Pengaruh Pembuatan Tanaman Herba Cistanche Terhadap Ekspresi Cistanche Iin Vitro N Vitro Oleh Osteoblas Tikus

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

ABSTRAK

Osteoblas (OB) memainkan peran penting dalam remodeling tulang Osteoblas (OB) memainkan peran penting dalam remodeling tulang melalui pelepasan sitokin seperti pelepasan sitokin seperti osteoprotegerin (OOPG), aktivator reseptor faktor nuklir kappa- Ligan B (RA PG), suatu aktivator reseptor faktor nuklir ligan kappa-B NKL) dan osteopontin (OPN). Tujuan dari penelitian kami adalah untuk mengevaluasi efek ekstrak ramuan Cina dariBenteng(Cistanche deserticola) pada ekspresi in vitro sitokin ini dalam kultur sel OB tikus. OB utama diisolasi dari tengkorak tikus dengan pencernaan tripsin dan kolagenase. Fenotipe seluler ditentukan dengan metode pewarnaan Swiss, pewarnaan alkaline phosphatase, pewarnaan Von Kossa, dan pewarnaan Alizarin red. Ekspresi gen OPG, RANKL, dan OPN dianalisis dengan PCR waktu-nyata kuantitatif. Semua perlakuan dengan ekstrak tumbuhan herba Cistanche meningkatkan ekspresi gen OPG dan RANKL pada 72 jam kultur, terutama pada konsentrasi 5×10-2 mg/mL, yang berbeda nyata dibandingkan dengan kultur kontrol. Pengobatan secara signifikan mengurangi ekspresi rasio OPG/RANKL pada 48 jam dan ekspresi mRNA OPN pada 72 jam kultur. Paparan in vitro OB pada persiapan tanaman Cistanche mempromosikan ekspresi gen OPG dan RANKL dan mengurangi ekspresi gen OPG/RANKL dan OPN, dan dengan demikian, dapat menjaga keseimbangan pembentukan dan resorpsi tulang selama metabolisme tulang.

Kata kunci:Cistanche, osteoblas, osteoprotegerin, RANKL, osteopontin, tikus

anti-osteoblas:Ramuan Cistanche

pengantar

Kekuatan tulang ditentukan oleh struktur dan komposisi. Jaringan tulang beradaptasi untuk mengakomodasi berbagai beban dengan pemodelan selama fase pertumbuhan dan remodeling sepanjang hidup. Remodeling tulang menurun seiring dengan penuaan karena penurunan volume tulang yang terbentuk di unit multiseluler dasar, defisiensi hormon seks, dan penurunan pembentukan tulang periosteal (SEEMAN, 2008). Ketidakseimbangan dalam remodeling tulang dapat menyebabkan penyakit yang berhubungan dengan tulang, seperti osteoporosis, dan peningkatan risiko patah tulang.

Osteoporosis, menyebabkan patah tulang, nyeri, dan gangguan dalam bergerak, mempengaruhi jutaan orang di Amerika Serikat (NAYAK et al., 2012; SILVERMAN, 2010). Proses kunci dalam pencegahan kejadian penyakit yang berhubungan dengan tulang adalah mempertahankan kapasitas remodeling tulang.

Remodeling tulang adalah keseimbangan dinamis dari pembentukan dan resorpsi tulang (SEEMAN dan DELMAS, 2006). Proses-proses ini terutama dikendalikan oleh osteoblas (OBs) dan osteoklas pada tulang dewasa, dan oleh ekspresi sitokin, faktor pertumbuhan, dan hormon (PARFITT, 2000). OB, yang berasal dari sel mesenkim primordial, ditemukan pada permukaan tulang. OB bertanggung jawab untuk pembentukan tulang, dan secara tidak langsung berdampak pada resorpsi tulang (MACKIE, 2003). Sitokin yang diekspresikan oleh OB, seperti osteoprotegerin (OPG), receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL), dan osteopontin (OPN), dapat mendorong penyembuhan patah tulang dan meningkatkan pembentukan tulang pada osteoporosis (LINKHART et al., 1996) . Perkembangan OB adalah proses sekuensial yang mencakup proliferasi osteoprogenitor, pematangan matriks, dan mineralisasi sel (GIUSTINA et al., 2008). Proses ini diatur oleh beberapa gen terkait OB dan sangat terkait dengan perkembangan pembentukan tulang (HUNG et al., 2010). Perkembangan mineralisasi osteogenik merangsang pembentukan tulang selama penyembuhan patah tulang. Dengan demikian, penelitian ekspresi sitokin osteogenik dan efeknya pada mineralisasi tulang sangat penting dalam mencari agen terapeutik yang inovatif dan efektif yang berasal dari alam untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan tulang.

Pengobatan Tradisional Cina telah digunakan selama ribuan tahun dalam pengobatan penyakit yang berhubungan dengan tulang. Tanaman herba Cistanche, yang banyak digunakan untuk menyegarkan ginjal dan dalam terapi penyakit tulang, termasuk dalam genus famili Orobanchaceae. Telah dilaporkan bahwa konstituen dari spesies Cistanche adalah: glikosida fenilethanoid (PhGs), iridoid, lignan, alditol, dan oligosakarida (JIANG dan TU, 2009; LI et al., 2010). Tanaman Cistanche adalah tumbuhan parasit abadi, yang terutama tumbuh di padang pasir atau di jilatan garam tandus, terutama didistribusikan di gurun yang gersang dan hangat di barat laut Cina. Dalam Pengobatan Tradisional Cina Cistanche dianggap sebagai tonik yang luar biasa, dan diberi nama "Ginseng gurun". Sebuah studi yang dilakukan pada tikus ovariektomi (LIANG et al., 2011) menunjukkan bahwaEkstrak cistanchediberikan secara oral secara signifikan meningkatkan kepadatan mineral tulang dan kandungan mineral tulang dengan cara yang bergantung pada dosis. Namun, mekanisme rinci aksi Cistanche pada pembentukan tulang masih belum jelas. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai efek Cistanche pada ekspresi in vitro gen untuk sitokin OPG, RANKL, dan OPN oleh kultur sel OB tikus, dan untuk mengevaluasi mekanisme dimana Cistanche mempromosikan penyembuhan tulang atau mencegah/mengendalikannya. penyakit yang berhubungan dengan tulang.

Ramuan Cistanche untuk pencegahan penyakit yang berhubungan dengan tulang

Bahan dan metode

Persiapan osteoblas tikus. OB tikus dibuat dari calvarias tikus neonatal (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Persiapan ekstrak air Cistanche dalam pengenceran serial. Cistanche yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Apotek Tongrentang di China. Potongan-potongan kering Cistanche digiling menjadi bubuk. Ekstrak cair Cistanche dibuat dengan merebus 50 g bubuk herbal selama 1 jam. Selanjutnya, preparat dipekatkan hingga 100 mL menggunakan rotary evaporator dan disaring melalui filter 0,22 mm. Filtrat disimpan pada 4 derajat dalam gelap. Ekstrak cair Cistanche diencerkan dengan konsentrasi serial mulai dari 5×10 -1 hingga 5×10-4 mg/mL dengan cairan DMEM.

Isolasi RNA dan PCR transkripsi balik. Generasi ketiga OB berbudaya diperlakukan dengan konsentrasi ekstrak Cistanche yang berbeda selama 24, 48, dan 72 jam. Perawatan kultur sel OB dilakukan dalam rangkap tiga. Sel dicuci dengan Phosphate buffered saline (PBS) dua kali dan RNA diisolasi dari sel dengan reagen TransZol (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, China) sesuai dengan instruksi pabrik, dan diekstraksi dengan kloroform, diendapkan dengan isopropil alkohol, dicuci dengan etil alkohol 75 persen lalu dilarutkan dalam air. Transkripsi terbalik RNA (5 L) dilakukan menggunakan TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix (Trans, Beijing, China).

Konfirmasi produk PCR real-time. Setelah elektroforesis pada 1,5 persen gel agarosa, sekuensing DNA dilakukan untuk membuktikan bahwa produk PCR adalah segmen gen penyandi OPG, RANKL, dan OPN pada tikus OB.

Pembentukan plasmid yang mengandung gen target. Urutan DNA dalam 2 persen gel agarosa dimurnikan dan dipulihkan dengan ekstraksi gel EZNA (Kangweishiji, Cina) dan dipindahkan ke kit kloning pEASY-T3 (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Cina). Transformasi sel dicapai melalui plasmid yang dibangun yang mengandung gen target. Koloni positif disaring dengan uji skrining bintik biru-putih dan selanjutnya diurutkan. Plasmid yang diekstraksi dari koloni positif, yang mengandung gen target, diencerkan secara proporsional dengan air deionisasi untuk mencapai kurva standar. PCR waktu-nyata kuantitatif (RTQ PCR). Primer spesifik dibangun sesuai dengan urutan gen yang diterbitkan (NCBI, Nucleotide Database) dan disintesis oleh Liuhe-Nuada Gene (Beijing, China) seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1.

Ekspresi mRNA dalam sampel dikuantifikasi menggunakan kurva standar plasmid spesifik yang dijelaskan di atas. Produk-produk tersebut dibandingkan dengan gen pemeliharaan rumah -aktin. Kuantitas gen target dikuantifikasi dengan RTQ PCR, menggunakan SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, China) sesuai dengan protokol pabrikan. Kondisi PCR adalah sebagai berikut: 94 derajat selama 1 menit, 58 derajat selama 30 detik, 68 derajat selama 1 menit dan diulang selama 40 siklus. Data dihitung menggunakan 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems; Waltham, MA, USA).

Analisis statistik. Data diproses dengan ANOVA satu arah, menggunakan perangkat lunak statistik komersial (SPSS 17.0, IBM Corporation; Armonk, NY, USA). Hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi gen target dan rasio -aktin. Perbedaan dianggap signifikan pada P<0.05>

Khasiat ramuan cistanche: mencegah penyakit tulang

Hasil

Identifikasi OB tikus. OB diidentifikasi dengan metode pewarnaan sel tertentu dan ditunjukkan secara fenotipik seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. (A, B, C, dan D)

Konfirmasi gen target. Ukuran pita gen target dianalisis dalam 2 persen gel agarosa dan ditemukan konsisten dengan ukuran yang diharapkan (Gbr. 2).

Hasil yang diperoleh untuk segmen gen OPG, RANKL, OPN dan -aktin yang mengandung sekuens plasmid gen target dibandingkan dengan sekuens gen terkait yang sebelumnya diterbitkan dalam GENBANK dengan analisis BLAST-N, dan ditemukan: 100 persen , 100 persen , 100 persen dan 99 persen identik, masing-masing.

Pengaruh ekstrak cair Cistanche pada ekspresi OPG, RANKL dan OPN. Tingkat mRNA OPG diatur ke bawah ketika OB terkena semua konsentrasi Cistanche yang diterapkan selama 24 jam dan 48 jam (Tabel 2).

Perbedaan yang signifikan diamati pada konsentrasi 5×10-1, 5×10-2 dan 5×10-4 mg/mL setelah 24 jam, dan pada konsentrasi 5×10-1 dan 5 ×10-2 mg/mL setelah 48 jam kultur (P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Diskusi

Osteoblas (OBs) tidak hanya memainkan peran penting dalam menciptakan arsitektur tulang tetapi juga dalam homeostasis kalsium, dengan mengatur aktivitas osteoklastik (MACKIE, 2003). Ada penyakit tulang tertentu yang berhubungan dengan fungsi atau disfungsi OB, seperti osteoporosis. Penanda fenotipik penampilan OB terutama adalah proliferasi dan diferensiasinya, dan, kedua, mineralisasi nodul tulang (PAN et al., 2005). OPG dan RANKL adalah anggota dari famili sitokin tumor necrosis factor (TNF), dan mereka adalah protein turunan OB yang penting untuk regulasi dan pemeliharaan massa tulang (HUMPHREY et al., 2006; REINHOLZ et al., 2002). RANKL mengatur diferensiasi, aktivasi, dan kelangsungan hidup osteoklas. RANKL juga dapat meningkatkan resorpsi tulang dengan berinteraksi dengan reseptornya pada membran osteoklastik (SODEK et al., 2000). OPG adalah reseptor umpan untuk RANKL dan mencegah RANKL mengikat reseptornya (RANK). Hubungan RANK/RANKL/OPG mengontrol keseimbangan antara pembentukan dan resorpsi tulang, dengan mengatur aktivitas OB dan osteoklas (SODEK dkk., 2000; HUMPHREY dkk., 2006; MAZZIOTI dkk., 2012). Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa penurunan rasio OPG/RANKL dapat menginduksi resorpsi tulang dengan meningkatkan aktivasi osteoklas.

Pada penelitian ini, semua perlakuan dengan preparat herba Cistanche meningkatkan ekspresi gen OPG dan RANKL pada 72 jam, terutama pada konsentrasi 5×10-2 mg/mL dan 5×10-3 mg/mL, yang berbeda nyata dibandingkan dengan kultur kontrol.

Sebaliknya, ekspresi OPG secara signifikan mengalami penurunan regulasi setelah 24 dan 48 jam kultur dengan ekstrak Cistanche. Ekspresi rasio OPG/RANKL secara signifikan mengalami penurunan regulasi ketika OB diobati dengan Cistanche selama 24 jam dan 48 jam. Juga, ekstrak Cistanche tidak memiliki efek yang signifikan pada kultur OB setelah 72 jam pengobatan. Kami berhipotesis bahwa ekstrak cair Cistanche dapat meningkatkan aktivasi osteoklas setelah 24 jam dan 48 jam melalui ekspresi OPG/RANKL yang diatur, tetapi mungkin tidak memiliki efek apa pun pada aktivasi osteoklas setelah 72 jam. OPN memiliki beberapa keragaman fungsional dalam pembentukan dan remodeling tulang yang berkaitan dengan peran mendasar OPN dalam pertahanan inang dan perbaikan jaringan. Peran utama OPN tampaknya menjadi regulasi umpan balik negatif pada tingkat sistemik, promosi adhesi sel OB, induksi peristiwa kalsifikasi awal, dan juga kontrol ukuran dan bentuk kristal mineral (SODEK et al., 2000). Selain itu, telah dikonfirmasi bahwa OPN dapat mewakili protein jembatan, meningkatkan kekakuan arteri selama peradangan, dan akibatnya dapat menyebabkan kerusakan sendi dan meningkatkan risiko kardiovaskular pada pasien dengan rheumatoid arthritis (BAZZICHI et al., 2009).

Dalam penelitian kami, kami telah menunjukkan bahwa ekstrak cair Cistanche menurunkan ekspresi OPN. Kecenderungan penurunan konsentrasi OPN dalam kultur OB dibandingkan dengan kultur kontrol yang diamati pada kultur 24 jam dan 48 jam, dan tingkat yang secara signifikan lebih rendah tercatat pada 72 jam, menunjukkan bahwa Cistanche dapat meningkatkan pembentukan tulang, seperti yang ditunjukkan oleh percobaan in vitro.

Pemaparan in vitro kultur OB ke Cistanche secara signifikan meningkatkan ekspresi gen OPG dan RANKL setelah 72 jam, mengurangi ekspresi gen OPG/RANKL setelah 24 jam dan 48 jam, dan menurunkan ekspresi OPN setelah 72 jam kultur.

ItuRamuan Cistancheselalu digunakan sebagai resep yang terdiri dari beberapa ramuan Cina, oleh karena itu efektivitas klinis Cistanche yang digunakan dalam penelitian ini dan komponen dalam ekstrak cairnya kompleks dan belum jelas. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa ekstrak Cistanche mempengaruhi ekspresi OPG dan RANKL ketika diterapkan pada tikus OB dalam kultur sel, tetapi tingkat ekspresinya bervariasi, tergantung pada konsentrasi ekstrak Cistanche dan durasi kultur. Konsentrasi yang tepat dari ekstrak cair Cistanche deserticola, dalam kombinasi dengan durasi yang tepat dari paparan OB tikus, dapat menjaga keseimbangan pembentukan tulang dan resorpsi selama metabolisme tulang.

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan pengetahuan kita tentang bahan bioaktif Cistanche dan konsentrasinya dalam sediaan, untuk divalidasi sebagai modulator sitokin untuk restorasi dan perbaikan tulang.

suplemen cistanche: mencegah keropos tulang

Referensi

BAZZICHI, L., L. GHIADONI, A. ROSSI, M. BERNARDINI, M. LANZA, F. DE FEO, C. GIACOMELLI, I. MENCARONI, K. RAIMO, M. ROSSI, AM MAZZONE, S. TADDEI, S BOMBARDIERI (2009): Osteopontin dikaitkan dengan peningkatan kekakuan arteri pada rheumatoid arthritis. mol. Med. 15, 402-406.

GIUSTINA, A., G. MAZZIOTTI, E. CANALIS (2008): Hormon pertumbuhan, faktor pertumbuhan seperti insulin, dan kerangka. Endokr. Wahyu 29, 535-559.

HUMPHREY, EL, JH WILLIAMS, MW DAVIE, MJ MARSHALL (2006): Efek glukokortikoid terdisosiasi pada OPG dan RANKL dalam sel osteoblastik. Tulang 38, 652-661.

HUNG, TY, TL CHEN, MH Liao, WP HO, DZ LIU, WC CHUANG, RM CHEN (2010): Drynaria fortunei J. Sm. mempromosikan pematangan osteoblas dengan menginduksi ekspresi gen terkait diferensiasi dan melindungi terhadap penghinaan apoptosis yang diinduksi stres oksidatif. J. Etnofarmaka. 131, 70-77.

JIANG, Y., PF TU (2009): Analisis kandungan kimia dalam spesies Cistanche. J. Kromatografi. A.1216, 1970-1979.

LI, Y., Y. SONG, H. ZHANG (2010): Kemajuan dalam penelitian konstituen kimia dan aktivitas obat cistanche. Sumber Daya Tumbuhan Liar Cina 29, 7-11.

LIANG, H., F. YU, Z. TONG, Z. HUANG (2011): Pengaruh ekstrak air Cistanches Herba pada keropos tulang pada tikus yang diovariektomi. Int. J. Mol. Sci. 12, 5060-5069.

LINKHART, TA, S. MOHAN, DJ BAYLINK (1996): Faktor pertumbuhan untuk pertumbuhan dan perbaikan tulang: IGF, TGF beta dan BMP. Tulang 19, S1-S12.

MACKIE, EJ (2003): Osteoblas: peran baru dalam orkestrasi arsitektur kerangka. Int. J. Biokimia. Biol Sel. 35, 1301-1305.

MAZZIOTTI, G., J. BILEZIKIAN, E. CANALIS, D. COCCHI, A. GIUSTINA (2012): Pemahaman dan pengobatan baru untuk osteoporosis. Endokrin 41, 58-69.

NAYAK, S., MS ROBERTS, SL GREENSPAN (2012): Dampak biaya alendronate generik pada efektivitas biaya skrining dan pengobatan osteoporosis. PLoS ONE 7(3): e32879. doi:10.1371/journal.pone.0032879.

PAN, W., LD QUARLES, LH SONG, YH YU, C. JIAO, HB TANG, CH JIANG, H.

W. Deng, YJ LI, HH ZHOU, ZS XIAO (2005): Genistein merangsang diferensiasi osteoblastik melalui NO/cGMP dalam kultur sumsum tulang. J. Biokimia Sel. 94, 307-316.

PARFITT, AM (2000): Mekanisme kopling: peran pembuluh darah. Tulang 26, 319-323. REINHOLZ, MM, SJ ITURRIA, JN INGLE, PC ROCHE (2002): Gen diferensial

ekspresi anggota keluarga TGF- dan osteopontin dalam analisis jaringan tumor payudara dengan PCR kuantitatif real-time. Kanker Payudara Res. Merawat. 74, 255-269.

SEEMAN, E. (2008): Kualitas tulang: bahan dan dasar struktural kekuatan tulang. J. Penambang Tulang. Meta 26, 1-8.

SEEMAN, E., PD DELMAS (2006): Kualitas tulang-bahan dan dasar struktural kekuatan dan kerapuhan tulang. N. Inggris. J. Med. 354, 2250-2261.SILVERMAN, SL (2010): Terapi osteoporosis: bukti dari database layanan kesehatan dan studi populasi observasional. Calcif. Jaringan Int. 87, 375-384.

SODEK, J., B. GANSS, MD MCKEE (2000): Osteopontin. Kritis. Pdt. Oral Biol. Med. 11, 279- 303.