsorpsi untuk memastikan minimal reaksi silang dengan manusia IgG (1:100; Laboratorium Penelitian Imuno Jackson, West Grove, PA). Setiap kasus dijalankan dengan kontrol positif dan negatif. Noda dievaluasi dengan mikroskop imunofluoresensi standar. Dinilai positif jika ada pewarnaan loop kapiler granular positif di glomeruli, dan negatif jika tidak ada loop kapiler.

pewarnaan pada glomerulus. Kolokalisasi IgG dan SAP dalam membran basal glomerulus diperiksa dengan mikroskop confocal menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Jena, Jerman). Untuk analisis ini, poliklonal (flfluorescein isothiocyanate-conjugated) kelinci anti-manusia IgG (1:40; Agilent, Santa Clara, CA) direaksikan dengan jaringan yang diambil panas setelah pewarnaan untuk SAP seperti dijelaskan di atas. Kontrol negatif dilakukan untuk memastikan spesifisitas antibodi dengan menghilangkan antibodi primer. Empat kasus MGMID diuji keberadaan HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) dengan pewarnaan imunoperoksidase.

Pengujian antibodi serum terhadap SAP

Protein SAP (R & D Systems, Minneapolis, MN; {{0}}SAB-050) diencerkan hingga 3 ng/ml dalam buffer karbonat-bikarbonat (pH 9,6) dan dilapisi pada {{ 6}}well Immulon H2 plate (Thermo Scientific) semalaman pada suhu 4 derajat . Pelat dicuci x3 menggunakan 200 ml buffer pencuci (1x phosphate-buffered saline dan 0,05 persen tween) dan diblokir selama 2 jam dengan blocking buffer (1xphosphate-buffered saline, 0,05 persen tween, 1 persen gelatin ikan). Pelat kemudian dicuci × 3 dengan 200 ml buffer pencuci. Dua puluh mikroliter serum encer (1:100 dalam buffer pencuci) ditambahkan per sumur dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu kamar. Pelat dicuci × 7 dengan 200 ml buffer pencuci diikuti dengan penambahan antibodi pendeteksi, anti-Human IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Pelat dicuci × 7 dengan 200 ml buffer pencuci. Selanjutnya, substrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin peroksidase, dan substrat peroksidase Sol B dicampur dengan perbandingan 1:1, dan ditambahkan 100 ml ke dalam cawan. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 ml 2M H2SO4, didiamkan selama 20 menit sebelum dibaca pada 450 nm. Untuk kontrol untuk memastikan bahwa protein SAP terikat ke piring, kami menggunakan kelinci anti-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) dalam pengenceran serial diikuti oleh anti-kelinci IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories ; 111-035-144). Kontrol menunjukkan korelasi yang baik antara pengenceran antibodi dan absorbansi, dengan nilai rata-rata R-kuadrat 0,95.

Cistanche untuk meningkatkanginjalfungsi

PENYINGKAPAN

Semua penulis menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.

TAMBAHAN

File Tambahan MATERIAL (PDF)

Gambar S1. Gambar representatif pewarnaan SAP glomerulus dari berbagai penyakit ginjal.

Gambar S2. Studi seroreaktivitas anti-SAP dengan uji imunosorben terkait-enzim.

Tabel S1. Semua Ig diidentifikasi dengan spektrometri massa dalam glomeruli mikrodiseksi laser-capture dari kasus glomerulopati seperti membran dengan deposit IgG kappa.

Tabel S2. Hitungan spektral dengan pengambilan sampel semua protein menunjukkan peningkatan kelimpahan $1 log2 dalam sampel MGMID dan nilai-P # 0.1.

REFERENSI

1. Larsen CP, Ambruzs JM, Bonsib SM, dkk. Glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG bertopeng.GinjalInt. 2014;86: 154–161.

2. Messias NC, Walker PD, Larsen CP. Imunofluoresensi parafin di laboratorium patologi ginjal: lebih dari teknik penyelamatan. Mod Pathol. 2015;28:854–860.

3. Larsen CP, Messias NC, Walker PD, dkk. Glomerulonefritis membranoproliferatif dengan deposit imunoglobulin monotipik bertopeng. Ginjal Int. 2015;88:867–873.

4. Larsen CP, Bisul CL, Cossey LN, dkk. Gambaran klinikopatologi dari glomerulopati seperti membran dengan deposit kappa IgG bertopeng. Kidney Int Rep. 2016;1:299–305.

5. Emsley J, White HE, O'Hara BP, dkk. Struktur komponen amiloid P serum manusia pentamerik. Alam. 1994;367:338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, dkk. Komponen serum amiloid P (SAP) berinteraksi dalam plasma manusia yang mengandung kadar kalsium fisiologis. Biokimia. 2017;56:896–902.

7. Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, dkk. Pengenalan pola oleh pentraxins. Adv Exp Med Biol. 2009;653:98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, dkk. Pentraxins PTX3 dan SAP dalam imunitas bawaan, regulasi inflamasi dan remodeling jaringan. J Hepatol. 2016;64:1416–1427.

9. Li JJ, McAdam KP. Komponen amiloid P manusia: penghambat elastase. Scan J Imunol. 1984;20:219–226.

10. Cox N, Pilling D, Gomer RH. Serum amiloid P: regulator sistemik dari respon imun bawaan. J Leukoc Biol. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Molekul pelindung—C-reactive protein (CRP), serum amyloid P (SAP), pentraxin3 (PTX3), mannose-binding lectin (MBL), dan apolipoprotein A1 (Apo A1), dan autoantibodi mereka: prevalensi dan signifikansi klinis dalam autoimunitas. J Clin Imunol. 2005;25:582–591.

12. Zandman-Goddard G, Blank M, Langevitz P, dkk. Antibodi komponen amiloid anti serum pada pasien dengan lupus eritematosus sistemik berkorelasi dengan aktivitas penyakit. Ann Rheum Dis. 2005;64:1698-1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, dkk. Komponen serum amiloid P mengontrol degradasi kromatin dan mencegah autoimunitas antinuklear. Nat Med. 1999;5:694–697.

14. Gillmore JD, Hutchinson WL, Herbert J, dkk. Autoimunitas dan glomerulonefritis pada tikus dengan penghapusan target gen komponen amiloid P serum: Defisiensi SAP atau kombinasi regangan? Imunologi. 2004;112:255–264.

15. Zhang W, Wu J, Qiao B, dkk. Perbaikan lupus nephritis dengan terapi gen komponen amiloid serum dengan mekanisme yang berbeda bervariasi dari berbagai tahap penyakit. PloS Satu. 2011;6:e22659.

16. Beck LH, Bonegio RG, Lambeau G, dkk. Reseptor fosfolipase A2 tipe-M sebagai antigen target pada nefropati membran idiopatik. N Engl J Med. 2009;361:11–21.

17. Richards DB, Cookson LM, Berges AC, dkk. Pembersihan terapeutik amiloid oleh antibodi terhadap komponen serum amiloid P. N Engl J Med. 2015;373:106-1114.

18. Richards DB, Cookson LM, Barton SV, dkk. Dosis ulang antibodi terhadap komponen amiloid P serum membersihkan deposit amiloid pada pasien dengan amiloidosis sistemik. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM. Pedoman praktek untuk biopsi ginjal. Mod Pathol. 2004;17:1555–1563.

20. Pejalan PD. Biopsi ginjal. Arch Pathol Lab Med. 2009;133:181–188.

21. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, dkk. Metode preparasi sampel universal untuk analisis proteom. Metode Nat. 2009;6: 359–362.