Cistanche:Echinacoside Menekan Pertumbuhan Sel Adenokarsinoma Pankreas Dengan Menginduksi Apoptosis Melalui Jalur Protein Kinase yang Diaktifkan Mitogen

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG dan XINFENG LI

Abstrak.

Aplikasi klinis produk alami yang berasal dari pengobatan tradisional Tiongkok telah mendapat perhatian dalam kemoterapi kanker.echinacosida(ECH), salah satu fenilethanoid, diisolasi dari batangBenteng(obat herbal Cina) memiliki efek pelindung jaringan dan anti-apoptosis pada sistem saraf pusat. Namun, sebagian besar masih sulit dipahami apakah ECH memiliki aktivitas penekan tumor. Dalam penelitian ini, ditunjukkan bahwa ECH dapat secara nyata menghambat proliferasi sel adenokarsinoma pankreas dengan menginduksi produksi spesies oksigen reaktif dan gangguan potensial membran mitokondria dan dengan demikian memicu apoptosis. Selanjutnya, dijelaskan bahwa ECH(echinacosida)menekan pertumbuhan sel tumor melalui modulasi aktivitas MAPK. Kesimpulannya, penelitian ini mengungkapkan fungsi baru dari ECH(echinacosida) dalam mencegah perkembangan kanker, dan menyiratkan bahwa penggunaan ECH bisa menjadi strategi kemoterapi potensial untuk kanker.

pengantar

Jalur penekan tumor p53 melalui induksi penekan tumor, ARF mengurangi degradasi p53 yang dimediasi oleh E3-ligase onkogenik (MDM)2- (3). Ini adalah mekanisme perlindungan diri yang diatur secara otomatis yang mencegah sel dari transformasi ganas. Khususnya, p53 dapat menekan aktivitas Myc dengan mengaktifkan transkripsi, misalnya, miR-145 yang menargetkanMycomRNA untuk pembungkaman terjemahan (4,5), sehingga membentuk loop regulasi umpan balik negatif.

Strategi yang paling mudah dan efektif untuk mengobati kanker adalah dengan membunuh sel-sel kanker. Obat antikanker yang umum digunakan, seperti cisplatin (6), actinomycin D (7), dan adriamycin (8) terbukti menghambat pertumbuhan tumor dengan mempromosikan apoptosis. Baru-baru ini, semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa sejumlah produk alami dan turunan dari tanaman, terutama dari tanaman obat yang digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok (TCM), menunjukkan fungsi penekan tumor dengan menginduksi apoptosis sel kanker dan memiliki potensi untuk aplikasi klinis. dalam terapi kanker (9). Misalnya, antrakuinon emodin alami diisolasi dari berbagai jenis sel kanker (10,11). Camptothecin, berasal dari 'pohon bahagia' Cina,Camptotheca tajam, adalah produk alami yang berharga yang menghambat ligasi DNA setelah pemutusan untai yang dimediasi topo I (12). Dalam studi kohort berbasis populasi retrospektif lainnya dari total 729 pasien dengan kanker payudara stadium lanjut, disarankan bahwa terapi TCM dapat berkontribusi pada pengobatan kanker. Dari kohort ini, 115 pasien adalah pengguna TCM sementara 614 pasien tidak menggunakan TCM. Analisis multivariat menunjukkan bahwa, dibandingkan dengan non-pengguna, penggunaan TCM dikaitkan dengan penurunan risiko semua penyebab kematian secara signifikan (13). Semua temuan di atas menunjukkan bahwa TCM merupakan pengobatan komplementer dan alternatif penting yang dapat digunakan dalam pengobatan kanker.

tikus dengan cedera paru akut (16,17). Juga, ECH(echinacosida)telah terbukti memiliki efek perlindungan pada jaringan saraf dan memperbaiki gangguan perilaku pada model murine penyakit Parkinson (18). Khususnya, telah ditemukan bahwa ECH mendorong proliferasi sel dan menghambat apoptosis pada sel MODE-K epitel usus tikus (19). Sejauh ini, bagaimanapun, kurang perhatian telah diberikan pada peran potensial ECH dalam pencegahan kanker.

Dalam penelitian ini, dieksplorasi apakah pengobatan ECH mempengaruhi pertumbuhan dan proliferasi sel tumor dan apakah ECH(echinacosida)menginduksi apoptosis, meningkatkan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan mengurangi potensial membran mitokondria (MMP), dan akibatnya menekan pertumbuhan sel tumor. Selanjutnya, penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mekanisme molekuler yang bertanggung jawab untuk penghambatan pertumbuhan sel yang dimediasi ECH.

Bahan: dan metode

Sel garis, reagen, dan antibodi.SW1990 sel adenokarsinoma pankreas (ATCC, Manassas, VA, USA) dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi, penisilin 50 U/ml dan streptomisin 0,1 mg/ml pada suhu 37˚C dalam 5 persen CO2 atmosfer yang dilembabkan. ECH(echinacosida)dibeli dari Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, China). Antibodi terhadap AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38, dan GAPDH dibeli dari Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax dan anti-Bcl-2 dibeli dari Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); dan anti-Caspase-3 dibeli dari Abcam (Shanghai, China).

Sel kelangsungan hiduppengujian kadar logam. Untuk menilai tingkat pertumbuhan sel tumor, Cell Counting kit{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Suspensi sel diunggulkan pada 5,000 sel per sumur dengan perlakuan ECH selama 0, 12, 24, 48 atau 72 jam dalam 96 -pelat kultur sumur. Penghambatan pertumbuhan sel ditentukan dengan menambahkan reagen WST-8 dari kit CCK‑8 pada konsentrasi akhir 10 persen untuk setiap sumur, dan absorbansi sampel diukur pada 450 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, AS).

Hoechst 33342 pewarnaan.Sel (pertemuan 60 persen) diperlakukan dengan Hoechst 33342 (Institut Bioteknologi Beyotime, Haimen, Cina) pada konsentrasi akhir 1µg/ml, diinkubasi dalam inkubator 37˚C selama 15 menit, dicuci dengan saline buffer fosfat dua kali, difiksasi dalam paraformaldehida 4 persen selama 30 menit pada suhu kamar, dan dipasang pada slide. Perubahan morfologi inti sel diamati di bawah mikroskop fluoresensi (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Inti normal berbentuk bulat dan bernoda biru muda, sedangkan inti apoptotik mengerut dan bernoda biru cerah.

Fluoresensi diaktifkan sel penyortiran (FACS) analisis.Untuk penilaian apoptosis, kit Deteksi Apoptosis fluorescein isothiocyanate (FITC)-Annexin V (BD Biosciences, Shanghai, China) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, 5x104 sel dicuci dengan PBS dingin, disuspensikan kembali dalam 0,1 ml buffer pengikat (Beyotime Institute of Biotechnology), dan diwarnai dengan 10 ml Annexin V terkonjugasi FITC (10 mg/ml) dan 10 ml propidium iodida (PI) (50 mg/ml). Setelah inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar dalam gelap dan penambahan 400 ml buffer pengikat, sel dianalisis dengan flow cytometer (C6; BD Biosciences, Shanghai, China).

Pengukuran dari reaktif oksigen jenis (ROS).Untuk mengevaluasi produksi ROS, kit Reactive Oxygen Species Assay (Vigorous Biotechnology, Beijing, China) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sel (pertemuan 80 persen) dipanen dan dicuci dengan PBS sebelum diwarnai dengan larutan dihydroethidium (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Sel kemudian dianalisis dengan analisis flow cytometric.

Pengukuran dari mitokondria selaput potensi (MMP).

Kit uji tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) digunakan untuk mendeteksi perubahan MMP. Secara singkat, sel (pertemuan 80 persen) dipanen, dicuci dengan PBS dan diwarnai dengan TMRM selama 15-20 menit dalam inkubator 37˚C. Sel kemudian dicuci sekali dengan PBS dan menjadi sasaran analisis aliran sitometrik.

Imunoblottinganalisis. Sel (80 persen pertemuan) dipanen dan dilisiskan dalam buffer RIPA (Jrdun Biotechnology) yang terdiri dari 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 persen NP‑40, 1 persen asam natrium deoksikolat dan 0,1 persen SDS dan inhibitor proteasome yang baru ditambahkan. Jumlah yang sama dari lisat sel bening digunakan untuk analisis imunoblotting seperti yang dijelaskan sebelumnya (20).

Statistik analisis.Data kuantitatif dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perbedaan statistik dievaluasi dengan uji-t Student tidak berpasangan menggunakan perangkat lunak SPSS 15.0 statistik. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Hasil

ECH (echinacosida)menekan tumor selpertumbuhan. Meskipun telah dilaporkan bahwa ECH(echinacosida)menunjukkan peran protektif dengan menghambat apoptosis dan sinyal inflamasi dalam sel somatik, seperti sel epitel saraf dan usus (16-19), masih sulit dipahami apakah ECH mengontrol pertumbuhan dan proliferasi sel kanker. Untuk menguji ini, uji kelangsungan hidup sel dilakukan dengan merawat sel SW1990, yang berasal dari adenokarsinoma pankreas grade II, dengan dosis ECH yang dititrasi seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1. Khususnya, ditunjukkan bahwa ECH secara signifikan menghambat proliferasi sel tumor dalam dosis -bergantung selama 5-hari periode budaya (Gbr. 1).ECH pemicuapoptosis. Karena hilangnya apoptosis adalah salah satu mekanisme penyebab utama yang mendasari proliferasi sel kanker pankreas yang tidak terkontrol (21), penelitian ini melakukan serangkaian eksperimen untuk menentukan apakah ECH memicu apoptosis. Pertama, dengan pewarnaan inti sel tumor dengan Hoechst 33342, ditunjukkan bahwa ECH menghasilkan apoptosis dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 2A). Selain itu, analisis FACS dilakukan menggunakan pewarnaan Annexin V/PI untuk mengkonfirmasi lebih lanjut efek apoptosis ty ECH (Gbr. 2B). Persentase rata-rata sel apoptosis adalah 1,1 persen dalam kondisi kultur normal, sementara persentase ini meningkat secara signifikan menjadi 10,6, 21,4 dan 51,3 persen sebagai respons terhadap pengobatan ECH dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 2C). Hasil ini, bersama dengan uji viabilitas sel yang ditunjukkan pada Gambar. 1, menunjukkan bahwa pengobatan ECH menekan proliferasi sel tumor dengan memicu apoptosis.

menghasilkan etidium yang berinterkalasi dengan DNA, digunakan dalam penelitian ini untuk mengevaluasi produksi ROS. Ditemukan bahwa, seperti obat antikanker lainnya, ECH juga merangsang produksi ROS dengan cara yang bergantung pada dosis seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan intensitas fluoresensi pada pengobatan ECH (Gbr. 3).

ECH (echinacosida)mengurangi MMP.Disfungsi mitokondria telah terbukti terlibat dalam induksi apoptosis. Pembukaan pori transisi permeabilitas mitokondria telah ditunjukkan untuk menginduksi depolarisasi potensi transmembran dan pelepasan faktor pro-apoptosis (23). Oleh karena itu, diuji apakah ECH dapat menginduksi hilangnya MMP dalam sel tumor dengan melakukan uji TMRM, yang merupakan pendekatan yang sudah mapan, karena intensitas fluoresensi TMRM sebanding dengan potensi membran. Itu menunjukkan bahwa pengobatan ECH secara signifikan mengurangi MMP dengan cara yang tergantung dosis (Gbr. 4).ECH kontrol tumor sel pertumbuhan melalui mitogen (protein yang diaktifkan)dasar molekuler kematian sel tumor yang dimediasi ECH, aktivitas beberapa jalur pensinyalan vital, seperti MAPK dan AKT (24,25), yang mengontrol kelangsungan hidup dan kematian sel diperiksa. MAPK adalah protein kinase Ser/Thr yang dikonservasi secara evolusioner, termasuk kinase yang diatur sinyal ekstraseluler (ERKs), c-Jun NH2-terminal kinase (JNKs) dan anggota keluarga p38 yang diaktifkan melalui tiga- kaskade pensinyalan tingkat kinase (26,27). Dalam penelitian ini, ekspresi MAPK dan AKT, serta bentuk terfosforilasi teraktivasinya, dinilai dan terungkap bahwa ECH secara nyata menekan aktivitas JNK dan ERK1/2, tetapi meningkatkan aktivitas p38 (Gbr. 5). Khususnya, ditunjukkan bahwa aktivitas AKT, yang juga sangat penting untuk proliferasi sel, tidak terpengaruh oleh pengobatan ECH (Gbr. 5). Selain itu, ditunjukkan bahwa pengobatan ECH meningkatkan ekspresi Bax dan Caspase-3 sementara mengurangi ekspresi Bcl-2 (Gbr. 5), yang konsisten dengan Gbr. 2. Dengan demikian, hasilnya menunjukkan bahwa ECH memicu apoptosis sel tumor melalui jalur MAPK.

Diskusi

Sejauh pengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang menunjukkan bahwa ECH memiliki fungsi penekan tumor dengan memicu apoptosis (Gbr. 2), mempromosikan produksi ROS (Gbr. 3) dan menginduksi depolarisasi potensial membran mitokondria (Gbr. 4) , akibatnya menyebabkan penghambatan pertumbuhan sel tumor (Gbr. 1). Selanjutnya, dasar molekuler kematian sel tumor yang dimediasi ECH terbukti terjadi dengan mengatur jalur pensinyalan MAPK (Gbr. 5). Temuan ini menunjukkan fungsi baru ECH dalam mencegah tumorigenesis dan dengan demikian menunjukkan bahwa itu mungkin menjadi agen kandidat untuk terapi kanker.

Mayoritas obat antikanker dapat menginduksi apoptosis sel tumor, penuaan dan/atau penghentian siklus sel, yang mengarah pada penghambatan pertumbuhan dan proliferasi sel tumor. Penangkapan siklus sel adalah respons seluler terhadap sinyal stres ringan yang memungkinkan sel untuk memperbaiki DNA yang rusak sebelum memulai sintesis DNA replikasi atau mitosis, sedangkan apoptosis dan penuaan (penahanan siklus sel permanen) terjadi sebagai respons terhadap sinyal stres yang menghilangkan sel yang tidak dapat diperbaiki atau ganas. 28,29). Oleh karena itu, hanya efek apoptosis ECH pada sel tumor yang dinilai dalam penelitian ini, karena membunuh sel kanker merupakan kriteria utama untuk mengevaluasi potensi agen antikanker. Khususnya, ditunjukkan bahwa ECH menginduksi ekspresiBax(Gbr. 5), sebuah gen pro-apoptosis, yang diaktifkan secara transkripsi oleh penekan tumor p53 (30). Dengan demikian, penting untuk menguji apakah ECH dapat mengaktifkan jalur pensinyalan p53. Jika demikian, ECH mungkin juga dapat menimbulkan p53-penahanan siklus sel yang bergantung pada p53-penuaan, apoptosis, atau autophagy. Dalam penelitian ini, fungsi penekan tumor ECH dalam garis sel adenokarsinoma pankreas SW1990 dijelaskan. Namun, penelitian lebih lanjut yang mengamati lebih banyak garis sel kanker pankreas, diperlukan. Telah ditunjukkan bahwa mutasi pada protein onkogenik RAS dan penekan tumor p53 berhubungan dengan perkembangan kanker pankreas (31); namun, garis sel SW1990 tidak menyimpan mutasi p53 apa pun, menurut database p53 IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Oleh karena itu, penting untuk menyelidiki apakah ECH dapat mempengaruhi pertumbuhan dan proliferasi garis sel kanker pankreas lainnya dengan mutasi p53 yang berbeda. Selain itu, akan menarik untuk menentukan apakah ECH mampu mendorong apoptosis dan menghambat pertumbuhan jenis tumor lainnya.

Peningkatan ROS dan pengurangan MMP, yang disebabkan oleh pengobatan ECH, telah terbukti penting dalam induksi apoptosis (22). Selain itu, telah ditemukan bahwa ROS dapat menginduksi oksidasi pori-pori mitokondria yang berkontribusi pada pelepasan sitokromc, perantara dalam apoptosis, karena gangguan MMP (22). Dengan demikian, masih harus ditentukan apakah ECH mengganggu MMP secara tidak langsung melalui induksi ROS. Selain itu, stres oksidatif yang ditimbulkan oleh ROS juga telah terbukti terlibat dalam memodulasi berbagai sinyal pengontrol pertumbuhan sel, termasuk p53, NF-kB, HIFs dan PI3K (32). Masih harus ditentukan apakah dan, jika demikian, bagaimana ECH mengatur jalur pensinyalan penting ini. Khususnya, stres oksidatif menyebabkan berbagai penyakit neurodegeneratif karena konsumsi oksigen yang tinggi, sistem antioksidan yang lemah dan karakteristik diferensiasi terminal dari sistem saraf pusat (33). Namun, beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa ECH memiliki efek protektif dan anti-apoptosis pada jaringan saraf. Dalam hal ini, masuk akal untuk berhipotesis bahwa ECH dapat mengurangi produksi ROS dalam sel saraf yang berdiferensiasi terminal. Oleh karena itu, masih harus ditentukan apakah regulasi produksi ROS oleh ECH bergantung pada status diferensiasi sel. Oleh karena itu, hasil saat ini bersama dengan penelitian lain mengungkapkan bahwa ECH, TCM yang banyak digunakan, dapat menjadi strategi kemoterapi yang penting tidak hanya untuk pengobatan penyakit neurodegeneratif tetapi juga karsinoma ganas.

Baru-baru ini, penggunaan TCM dalam terapi kanker semakin mendapat perhatian. Potensi produk alam dari tanaman obat yang digunakan dalam TCM telah diakui oleh masyarakat ilmiah bahkan di dunia barat (9). Upaya diperlukan untuk menjelaskan mekanisme yang mendasari tindakan produk alami ini, yang pada akhirnya dapat mengarah pada pengembangan obat yang efisien dan aman untuk terapi kanker.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan fungsi penghambatan tumor ECH dan juga menguraikan dasar molekuler dari penekanan tumor yang dimediasi ECH, sehingga menunjukkan potensi aplikasi klinis ECH dalam terapi kanker.

Ucapan Terima Kasih

Studi ini didanai dan didukung oleh Program Utama Riset Ilmiah KPH (hibah no. 09ZD014). Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada Biomedworld (Shanghai, China) atas bantuannya dalam mengedit naskah.

Referensi

1. Hanahan D dan Weinberg RA: Ciri-ciri kanker: Generasi berikutnya. Sel 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripsi: Efek transkripsi dari MYC. Nat Rev Kanker 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ dan Roussel MF: Pensinyalan Myc melalui penekan tumor ARF mengatur p53-apoptosis dan keabadian bergantung. Pengembangan Gen 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K dan Mo YY: p53 menekan c-Myc melalui induksi penekan tumor miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X dan Lu H: Wawasan baru tentang fungsi p53 melalui microRNA targetnya. J Mol Sel Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB dan Lippard SJ: Cisplatin dan perbaikan DNA pada kemoterapi kanker. Tren Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H dan Korc M: Actinomycin D menginduksi apoptosis dan menghambat pertumbuhan sel kanker pankreas. Kanker J Int 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P dan Dass CR: Doxorubicin: Pembaruan pada aksi molekuler antikanker, toksisitas dan sistem pengiriman obat baru. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS dan Kaina B: Dari pengobatan tradisional Tiongkok hingga terapi kanker rasional. Tren Mol Med 13: 353-361, 2007.