LNK Inhibitor Farnesyltransferase-754 Melemahkan Distrofi Aksonal Dan Mengurangi Patologi Amiloid pada Tikus Bagian 2

Pencitraan langsung neuron

Untuk percobaan pencitraan langsung, neuron disiapkan seperti di atas dan disepuh dalam piringan dasar kaca 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) selama 7 hari dalam kultur. LNK 10nM-754 atau lonafarnib kemudian ditambahkan ke media terkondisi, kultur kontrol diperlakukan dengan DMSO sebagai sarana. Setelah 48 jam perlakuan, media diganti dengan media terkondisi dari pelat neuron paralel yang tidak diberi perlakuan. 25nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) ditambahkan ke media terkondisi, dan neuron diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 derajat.

Neuron merupakan bagian penting dari sistem saraf, yang mampu menerima, memproses, dan mengirimkan informasi, serta merupakan bahan dasar kecerdasan dan perilaku manusia. Imunitas merupakan jaminan penting bagi tubuh manusia untuk melawan penyakit. Dapat mengidentifikasi dan menghancurkan patogen dan sel abnormal serta menjaga kesehatan tubuh.

Penelitian menunjukkan bahwa ada hubungan kuat antara neuron dan sistem kekebalan tubuh. Neuron dapat mempengaruhi sistem kekebalan tubuh dengan melepaskan berbagai neurotransmiter, seperti norepinefrin, epinefrin, dll. Neurotransmiter ini dapat mengubah aktivitas sel kekebalan, meningkatkan proliferasi dan fungsi sel kekebalan, serta meningkatkan kekebalan tubuh. Pada saat yang sama, sistem kekebalan juga dapat mempengaruhi fungsi neuron melalui berbagai jalur. Sel kekebalan dapat mengeluarkan berbagai sitokin dan hormon, mempengaruhi pertumbuhan, perkembangan, dan fungsi neuron melalui jalur kekebalan.

Selain itu, faktor psikologis dan sosial dapat mempengaruhi imunitas dan fungsi saraf. Emosi negatif seperti stres, kecemasan, dan depresi dapat berdampak buruk pada sistem kekebalan dan neuron, sehingga menurunkan kekebalan tubuh. Emosi positif, hubungan sosial yang positif, dan gaya hidup sehat dapat mendorong perkembangan kekebalan dan neuron yang sehat.

Kesimpulannya, terdapat hubungan interaktif dan saling mendukung antara neuron dan imunitas. Menjaga kesehatan mental, menghadapi kehidupan secara positif, dan menerapkan kebiasaan hidup yang baik dapat meningkatkan kekebalan tubuh dan perkembangan sel saraf yang sehat. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan, karena Cistanche deserticola juga dapat mengatur keseimbangan neurotransmiter, seperti meningkatkan kadar asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Zat-zat ini sangat penting untuk daya ingat dan pembelajaran. Selain itu, daging juga dapat meningkatkan aliran darah dan meningkatkan pengiriman oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan energi yang cukup, sehingga meningkatkan vitalitas dan daya tahan otak.

Klik tahu cara meningkatkan fungsi otak

Pencitraan neuron time-lapse dilakukan menggunakan mikroskop widefield Ti2. Pencitraan segera dimulai pada 30 menit dan dilanjutkan tidak lebih dari 30 menit. 1- eksposur diambil setiap menit, dan 20–30 area terpisah per piringan dicitrakan dalam waktu 30 menit. Kuantifikasi jarak dan kecepatan partikel LysoTracker dan analisis kymograph dilakukan menggunakan perangkat lunak NIS Elements dan dijelaskan secara rinci di bawah ini. Dalam percobaan terpisah, 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) ditambahkan ke media terkondisi, dan gambar neuron hidup diambil tidak lebih dari 15 menit menggunakan mikroskop confocal Nikon A1 dengan objektif 60X (NA 1.4) dan perangkat lunak NIS Elements.

Pencitraan langsung jaringan otak

{{0}}tikus 5XFAD berumur sebulan disuntikkan setiap hari selama 3 minggu dan setelah pengobatan selesai, tikus dibius, dan diberi perfusi dengan larutan yang mengandung 1M KCl, 1M MgCl2, 0.1mM kynurenate , 0,01mM DL-2-Amino-5-asam fosfonopentanoat, 5mM glutathione, 25mM glukosa, 125mM NaCl, 1,4mM NaH2PO4 dan 25mM NaHCO3.

Otak kemudian dibedah dengan cepat dalam ACSF beroksigen dingin yang mengandung 2,5mM KCl, 85mM NaCl, 1,25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, {{10}}.5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM sukrosa, 25mM glukosa, 50uM C6H7NaO6, 0.1mM kynurenate, 0.01mM DL-2-Amino-5-asam fosfonopentanoat dan 5mM glutathione. Irisan koronal 300μm diperoleh dengan menggunakan mikrotom getar Compresstome VF-200 (Instrumen Presisi) dan didiamkan selama 30 menit untuk pemulihan pada suhu 32 derajat dalam larutan ACSF teroksigenasi yang mengandung 2,5mM KCl, 85mM NaCl, 1,25mM NaH2PO4, 25mM NaHCO3, 0,5mM CaCl2, 4mM 4 MgCl2, 75mM sukrosa, 25mM glukosa, 50uM C6H7NaO6, 0,1mM kynurenate, 0,01mM DL2-Amino-5-asam fosfonopentanoat, dan 5mM glutathione.

Irisan tersebut kemudian dipindahkan ke piringan dasar kaca 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) yang mengandung ACSF teroksigenasi dengan 25nM LysoTracker-Green dan pengenceran 1:10,000 1mg/ mL Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich) yang identik dengan ACSF yang digunakan selama masa pemulihan. Viabilitas irisan dikonfirmasi menggunakan pencitraan jaringan time-lapse. Irisan diinkubasi dengan LysoTracker-Green dan Tiazine Red selama 15 menit pada suhu kamar dan kemudian daerah kortikal otak segera dicitrakan dalam larutan yang sama pada suhu 32 derajat pada mikroskop confocal Nikon A1 dengan tujuan 60X (NA 1.4) dan perangkat lunak NIS Elements untuk tidak lebih dari 30 menit.

Ekstraksi otak dan imunobloting

Tikus dibius dengan injeksi xylazine (15mg/kg) dan ketamin (100mg/kg) intraperitoneal, yang diperfusi dengan saline yang mengandung fosfat (1XPBS) dengan fenilmetilsulfonil fluorida (20ug/ml), leupeptin (0,5ug/ml), sodium orthovanadate (20μM), dan dithiothreitol (0,1mM), diikuti dengan pengangkatan otak. Semua buffer yang digunakan untuk ekstraksi protein mengandung protease inhibitor cocktail III (#535140, Millipore) dan Halt fosfatase inhibitor (#78420, Thermo Fisher Scientific). Jaringan hemibrain ditimbang dan dihomogenisasi secara manual menggunakan dounce homogenizer 1:10 (b/v) dalam 1XPBS.

Setelah homogenisasi, lisat disentrifugasi pada 20,8{{10}}0g selama 30 menit pada suhu 4 derajat. Fraksi terlarut (supernatan) dihilangkan, dan pelet diresuspensi dengan memipet dalam buffer uji radioimunopresipitasi (RIPA) [50mM Tris, 0,15M NaCl, 1% oktilfenoksipolietoksietanol (IGEPAL), 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0,1% SDS, dan 0,5 % natrium deoksikolat pada pH8] untuk diinkubasi dalam es selama 30 menit.

Sampel disonikasi (Misonix XL{{0}}) selama 20 detik di atas es dan kemudian disentrifugasi pada 20.800g selama 30 menit pada suhu 4 derajat. Fraksi yang larut dalam RIPA (supernatan) dihilangkan, dan pelet disuspensikan kembali dalam guanidin 5M (pH 8,0) untuk analisis protein yang tidak larut. Setiap sampel disonikasi selama 20 detik di atas es, diputar selama 1 jam pada suhu kamar, dan kemudian disentrifugasi pada 20.800g selama 30 menit pada suhu 4 derajat. Uji asam bicinchoninic (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) digunakan untuk mengukur konsentrasi protein setiap sampel.

Untuk western blots, 20ug protein dari setiap sampel dimasukkan ke dalam 4–12% gel NuPAGE (Invitrogen) dan dipisahkan menggunakan buffer MOPS dalam kondisi tereduksi dan terdenaturasi. Protein dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida dan dikembangkan menggunakan Pierce ECL (peningkatan chemiluminescence; Thermo Fisher Scientific). Sinyal yang dikembangkan divisualisasikan menggunakan ProteinSimple FCR (FluorChem R) dan sinyal chemiluminescent berikutnya dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak AlphaView (ProteinSimple). Semua noda dianalisis menggunakan alat Koreksi Latar Belakang Lokal kecuali noda HDJ-2, yang dianalisis menggunakan alat Tautan Latar Belakang bersama dengan Koreksi Latar Belakang Multi-regional (perangkat lunak AlphaView).

ELISA 42

Untuk mengukur A 42 dalam homogenat hemibrain dari tikus 5XFAD, Enzyme-LinkedImmunosorbent-Assay (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) yang tersedia secara komersial digunakan mengikuti instruksi pabrik untuk menganalisis guanidin dan A 42 yang larut dalam PBS di hemibrain. Untuk mengukur A 42 di otak tikus hAPP/PS1, digunakan ELISA yang tersedia secara komersial (h amyloid 42 ELISA sensitif tinggi, Te Genetics Company, Zurich, Swiss). ELISA dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan.

Imunofluoresensi jaringan otak tikus

Setelah perfusi, otak diekstraksi dan hemibrain difiksasi dalam formalin 10% diikuti dengan kriopreservasi dalam larutan sukrosa 30% dalam 1XPBS. Mikrotom geser beku digunakan untuk mengambil bagian koronal atau sagital berukuran 30-μm. Bagian ditempatkan secara serial di pelat sumur 12-dalam larutan krioprotektif (1xPBS, sukrosa 30%, dan etilen glikol 30%) dan disimpan pada suhu −20 derajat sampai digunakan. Pewarnaan imunofluoresensi dilakukan dengan terlebih dahulu mencuci bagian sebanyak tiga kali dalam 1XTBS dan kemudian menginkubasi bagian dalam 16 mM glisin dalam 1XTBS selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah 3 kali pencucian tambahan di 1XTBS, bagian diblokir dalam 5% serum kambing dalam 0,25% Triton X-100 dalam 1XTBS selama 2 jam pada suhu kamar.

Bagian tersebut kemudian diinkubasi semalaman dalam antibodi primer dalam larutan 0.25% Triton X-100, 1% albumin serum sapi, dan 1XTBS pada suhu 4 derajat. Imunostaining sekunder kemudian dilakukan dengan antibodi sekunder berlabel AlexaFluor keledai pada konsentrasi 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) digunakan untuk memasang bagian sebelum dicitrakan pada mikroskop bidang lebar Ti2 atau mikroskop confocal pemindaian laser Nikon A1 untuk kuantifikasi gambar menggunakan perangkat lunak Nikon NIS Elements untuk akuisisi.

Semua pengaturan akuisisi tetap sama antara genotipe dan semua gambar diperoleh dalam periode pencitraan yang sama untuk percobaan individu (Pusat Mikroskopi Lanjutan Universitas Northwestern dan Pusat Pencitraan Nikon).

Kuantifikasi gambar

Otak tikus

Kuantifikasi imunofluoresensi dari immunostaining jaringan otak tikus dilakukan pada 3-5 bagian per hewan, dari koordinat Bregma sekitar −0.94 hingga −2.55mm, yang dicitrakan menggunakan tujuan 10X pada mikroskop bidang lebar Ti2. Analisis kuantifikasi, termasuk ambang batas ukuran dan intensitas, dilakukan dengan menggunakan Perangkat Lunak Nikon NIS-Elements (Northwestern University Nikon Imaging Center).

Bergantung pada sinyalnya, ambang batas ditetapkan menggunakan alat Analisis Umum berdasarkan ukuran, bentuk, dan kontras objek, lalu topeng biner dibuat untuk setiap saluran dan wilayah yang diinginkan. Ambang batas dilakukan secara terpisah pada setiap saluran untuk mengisolasi sinyal yang diinginkan dengan mengoptimalkan rasio sinyal terhadap kebisingan dan menghilangkan sinyal latar belakang yang tidak spesifik. Untuk penghitungan area tertutup LAMP1, BACE1, atau LysoTracker-Green, serta pengukuran intensitas fluoresensi LAMP1 dan Lysosensor di neuron primer, wilayah yang diminati dilacak secara manual menggunakan NIS-Elements dan lapisan biner dibuat untuk setiap wilayah yang diminati.

Untuk menghitung rasio LAMP1 terhadap A 42, luas LAMP1 pada neurit distrofi dinormalisasi menjadi luas A 42 berdasarkan plak individu dan rasio rata-rata per tikus antara kelompok perlakuan dikuantifikasi. Analisis koefisien korelasi Pearson untuk BACE1 dan LAMP1 dilakukan menggunakan NIS-Elements berdasarkan per plak pada proyeksi intensitas maksimum gambar tumpukan Z 30μm yang diambil menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser Nikon A1 dengan ukuran langkah 1μm.

Untuk menghitung rasio LysoTrackerGreen terhadap Tiazine merah, area LysoTracker-Green pada neurit distrofi dinormalisasi ke area Tiazine Red berdasarkan plak individu dan rasio rata-rata per tikus dikuantifikasi antar kelompok perlakuan. Empat bagian koronal dari koordinat Bregma sekitar −1,70 hingga −2,55mm digunakan untuk menghitung luas atau intensitas setiap sinyal di masing-masing wilayah otak untuk setiap tikus. Analisis area yang tertutup plak dan ukuran plak dilakukan dengan menggunakan rata-rata lima bagian per tikus dari koordinat Bregma sekitar −0,94 hingga −2,55mm. Seleksi bagian, akuisisi gambar, penelusuran gambar, dan kuantifikasi dilakukan oleh orang yang tidak mengetahui kelompok perlakuan dan genotipe.

Neuron primer

Untuk kuantifikasi immunostaining LAMP1 pada neuron primer tikus tetap, soma dilacak secara manual berdasarkan morfologi menggunakan NIS-Elements, dan topeng biner dibuat untuk setiap wilayah dan saluran yang diminati. Ambang batas digunakan untuk mengoptimalkan sinyal LAMP1 dan membedakan LAMP1 pada neurit, termasuk dendrit dan akson, dengan mengisolasi piksel LAMP1 positif untuk piksel tubulin.

Sinyal sel soma LAMP1 dikeluarkan dari total area LAMP1 untuk menganalisis vesikel LAMP1 pada neurit. Untuk analisis motilitas LysoTracker-Green di neuron, gambar diukur menggunakan NISElements. Kecepatan dan jarak total partikel LysoTrackerGreen di setiap frame dilacak menggunakan fitur pelacakan gerakan otomatis di NIS-Elements. Ambang batas ditetapkan dan diterapkan ke semua film berdasarkan ukuran dan intensitas fluoresensi partikel LysoTracker-Green untuk menghilangkan kebisingan latar belakang.

Untuk pembuatan kymograph, pencitraan time-lapse dari neuron tunggal dilakukan pada mikroskop confocal 60X dan akson diidentifikasi secara morfologis. Persentase frekuensi partikel yang bergerak dalam arah anterograde atau retrograde, atau stasioner, dihitung dengan membagi jumlah partikel untuk setiap kelompok dengan jumlah total partikel. Untuk analisis kymograph, partikel bergerak didefinisikan memiliki kecepatan di atas 0,1μM/detik.

Analisis statistik

Perangkat lunak GraphPad Prism v8 digunakan untuk melakukan analisis statistik, termasuk analisis varians (ANOVA) dengan uji posthoc ketika membandingkan lebih dari dua sampel dan uji-t tidak berpasangan ketika hanya dua sampel yang dibandingkan. Rincian pengujian spesifik termasuk jumlah ulangan, jenis pengujian posthoc, dan nilai P dinyatakan dalam legenda gambar. Semua kuantifikasi diplot pada mean±SEM. Signifikansi disimpulkan ketika nilai P kurang dari 0,05 yang ditandai dengan *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com