Eksperimen 3 Pengaruh Cistanche Deserticola Phenyletanol Glikosida Pada Model Perimenopause Tikus Ⅲ

Eksperimen 3 Pengaruh glikosida feniletanol Cistanche deserticola pada model perimenopause tikus

1 Bahan percobaan

1.1 Hewan percobaan

Tikus wistar, tingkat SPF, betina, disediakan oleh Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., nomor sertifikat tikus untuk batch ini: 0017216; nomor sertifikat laboratorium SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Obat percobaan

Cistanche deserticola feniletanol glikosidadisiapkan sesuai metode Percobaan 1 dan kandungannya mencapai 66,47%. Kapsul Gengnian'an, bahan: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kulit pohon peony, Poria cocos, mutiara, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, gandum terapung, polygonum multiflorum . Fungsi dan Indikasi:Memelihara yin dan menundukkan yang, meringankan masalahdan menenangkan pikiran. Digunakan untuk hot flashes menopause dan berkeringat, pusing, tinitus, mudah tersinggung dan susah tidur. Spesifikasi: 0.3g per kapsul. Penggunaan dan dosis: Oral, 3 kapsul sekaligus, 3 kali sehari. Produsen: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Nomor batch produksi: 121104. Nomor persetujuan: Persetujuan Obat Nasional No. Z14021848.

Isoflavon kedelai dan kapsul lunak vitamin E, daftar bahan: bubuk isoflavon kedelai, vitamin E, minyak bunga matahari, gelatin, gliserin, air, tartrazin, titanium dioksida. Bahan dan kandungan ikonik: Setiap 100g mengandung 55,2 mg isoflavon kedelai (dihitung sebagai genistein) dan 608,5 mg vitamin E. Fungsi kesehatan: Meningkatkan kepadatan tulang. Petunjuk dan Dosis: Minum 1 kapsul 2 kali sehari dengan air hangat. Spesifikasi: 500mg×100 kapsul. Produsen: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Nomor batch produksi: 13070302. Nomor persetujuan: Kesehatan Pangan Nasional G20080032.

BERAPA LAMA YANG DIPERLUKAN UNTUK CISTANCHE BEKERJA?

1.3 Reagen percobaan

Natrium karboksimetilselulosa, Tianjin Hengxing Chemical Reagen Manufacturing Co., Ltd., nomor batch: 20120418; natrium penisilin untuk injeksi, North China Pharmaceutical Co., Ltd., spesifikasi: 4 juta unit, nomor batch produksi: c1206807;

Larutan formaldehida (murni secara analitis), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., nomor batch produksi: 20130902; injeksi natrium klorida 0,9%, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; spesifikasi: 250ml, nomor batch produksi: 13082405B;

Kloral hidrat, Institut Penelitian Kimia Halus Tianjin Guangfu, nomor batch 20120827; Kit deteksi ELISA Tikus E2, Perusahaan Litbang, nomor batch: 20140101A; Kit deteksi ELISA Rat T, Perusahaan Litbang, nomor batch: 20140101A; Kit deteksi ELISA LH tikus, Perusahaan Litbang, nomor batch: 20140101A; Kit deteksi ELISA FSH tikus, Perusahaan Litbang, nomor batch: 20140101A;

2 Metode eksperimental

2.1 Pemodelan dan Pemberian Obat

Metode pemodelan: Ambil 100 tikus wistar betina dengan berat badan 210~230g, pilih 12 ekor tikus secara acak sebagai kelompok kosong dan menjalani operasi palsu, dan sisanya akan digunakan untuk membuat menopause model. Setelah tikus ditimbang, tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal 10% kloral hidrat (0,3ml/100g) dan posisi perut diperbaiki. Kemudian tikus dirapikan dari bawah tulang rusuk terakhir punggungnya pada perpotongan garis tengah aksila dan sekitar 2 cm dari sisi lateral tulang belakang, kemudian didesinfeksi. Kulit dan otot punggung diiris sekitar 1 cm, dan massa lemak berwarna putih susu terlihat di bidang pandang sayatan, dan ovarium tertanam di dalamnya. Gunakan pinset kecil untuk memegang perlahan massa lemak dan menariknya keluar dari sayatan, pisahkan massa lemak, dan Anda akan melihat sekelompok ovarium tipis, tidak beraturan, berwarna kuning-merah. Saat memotong, ikat terlebih dahulu tuba falopi (termasuk lemak) di bawah ovarium dengan benang tipis, angkat seluruh ovarium kiri, dan buang 80% ovarium kanan. Setelah operasi, tanduk rahim dimasukkan kembali ke dalam rongga perut, otot dan kulit dijahit, dan kedua ovarium diangkat dengan cara yang sama. Setelah operasi, hewan-hewan tersebut dipelihara dengan hati-hati dan disuntik secara intramuskular dengan 200,000 u/kg penisilin (masing-masing 0,1 ml) untuk mencegah infeksi, sekali sehari selama 3 hari berturut-turut. 5 hari setelah operasi, pemeriksaan apusan vagina tikus dimulai satu per satu, sehari sekali selama 5 hari berturut-turut. Tikus dengan reaksi estrus pada apusan dibuang. Tikus yang dikebiri sempurna sebanyak 72 ekor dipilih dan dibagi secara acak menjadi 6 kelompok. Untuk keperluan percobaan adalah kelompok model, kelompok Gengnianan, kelompok isoflavon kedelai, dan kelompok Cistanche deserticola phenyletanol glikosida dosis besar, sedang, dan kecil.

Metode persiapan: Metode persiapan: {{0}}.5% CMC Metode persiapan: Timbang 4g natrium karboksimetil selulosa dan campur dengan air suling untuk membuat 800ml. Dosis kelompok glikosida feniletanol Cistanche deserticola dosis besar, sedang, dan kecil masing-masing adalah 133,33mg/kg, 66,67mg/kg, dan 33,33mg/kg (volume pemberian 1ml/100g). Metode pembuatan: Timbang masing-masing 1333,3mg, 666,7mg, dan 333,3mg total flavonoid raspberry, larutkan dengan sedikit CMC 0,5%, lalu sesuaikan volume menjadi 100ml, aduk rata, dan selesai. Kapsul Gengniangan (450mg/kg, dicampur dengan air suling hingga 45 mg/ml, 1ml/100g, setara dengan 10 kali dosis klinis); Cara Pembuatan: Ambil 15 Kapsul Gengniangan, larutkan terlebih dahulu dengan sedikit CMC 0,5%, lalu sesuaikan volumenya menjadi 100ml dan aduk rata, sesuai dengan takaran Suspensi Kapsul Gengnianan (450mg/kg). Kapsul Lunak Vitamin E Isoflavon Kedelai (166,67mg/kg, gunakan air suling untuk membuat 16,67mg/ml, 1ml/100g, setara dengan 10 kali dosis klinis); Cara pembuatan: Ambil 4 Kapsul Lunak Isoflavon Kedelai Vitamin E, Larutkan terlebih dahulu dengan sedikit CMC 0,5%, kemudian sesuaikan volumenya menjadi 120ml, dan aduk rata hingga diperoleh dosis suspensi kapsul lunak isoflavon vitamin E kedelai (16,67mg/kg ).

Metode pemberian: Hewan di setiap kelompok diberi obat yang sesuai pada hari ke-10setelah operasi. Kelompok blanko dan kelompok model diberi larutan CMC 0,5% dengan volume yang sama (volume gavage 1ml/100g), dan kelompok Gengnianan diberi suspensi kapsul Gengnianan (450mg/kg, setara dengan 10 kali dosis klinis). ). ), kelompok isoflavon kedelai diberikan suspensi kapsul lunak vitamin E isoflavon kedelai secara oral (166,67 mg/kg, setara dengan 10 kali dosis klinis), dan dosis besar, sedang, dan kecil.Cistanche deserticola feniletanol glikosidakelompok diberikan secara oral sesuai dengan kelompoknya. Cistanche deserticola phenyletanol glikosida dosis besar, sedang dan kecil (dosis masing-masing 133,33mg/kg, 66,67mg/kg, dan 33,33mg/kg, volume dosis 1ml/100g), diberikan sekali sehari melalui pemberian intragastrik, terus menerus . obat selama 30 hari.

2.2 Item observasi dan metode deteksi

Skor pergerakan horizontal-vertikal tikus pada masing-masing kelompok diukur 29 hari setelah pemberian. 2 jam setelah pemberian lambung terakhir (puasa 15 jam), keluarkan bola mata untuk diambil darahnya, pisahkan serumnya, danplasma, dan mengukur kandungan E2, T, LH, FSH, GnRH, dan BGP dalam serum, serta kandungan -EP dalam plasma; tikus-tikus itu dibedah. Buang timus, limpa, rahim dan sisa 20% jaringan ovarium, timbang berat basahnya dan hitung indeks organ timus, limpa dan rahim (indeks organ=berat basah organ mg/berat tikus g) , lalu angkat otak Untuk hipotalamus dan kelenjar pituitari, homogenat jaringan dibuat dari hipotalamus, kelenjar pituitari dan 1/2 rahim, serta kandungan reseptor estrogen di hipotalamus, kelenjar pituitari dan homogenat jaringan rahim dan androgen kandungan reseptor dalam homogenat jaringan hipotalamus ditentukan. Timus, limpa, rahim, dan ovarium difiksasi dalam larutan formaldehida 10%, ditanam dalam parafin, dibelah, dan diwarnai dengan HE. Ituperubahan histomorfologipada masing-masing kelompok diamati di bawah mikroskop cahaya.

2.2.1 Uji metode lapangan terbuka

Alat percobaan berupa kotak terbuka berbentuk kubik dengan tinggi 40cm, panjang dan lebar 80cm. Dinding dan bagian bawahnya berwarna hitam. Bagian bawah terdiri dari 25 balok yang luasnya sama, dibagi dengan garis putih. Selama percobaan, tikus ditempatkan di kotak di tengah kotak terbuka, dan skor aktivitas horizontal dari jumlah balok yang dilintasi tikus di bagian bawah dalam waktu 5 menit (kotak dengan keempat kakinya dimasukkan dapat dihitung), dan berapa kali kaki belakang berdiri tegak (dua kaki depan terangkat). (atau menempel di dinding) skor aktivitas vertikal. Kotoran harus dikeluarkan seluruhnya setelah setiap percobaan, dan setiap tikus diukur 2 jam sekali setelah pemberian. Percobaan ini dilakukan di ruangan yang tenang.

2.2.2 Metode penentuan kit

Dapatkan spesimen serum: Gunakan tabung reaksi yang bebas pirogen dan endotoksin. Hindari rangsangan sel apa pun selama operasi. Setelah darah diambil, disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan serum dan sel darah merah dengan cepat dan hati-hati. Dapatkan spesimen plasma: antikoagulan dengan tabung antikoagulan heparin. Sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit dan ambil supernatannya. Dapatkan spesimen homogenat jaringan: Tambahkan garam fisiologis dalam jumlah yang sesuai ke jaringan dan haluskan. Sentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan ambil supernatannya.

Cara penentuan kit ELISA estradiol (E2) tikus (Rat) sama dengan Eksperimen 2. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 4, 8, 16, 32, dan 64 pmol/L.

Metode pengujian Kit ELISA Tikus (Tikus) Testosteron (T) sama dengan metode pengujian Kit ELISA Estradiol. Konsentrasi standar (S{{0}}S5) adalah {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160, dan 320 pg /mL. Metode penentuan alat deteksi ELISA hormon luteinizing (LH) tikus (Tikus) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 3, 6, 12, 24, dan 48 ml/ml. Metode pengujian kit ELISA hormon perangsang folikel (FSH) tikus (Tikus) sama dengan metode pengujian kit ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 0,75, 1,5, 3, 6, dan 12 IU/L. Metode penentuan alat deteksi ELISA hormon pelepas gonadotropin (GnRH) tikus (Tikus) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 5, 10, 20, 40, dan 80 mlU/ml.

Metode penentuan alat deteksi ELISA osteokalsin tikus (Tikus) (BGP/OCN) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S{{0}}S5) adalah 0, 0,75, 1,5, 3, 6, dan 12 ng/ml. Metode penentuan alat deteksi ELISA tikus (Rat) -endorphin ( -EP) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 3, 6, 12, 24, dan 48 pg/mL. Metode penentuan alat deteksi ELISA reseptor estrogen (ER) tikus (Tikus) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S{{20}}S5) adalah 0, 4, 8, 16, 32, dan 64 pg/mL. Metode penentuan alat deteksi ELISA reseptor androgen (AR) tikus (Rat) sama dengan metode penentuan alat deteksi ELISA estradiol. Konsentrasi standar (S0-S5) adalah 0, 25, 50, 100, 200, dan 400 pg/mL.

2.3 Metode pemrosesan statistik

Untuk analisis data, paket statistik medis SPSS17.0 digunakan untuk pemrosesan data statistik. Data pengukuran dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (-x±s). Analisis varians satu arah digunakan untuk perbandingan antar kelompok. Metode LSD digunakan untuk menguji homogenitas varians. , uji Games-Howell digunakan untuk variansi tidak merata, dan uji Ridit digunakan untuk data nilai.

Terlihat dari Tabel 11 dan Gambar 14 bahwa dibandingkan dengan kelompok blanko, indeks timus, indeks limpa, dan indeks uterus tikus pada kelompok model mengalami penurunan yang signifikan (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Pengaruh tingkat indeks biokimia darah pada tikus model perimenopause

Kandungan serum E2, T, LH, FSH, GnRH dan BGP serta kandungan -EP plasma tikus pada masing-masing kelompok ditunjukkan pada Tabel 12~13 dan Gambar 15~17.

Dapat dilihat dari Tabel 12~13 dan Gambar 15~18 bahwa dibandingkan dengan kelompok kosong, kadar serum E2 dan T tikus pada kelompok model mengalami penurunan yang signifikan (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabel 14 Pengaruh Cistanche deserticola feniletanol glikosida terhadap kadar GnRH serum dan -EP plasma pada model perimenopause tikus (-x±s)

Dapat dilihat dari Tabel 14 dan Gambar 19-20 bahwa dibandingkan dengan kelompok kosong, kadar GnRH serum tikus pada kelompok model meningkat secara signifikan dan kadar -EP plasma menurun secara signifikan (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Efek terhadap kandungan ER dan AR pada jaringan tikus model perimenopause

Isi ER dan AR pada jaringan tikus yang relevan di setiap kelompok ditunjukkan pada Tabel 16~17 dan Gambar 22~23.

Terlihat dari Tabel 17 dan Gambar 23 bahwa dibandingkan dengan kelompok blank, kadar AR di hipotalamus kelompok model jauh lebih rendah (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Pengaruh morfologi jaringan organ pada tikus model perimenopause

Hasil pengamatan patologis dan histologis uterus, timus, dan limpa tikus pada masing-masing kelompok eksperimen adalah sebagai berikut. Foto patologis ditunjukkan pada Lampiran 1 untuk foto patologis tikus model perimenopause.

5.1 Pengaruh morfologi jaringan rahim pada tikus model perimenopause

Menurut berbagai tingkat perubahan pada endometrium, kelenjar, dan miometrium tikus di setiap kelompok eksperimen, standar semi-kuantitatif digunakan untuk membagi morfologi jaringan patologis menjadi empat tingkatan, dan rahim tikus di setiap kelompok eksperimen adalah diukur. Hasil observasi disajikan pada Tabel 18.

"-" Sel epitel, kelenjar, miometrium, dan serosa endometrium semuanya normal; "+" sel epitel dan kelenjar endometrium mengalami atrofi, dan miometrium serta serosa normal; "++" epitel endometrium Sel dan kelenjar mengalami atrofi sebagian, lapisan otot sedikit mengalami atrofi, dan serosa normal; Sel epitel dan kelenjar "+++" mengalami atrofi secara signifikan, dan serosanya normal.

Setelah uji Ridit terlihat pada Tabel 18 bahwa dibandingkan dengan kelompok blanko, rahim tikus pada kelompok model menunjukkan lesi jaringan patologis yang signifikan (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Pengaruh morfologi jaringan ovarium pada tikus model perimenopause

Menurut berbagai tingkat perubahan pada folikel, korpus luteum, sel granulosa, dan pembuluh darah di ovarium tikus pada setiap kelompok percobaan, standar semikuantitatif digunakan untuk membagi morfologi jaringan patologis menjadi empat tingkatan. Ovarium tikus pada setiap kelompok percobaan diukur dan diamati. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 19.

Tabel 19 Pengaruh Cistanche deserticola phenyletanol glikosida pada perubahan patologi ovarium pada tikus model perimenopause Unit: saja

"-" dapat menunjukkan folikel yang sedang tumbuh, folikel matang, dan korpus luteum di semua tingkatan. Korpus luteum berkembang dengan baik, dengan banyak lapisan sel granulosa, kaya cairan folikel dan kaya pembuluh darah; "+" dapat menunjukkan folikel yang sedang tumbuh, folikel matang, dan korpus luteum, namun jumlah folikel matang dan korpus luteum sedikit. , folikel lebih kecil, dan sel granulosa lebih sedikit lapisannya; "++" dapat menunjukkan folikel matang dan korpus luteum, dengan lebih banyak korpus luteum, lebih sedikit sel granulosa, dan lebih sedikit pembuluh darah; "+++" tidak memiliki folikel, lebih banyak korpus luteum, dan ovarium Atrofi, avaskular.

Setelah uji Ridit terlihat pada Tabel 19 bahwa dibandingkan dengan kelompok blanko, ovarium tikus kelompok model menunjukkan lesi jaringan patologis yang signifikan (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Efek pada morfologi jaringan timus dan limpa pada tikus model perimenopause

Dengan menggunakan mikrometer, ukur ketebalan bagian yang paling tebal dan tersempit dari korteks timus setiap tikus di setiap kelompok eksperimen untuk mendapatkan rata-rata; Gunakan garis dasar mikrometer untuk jatuh pada bintil limpa, ukur ketebalan bintil limpa di kedua sisi dengan arteri sentral sebagai pusatnya, dan hitung rata-ratanya. Hasil pengukuran ditunjukkan pada Tabel 20 dan Gambar 24.

Dapat dilihat dari Tabel 20 dan Gambar 24 bahwa dibandingkan dengan kelompok kosong, ketebalan korteks timus dan volume nodul limpa pada kelompok model berkurang secara signifikan (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).