Efek Modulasi Ganda Diosmin Pada Proses Pembentukan Batu Ginjal Kalsium Oksalat: Kristalisasi, Pertumbuhan, Agregasi, Adhesi Sel Kristal, Internalisasi Ke Sel Tubulus Ginjal, Dan Invasi Melalui Matriks Ekstraseluler
Mar 16, 2022
untuk informasi lebih lanjut:ali.ma@wecistanche.com
Supaporn Khamchuna,b,c,1, Sunisa Yoodeea,1, Kunjungi Thongbookerda,*
aUnit Proteomik Medis, Kantor Penelitian dan Pengembangan, Fakultas Kedokteran Rumah Sakit Siriraj, Universitas Mahidol, Bangkok 10700, Thailand
bDepartemen Teknologi Medis, Sekolah Ilmu Kesehatan Sekutu, Universitas Phayao, Phayao 56000, Thailand
cUnit Keunggulan dalam Biomedis Molekuler Integratif, Sekolah Ilmu Kesehatan Sekutu, Universitas Phayao, Phayao 56000, Thailand
Kata kunci: Senyawa bioaktif, Flavonoid, Inhibitor, Modulator, Nefrolitiasis, Promotor, Urolitiasis
ABSTRAK
Diosminadalah flavon glikosida (bioflavonoid) alami yang ditemukan dalam buah-buahan dan tanaman dengan beberapa aktivitas farmakologis. Telah banyak digunakan sebagai suplemen makanan atau agen terapi dalam berbagai penyakit/gangguan. Meskipun direkomendasikan, bukti mekanisme perlindungannya terhadapginjalpenyakit batu (nefrolitiasis/urolitiasis), terutama kalsium oksalat (CaOx) monohydrate (COM) yang merupakan jenis yang paling umum, masih belum jelas. Dalam penelitian ini, kami dengan demikian secara sistematis mengevaluasi efek daridiosmin(pada 2,5–160 nM) pada berbagai tahapginjalproses pembentukan batu, termasuk kristalisasi COM, pertumbuhan kristal, agregasi, adhesi sel kristal, internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal dan invasi melalui matriks ekstraseluler (ECM). Hasilnya menunjukkan bahwadiosminmemiliki efek modulasi tergantung dosis pada semua proses batu ginjal COM yang disebutkan.Diosminsecara signifikan meningkatkan jumlah dan massa kristal COM selama kristalisasi, tetapi mengurangi ukuran dan pertumbuhan kristal. Ketikadiosminmempromosikan agregasi kristal, menghambat adhesi sel kristal dan internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal. Akhirnya, diosmin mempromosikan invasi kristal melalui ECM. Data kami memberikan bukti yang menunjukkan efek penghambatan dan peningkatan diosmin pada COMginjalproses pembentukan batu. Berdasarkan aktivitas modulasi ganda diosmin ini, peran anti-urolitiasis diragukan dan harus dibuat hati-hati untuk penggunaannya dalamginjalpenyakit batu.
1. Perkenalan
Diosmin(3′,5,7-trihidroksi-4′-methoxyflavone-7-rhamnoglucoside) adalah bioflavonoid alami yang banyak ditemukan di berbagai tanaman dan buah-buahan, terutama Citrus spp. [1,2]. Ini dapat disintesis atau diturunkan dari flavonoid lain, hesperidin [1,2]. Diosmin sendiri atau dalam kombinasi dengan hesperidin banyak digunakan sebagai obat phlebotropic untuk pengobatan gangguan vena dan limfatik seperti insufisiensi vena kronis dan wasir [3,4]. Selain itu, diosmin menunjukkan beberapa aktivitas biologis dan farmakologis lainnya, termasuk aktivitas antioksidan dan anti-inflamasi [5,6], sifat anti-mutagenik dan anti-neoplastik [7,8], efek antibiotik [9], sifat anti-hiperglikemik [ 10], dan efek perlindungan terhadap kerusakan multi-organ, yaitu,
kardiovaskular [11], retina [12],ginjal, cedera hati dan otak [13].
Ginjalpenyakit batu (atau nefrolitiasis/urolitiasis) disebabkan oleh pembentukan batu padat dan disimpan di dalam ginjal dan mempengaruhi manusia di semua wilayah dunia dengan tingkat kekambuhan yang tinggi [14-17]. Di antara berbagai kristal penyebab, kalsium oksalat (CaOx), terutama bentuk monohidrat (COM), merupakan komponen kristal yang paling patogen dan paling umum ditemukan pada pembentuk batu (pasien batu ginjal) [18]. Secara mekanis, kristal COM memiliki kemampuan adhesif paling kuat dan efek sitotoksik paling banyak pada sel epitel tubulus ginjal [19,20]. Selama patogenesis batu, baik model plak Randall dan hipotesis intratubular memiliki fitur umum dari proses pembentukan batu COM, termasuk kristalisasi COM, pertumbuhan, agregasi, retensi oleh adhesi permukaan pada sel tubulus ginjal atau panggul ginjal, internalisasi ke dalam sel, dan invasi ke dalam sel. interstitium ginjal melalui matriks ekstraseluler (ECM) [21,22].
Baru-baru ini, banyak penelitian yang berfokus pada penemuan obat menggunakan tanaman/buah obat dan senyawa bioaktifnya yang bertujuan untuk pencegahan pembentukan batu baru dan/atau berulang. Beberapa laporan sebelumnya menunjukkan bahwa beberapa senyawa bioaktif, terutama senyawa fenolik (polifenol, flavonoid, flavon glikosida, dll) yang diekstraksi dari beberapa tanaman/buah obat, memiliki efek pencegahan terhadap mekanisme patogenginjalpenyakit batu baik in vitro dan in vivo [23-25]. Di antara zat bermanfaat ini, beberapa laporan telah menyarankan bahwa diosmin dapat mencegah pengendapan kristal CaOx di dalam jaringan ginjal pada model hewan [26,27]. Namun, peran modulasi yang tepat (penghambatan atau promosi) dan mekanisme (tahapan atau proses pembentukan batu) dalam pembentukan batu ginjal COM belum diselidiki. Penelitian ini dengan demikian secara sistematis mengevaluasi efek daridiosmin(pada 2,5–160 nM) pada berbagai tahapginjalproses pembentukan batu, termasuk kristalisasi, pertumbuhan kristal, agregasi, adhesi sel kristal, internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal dan invasi melalui ECM.
Klik untukDosis Cistanche tubulosa untuk fungsi ginjal
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Persiapan diosmin
Diosmin(Tokyo Chemical Industry; Tokyo, Jepang) dilarutkan dengan 100 persen dimetil sulfoksida (DMSO) (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) dan alikuot yang berfungsi dibuat pada konsentrasi akhir 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 dan 160 nM untuk menyelidiki efeknya pada kristal COM. Selain itu, 100 persen DMSO digunakan sebagai kontrol negatif di semua percobaan.
2.2. Budaya sel
Garis sel epitel tubulus ginjal MDCK yang berasal dari segmen tubulus distal nefron (ATCC; Manassas, VA) disebarkan dalam medium esensial minimum Eagle (MEM) (Gibco; Grand Island, NY) yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi (FBS), 60 U/ml penisilin G (Sigma-Aldrich) dan 60 ug/ml streptomisin (Sigma-Aldrich). Sel-sel dipertahankan dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5 persen CO2 pada 37 C.
2.3. Uji kristalisasi COM
Kristalisasi COM dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [28,29]. Secara singkat, 500 ul 10 mM CaCl2⋅2H2O dalam buffer kristalisasi (mengandung 10 mM Tris-HCl dan 90 mM NaCl) (pH 7,4) ditambahkan ke masing-masing sumur pelat sumur 24-(Corning Inc.; Corning, NY). Volume yang sama (4 ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) ataudiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 atau 160 nM) dicampur dengan CaCl2. Akhirnya, 500 ul 1,0 mM Na2C2O4 dalam buffer kristalisasi kemudian ditambahkan untuk membuat konsentrasi akhir CaCl2 dan Na2C2O4 masing-masing menjadi 5 mM dan 0,5 mM. Campuran diinkubasi pada 25 C selama 1 jam dan kemudian diperiksa. Gambar kristal diambil secara acak dari setidaknya 15 bidang daya tinggi (HPF) di bawah mikroskop cahaya kontras fase terbalik Nikon Eclipse Ti-S (Nikon; Tokyo, Jepang). Ukuran dan jumlah kristal diukur dari setidaknya 15 HPF untuk setiap sampel menggunakan perangkat lunak NIS Element D versi 4.11 (Nikon). Massa kristal dihitung dari setidaknya 100 kristal dalam 15 HPF menggunakan rumus berikut: Massa kristal (µm2/HPF)=Ukuran kristal rata-rata di setiap bidang (µm2) × Jumlah kristal di setiap bidang (/HPF) ( 1)
2.4. Uji pertumbuhan kristal COM
Uji pertumbuhan kristal dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [30,31].
Secara singkat, volume yang sama (500 ul) 10 mM CaCl2⋅2H2O dan 1,0 mM Na2C2O4 dalam buffer kristalisasi dicampur (1:1) (v/v) di setiap sumur { {12}}piring sumur. Campuran diinkubasi pada 25 C selama 1 jam untuk memungkinkan kristalisasi lengkap. Pada titik ini (T0), volume yang sama (4 ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) ataudiosmin(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 atau 160 nM) ditambahkan ke setiap sumur dan campuran diinkubasi lebih lanjut selama 60 menit (T60). Pada T0 dan T60, gambar kristal ditangkap secara acak dari setidaknya 15 HPF di bawah mikroskop cahaya kontras fase terbalik Nikon Eclipse Ti-S. Ukuran kristal pada T0 dan T60 diukur menggunakan perangkat lunak NIS Element D versi 4.11 (Nikon), sedangkan pertumbuhan kristal (diwakili oleh Ukuran kristal) dihitung dari setidaknya 100 kristal dalam 15 HPF menggunakan rumus berikut: Ukuran kristal (µm2)=Ukuran kristal di T60 Ukuran kristal di T0 (2)
2.5. Uji agregasi kristal COM
Uji agregasi kristal dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [32,33]. Kristal COM dihasilkan seperti yang disebutkan di atas dalam uji pertumbuhan kristal tetapi dengan volume yang lebih besar dalam tabung kerucut 50-ml (Corning Inc.) dan kemudian dipanen dengan sentrifugasi pada 2000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang, sedangkan kristal COM dicuci tiga kali dengan metanol. Setelah sentrifugasi lain pada 2000 g selama 5 menit, metanol dibuang dan kristal dikeringkan dengan udara semalaman pada suhu 25 C. Kristal COM (1000 g berat kering) disuspensikan kembali dalam 1 ml buffer kristalisasi di setiap sumur pelat sumur 6- (Corning Inc.). Volume yang sama (4 ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) ataudiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 atau 160 nM) ditambahkan ke dalam suspensi kristal COM di setiap sumur. Pelat dikocok terus menerus dalam inkubator goyang (Zhicheng; Shanghai, Cina) pada 150 rpm dan 25 C selama 1 jam. Setelah itu, pembentukan agregat kristal COM (didefinisikan sebagai "perakitan tiga atau lebih kristal COM individu yang erat bergabung bersama" [32]) diperiksa dan dicitrakan di bawah mikroskop cahaya kontras fase terbalik Nikon Eclipse Ti-S. Jumlah agregat kristal COM dihitung dari setidaknya 15 HPF acak per sumur.
2.6. COM kristal (uji adhesi sel)
Uji adhesi sel kristal dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [34,35]. Secara singkat, kristal COM dihasilkan seperti yang disebutkan di atas dalam tabung kerucut 50-ml dan kemudian dipanen dengan sentrifugasi pada 2000 g selama 5 menit. Supernatan dibuang, sedangkan kristal COM dicuci tiga kali dengan metanol. Setelah sentrifugasi lain pada 2000 g selama 5 menit, metanol dibuang dan kristal dikeringkan dengan udara semalaman pada suhu 25 C. Kristal didekontaminasi dengan radiasi sinar UV selama 30 menit sebelum intervensi dengan sel.
Sel MDCK (pada kepadatan 2 × 105 sel/sumur) diunggulkan dan ditumbuhkan di setiap lubang 6-pelat sumur (Corning Inc.) selama 48 jam untuk mendapatkan lapisan tunggal konfluen. Media kultur kemudian disegarkan sebelum menambahkan kristal COM (100 g kristal berat kering per ml media kultur). Volume yang sama (4 ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) ataudiosmin(2,5, 5, 10, 20, 40, 80 atau 160 nM) ditambahkan ke setiap sumur. Sel-sel selanjutnya diinkubasi dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5 persen CO2 pada 37 C selama 1 jam. Setelah itu, sel-sel dicuci dengan kuat dengan PBS lima kali dan dicitrakan di bawah mikroskop cahaya kontras fase terbalik Nikon Eclipse Ti-S. Jumlah kristal COM yang tersisa yang menempel pada permukaan sel tubulus ginjal dihitung dari setidaknya 15 bidang acak per sumur.
Cistanche untuk fungsi ginjal
2.7. Uji internalisasi kristal COM
Kristal COM berlabel fluoresensi dihasilkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [36,37]. Komposisi/konsentrasi bahan kimia yang digunakan untuk kristalisasi sama dengan yang disebutkan di atas untuk kristal biasa (tidak berlabel), tetapi 0.1 g/ml fluorescein isothiocyanate (FITC) (Thermo Scientific Pierce; Rockford, IL) ditambahkan ke larutan CaCl2⋅2H2O sebelum dicampur dengan Na2C2O4. Langkah-langkah selanjutnya (kristalisasi dan pemanenan) dilakukan seperti yang disebutkan di atas, tetapi dalam gelap.
Untuk mengevaluasi internalisasi kristal ke dalam sel epitel tubulus ginjal, sel MDCK (pada kepadatan 2 × 105 sel/sumur) diunggulkan dan ditanam di setiap sumur 6-well plate (Corning Inc.) selama 48 jam untuk mendapatkan monolayer konfluen. Sel monolayer diinkubasi dengan kristal COM berlabel FITC (1000 g kristal/ml medium) dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5 persen CO2 pada 37 C selama 1 jam. Setelah itu, sel-sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan larutan tripsin-EDTA untuk menghilangkan kristal yang tidak terinternalisasi (baik yang melekat maupun yang tidak melekat). Persentase sel dengan kristal yang diinternalisasi dihitung dari total 10.000 peristiwa yang diperoleh menggunakan flow cytometer (BD Accuri C6) (BD Biosciences; San Jose, CA). Sel-sel yang diinkubasi dengan kristal COM polos (tidak berlabel) digunakan untuk mengatur kebisingan dan ambang batas untuk sinyal fluoresensi positif. Sel-sel dengan sinyal fluoresensi positif kemudian dihitung dan digunakan untuk perhitungan persentase tersebut.
2.8. Invasi kristal COM melalui uji ECM
Kristal COM disiapkan seperti dijelaskan di atas untuk agregasi kristal dan uji adhesi sel kristal. Uji invasi kristal dilakukan sesuai dengan protokol yang ditetapkan sebelumnya [38,39]. Secara singkat, total 20 g kristal COM dilapisi dengan buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif), albumin (Sigma-Aldrich) (kontrol positif) ataudiosmin(2.5, 5, 1{{10}}, 20, 40, 80 atau 160 nM) ditambahkan ke dalam 200 ul MEM. Selanjutnya, 200 ul 0,3 pM Lys-plasminogen (Fitzgerald Industries international; Acton, MA) dalam PBS dicampur dan diinkubasi dengan kompleks kristal-protein pada 37 C selama 1 jam. Plasminogen yang tidak terikat dibuang dengan sentrifugasi pada 2000 g selama 5 menit dan pelet dicuci dengan PBS sekali. Setelah itu, 100 ul 0.15 pM urokinase plasminogen activator (uPA) (Fitzgerald Industries International) dalam PBS dicampur dengan kompleks kristal-protein-plasminogen/plasmin. Campuran tersebut kemudian ditambahkan di atas gel matriks di dalam ruang migrasi ECM dan diinkubasi pada suhu 37 C. Setelah inkubasi 24-jam, larutan yang tertinggal di bagian atas ruang migrasi dikeluarkan dengan menggunakan kain kasa atau kertas tisu. Kristal COM yang diinvasi di dalam gel matriks kemudian dicitrakan menggunakan mikroskop cahaya dengan mode kontras interferensi diferensial (DIC) (Nikon H600L). Jarak invasi kristal diukur dan dirata-ratakan dari setidaknya 15 medan daya rendah (LPF) dalam ruang yang sama menggunakan perangkat lunak NIS Element D versi 4.11 (Nikon).
2.9. Analisis statistik
Semua percobaan di atas dilakukan dalam rangkap tiga (tiga percobaan independen) dan data kuantitatif dilaporkan sebagai mean ± SEM. Beberapa perbandingan dilakukan dengan menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) dengan uji post-hoc Tukey. Uji korelasi pearson dilakukan untuk mengetahui hubungan antar variabel. Semua analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS (versi 18) (IBM SPSS; Armonk, NY). Nilai P kurang dari 0.05 dianggap signifikan secara statistik.
3. Hasil
3.1. Pengaruh diosmin pada kristalisasi COM
Kristalisasi adalah salah satu langkah awal yang penting dariginjalproses pembentukan batu dari semua jenis. Setelah 1-h kristalisasi dengan atau tanpadiosminpada berbagai konsentrasi (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 atau 160 nM), ukuran dan jumlah kristal COM diukur dan massa kristal dihitung. Buffer kristalisasi dan DMSO pengencer masing-masing berfungsi sebagai kontrol kosong dan negatif. Data menunjukkan bahwa semua dosis (2,5-160 nM) disomin secara signifikan mengurangi ukuran kristal tetapi meningkatkan jumlah kristal dengan cara yang bergantung pada dosis bila dibandingkan dengan kontrol kosong dan negatif (Gbr. 1A-1C). Sesuai dengan jumlah kristal, massa kristal tergantung dosis meningkat (Gbr. 1D). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa diosmin mempromosikan kristalisasi COM (neocrystals).
3.2. Pengaruh diosmin pada pertumbuhan kristal COM
Efek modulasi daridiosminpada pertumbuhan kristal COM dievaluasi dengan mengukur perubahan ukuran kristal (Δ Ukuran kristal) setelah 60-menit inkubasi lebih lanjut setelah penyelesaian langkah kristalisasi awal, ketika neokristal tidak ada. Hasilnya menunjukkan bahwa semua dosis (2,5-160nM) disomin secara signifikan mengurangi ukuran kristal dengan cara yang bergantung pada dosis dibandingkan dengan kontrol kosong dan negatif (Gbr. 2). Temuan ini menunjukkan bahwa diosmin menghambat pertumbuhan kristal COM.
3.3. Pengaruh diosmin pada agregasi kristal COM
Selain pertumbuhan kristal, agregasi kristal individu yang melekat erat adalah langkah penting lainnya selamaginjalpatogenesis batu. Tingkat agregasi kristal yang tinggi pada akhirnya dapat menyebabkan pembesaran batu dan obstruksi lumen tubulus ginjal kecil. Dibandingkan dengan kontrol kosong dan negatif,diosminpada 10-160nM peningkatan jumlah agregat kristal COM yang bergantung pada dosis (Gbr. 3). Hasil ini menunjukkan bahwa diosmin mempromosikan agregasi kristal COM.
Cistanche untuk fungsi ginjal
3.4. Pengaruh diosmin pada kristal COM (adhesi sel)
Retensi kristal penyebab adalah salah satu langkah penting untukginjalpembentukan batu dan dapat diinduksi oleh adhesi sel kristal yang mencegah kristal keluar bersama dengan aliran urin. Dengan demikian kami mengevaluasi aktivitas modulasi daridiosminpada adhesi sel kristal COM. Data mengungkapkan bahwa diosmin pada 5-160nM secara signifikan mengurangi kemampuan perekat kristal COM pada sel tubulus ginjal dengan cara yang bergantung pada dosis dibandingkan dengan kontrol kosong dan negatif (Gbr. 4). Data ini menunjukkan bahwa diosmin menghambat adhesi sel kristal COM.
3.5. Pengaruh diosmin pada internalisasi kristal COM ke dalam sel tubulus ginjal
Setelah adhesi, beberapa kristal COM dapat diinternalisasi ke dalam sel tubulus ginjal dan menyebabkan beberapa respon seluler berikutnya [37,40]. Internalisasi kristal dievaluasi dengan menggunakan kristal COM berlabel FITC dan diukur dengan flow cytometry. Kristal COM polos (tanpa pelabelan) digunakan untuk mengurangi gangguan teknis dan untuk memastikan bahwa intensitas fluoresensi berasal dari sinyal FITC. Dibandingkan dengan kontrol kosong dan negatif, persentase sel dengan kristal yang diinternalisasi menurun secara signifikan sebesardiosminpada 10-160nM dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 5). Temuan menunjukkan bahwa disomin menghambat internalisasi kristal COM ke dalam sel tubulus ginjal.
3.6. Pengaruh diosmin pada invasi kristal COM melalui ECM
Invasi kristal melalui ECM adalah proses patogen/destruktif selamaginjalpatogenesis batu yang dapat memicu berbagai respon inflamasi dan kaskade, sehingga memperburuk mekanisme penyakit. Kami memeriksa fenomena ini dengan menggunakan protokol yang ditetapkan berdasarkan aktivitas plasminogen-plasmin dari kompleks kristal-protein [38,39]. Hasilnya menunjukkan bahwa semua dosis disomin (2,5-160nM) secara signifikan meningkatkan invasi kristal COM melalui ECM dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 6). Menariknya,diosminpada 160nM dapat mempromosikan invasi kristal COM yang sebanding dengan albumin, yang merupakan promotor kuat yang diketahui untuk invasi kristal COM [41] (Gbr. 6). Hasil ini menunjukkan bahwa diosmin sangat mendorong invasi kristal COM melalui ECM.
Gambar 1. Pengaruhdiosminpada kristalisasi COM. Uji kristalisasi dilakukan dengan volume yang sama (4ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) atau diosmin (2,5-160nM). (A): Morfologi kristal pada setiap kondisi setelah 1-jam kristalisasi. Perbesaran asli adalah 400x untuk semua panel. (B): Ukuran kristal. (C): Nomor kristal. (D): Massa kristal (lihat Formula 1 dalam "Bahan dan Metode") dianalisis dari setidaknya 100 kristal dalam 15 HPF. Setiap batang mewakili rata-rata ±SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" dmso.="">
Gambar 2. Pengaruhdiosminpada pertumbuhan kristal COM. Uji pertumbuhan kristal dilakukan setelah kristalisasi selesai (untuk mencegah neokristalisasi) dengan volume yang sama (4ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) atau diosmin (2,5–160nM). (A): Morfologi kristal pada setiap kondisi pada T0 dan T60. Perbesaran asli adalah 400 × untuk semua panel. (B)-(J): Histogram ukuran kristal diukur dari kristal individu pada T0 dan T60 dalam setiap kelompok. (K): Ukuran kristal (lihat Formula 2 dalam "Bahan dan Metode") dianalisis dari setidaknya 100 kristal dalam 15 HPF. Setiap batang mewakili rata-rata ± SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *= p < 0,05="" vs.="" kontrol="" kosong;="" #="p">< 0,05="" vs.="">
Gambar 3. Pengaruhdiosminpada agregasi kristal COM. Uji agregasi kristal dilakukan dengan volume yang sama (4ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) atau diosmin (2,5-160nM). (A): Mikrograf kristal COM teragregasi (diberi label dengan lingkaran putus-putus). Perbesaran asli adalah 400 × untuk semua panel. (B): Jumlah agregat kristal dihitung dari setidaknya 15 HPF acak di setiap sumur. Setiap batang mewakili rata-rata ± SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *=p< 0.05="" vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="" dmso.="">
Gambar 4. Pengaruhdiosminpada adhesi sel kristal COM. Uji adhesi sel kristal dilakukan dengan volume yang sama (4ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) atau diosmin (2,5-160nM). (A): Mikrograf kristal yang tersisa yang melekat erat pada monolayer sel setelah menghilangkan kristal yang tidak terikat dengan pencucian kuat dengan PBS. Perbesaran asli adalah 200 × untuk semua panel. (B): Jumlah kristal yang menempel dihitung dari setidaknya 15 bidang acak di setiap sumur. Setiap batang mewakili rata-rata ±SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *= hal<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p"><0.05 vs.="">
Gambar 5. Pengaruhdiosminpada internalisasi kristal COM ke dalam sel tubulus ginjal. Uji internalisasi kristal dilakukan menggunakan kristal COM berlabel FITC (FITC-COM), sedangkan kristal COM biasa (tidak berlabel) digunakan untuk pengurangan latar belakang / kebisingan. Pengujian dilakukan dengan volume yang sama (4ul) buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif) atau diosmin (2,5–160nM). (A): Aliran analisis titik-titik sitometrik ukuran (sumbu y) dan intensitas fluoresensi FITC (sumbu x) sel setelah menghilangkan kristal yang tidak terinternalisasi dengan 0,1 persen tripsin/2,5mM EDTA. (B): Persentase sel dengan kristal COM berlabel FITC yang diinternalisasi. Setiap batang mewakili rata-rata ± SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *= p<0.05 vs.="" fitc-com="" +="" blank="" control;="" #="">< 0.05="" vs.="" fitc-com="" +="" dmso.="">
Gambar 6. Pengaruhdiosminpada invasi kristal COM melalui ECM. Invasi kristal melalui uji ECM dilakukan menggunakan kristal COM yang dilapisi dengan buffer kristalisasi (kontrol kosong), DMSO (kontrol negatif), albumin (kontrol positif) atau diosmin (2,5–160nM). (A): Mikrograf kristal COM menyerbu atau bermigrasi melalui ruang migrasi ECM. Perbesaran asli adalah 100 × untuk semua panel. (B): Jarak invasi kristal diukur dari setidaknya 15 LPF acak di setiap ruang. Setiap batang mewakili rata-rata ±SEM dari data yang berasal dari 3 percobaan independen. *= p<0.05 vs.="" blank="" control;="" #="p" <="" 0.05="" vs.="">
4. Diskusi
Penyakit batu ginjal disebabkan oleh pembentukan batu di dalamginjaldan sistem pelvokalises. Proses pembentukan batu ginjal yang umum termasuk kristalisasi COM, pertumbuhan, agregasi, retensi oleh adhesi sel kristal, dan invasi melalui interstitium ginjal yang kaya dengan ECM [21,22]. Ada beberapa upaya untuk mencegah penyakit ini dengan menggunakan berbagai obat dan/atau suplemen gizi. Banyak bukti terbaru telah melaporkan bahwa flavonoid, glikosida flavon dan senyawa lain yang diekstraksi dari buah jeruk mungkin memiliki efek pencegahan pada penyakit batu ginjal dan gangguan lainnya [23-25]. Diantaranya,diosmin, flavon glikosida alami dan turunan hesperidin ditemukan terutama dalam buah jeruk [1,2], telah disarankan untuk memainkan peran pencegahan terhadap cedera dan kerusakanginjaljaringan [13,42]. Selain itu, peran anti-urolitiasis telah dilaporkan dalam beberapa penelitian sebelumnya menggunakan model hewan [26,27]. Namun demikian, efek menguntungkan dan mekanisme yang mendasari diosmin dalam pencegahan batu ginjal tetap kabur. Dengan demikian kami memeriksa aktivitas modulasi diosmin pada kristal COM. Analisis sistematis dilakukan pada berbagai tahap COMginjalpembentukan batu, termasuk kristalisasi, pertumbuhan kristal, agregasi, adhesi sel kristal, internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal dan invasi melalui ECM.
Setelah asupan oraldiosmin, tingkat plasma pada manusia berkisar dari {{0}}.5 hingga 200ng/ml (atau 0,8–300nM) [43,44]. Konsentrasi plasma maksimum (Cmax) adalah sekitar 50ng/ml (atau 85nM) [43,44]. Oleh karena itu, dosis diosmin yang digunakan dalam penelitian kami saat ini (2,5-160nM) berada dalam kisaran yang relevan secara farmakologis untuk farmakokinetiknya. Karena DMSO digunakan sebagai pengencer untuk melarutkan diosmin secara sempurna sesuai rekomendasi, DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dalam penelitian ini selain kontrol blanko untuk memastikan bahwa tidak ada efek dari pengencer itu sendiri yang dapat mengganggu interpretasi data. Dalam semua pengujian, data menunjukkan bahwa tidak ada efek signifikan dari DMSO yang diamati dan semua data kuantitatif yang berasal dari kontrol negatif sebanding dengan kontrol kosong.
Uji kristalisasi COM mengungkapkan bahwa semua konsentrasidiosmin(2.5, 5, 10, 20, 40, 80 dan 160nM) dapat mengurangi ukuran kristal COM tetapi, di sisi lain, meningkatkan jumlah kristal. Karena massa kristal adalah produk akhir dari ukuran dan jumlah kristal dan lebih relevan untuk mencerminkan tingkat kristalisasi COM, kami kemudian mengevaluasi apakah diosmin memengaruhi indeks kristal ini. Data menunjukkan bahwa semua konsentrasi diosmin memiliki efek mempromosikan pada massa kristal COM, konsisten dengan data jumlah kristal. Setelah kristalisasi, kristal COM selanjutnya dapat tumbuh ke ukuran yang lebih besar untuk langkah selanjutnyaginjalpembentukan batu.
Berbeda dengan kristalisasi, diosmin pada semua konsentrasi menunjukkan efek penghambatan pada pertumbuhan kristal COM dengan cara yang bergantung pada dosis. Beberapa penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa kelarutan kristal CaOx dapat ditingkatkan dengan turunan hidroksiantrakuinon dengan glikosilasi [45]. Selain itu, keberadaan gula dalam senyawa bioaktif tersebut dapat mengikat ion kalsium bebas mungkin karena gugus hidroksil dalam struktur molekul, sehingga menghambat pembentukan kristal CaOx [45,46]. Diosmin juga dapat mempengaruhi transisi ion kalsium dan oksalat terlarut ke dalam partikel kristal COM dalam cairan tubulus ginjal dalam proses kristalisasi COM berdasarkan mekanisme ini.
Namun demikian, agregasi kristal COM dipromosikan oleh 10–160nMdiosmin, menyiratkan kemampuan diosmin untuk bertindak sebagai pengikat atau molekul perekat untuk merekrut kristal individu untuk mengikat bersama untuk membentuk agregat kristal. Pengikatan ini juga menghasilkan perkembangan jembatan perekat di antara kristal individu dan dapat menginduksi pembentukan struktur besar kristal COM, yang dengan mudah berkontribusi pada pengendapan nidus batu di dalamginjal[32].
Retensi kristal COM melalui adhesi kristal pada permukaan sel tubulus ginjal telah ditetapkan sebagai langkah penting lainnya untuk pembentukan batu ginjal [47]. Data kami mengungkapkan bahwa diosmin dapat mengurangi kemampuan perekat kristal COM untuk berikatan dengan permukaan apikal sel tubulus ginjal MDCK. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa glikosaminoglikan (senyawa polisakarida) yang dilapisi kristal CaOx atau diekspresikan pada sel tubulus ginjal dapat mengganggu kemampuan perekat kristal CaOx ke sel tubulus ginjal [48]. Selain itu, ekspresi reseptor kristal pada sel tubulus ginjal adalah salah satu mekanisme penting yang menentukan adhesi sel kristal [21]. Sementara kristal CaOx menginduksi cedera membran apikal, khususnya mikrovili, beberapa polifenol seperti epigallocatechin gallate (EGCG) dapat mencegah adhesi sel kristal dan cedera seluler [49]. Selain itu, zat flavonoid dalam berbagai ekstrak tumbuhan sebelumnya telah dilaporkan meningkatkan tingkat pH urin, yang menyebabkan penghambatan adhesi sel kristal [50,51]. Mungkin,diosminmungkin juga melemahkan cedera seluler yang diinduksi oleh COM, sehingga mengurangi adhesi sel kristal.
Internalisasi kristal COM telah ditunjukkan muncul terutama oleh endositosis melalui jalur makropinositosis yang dimediasi oleh sitoskeleton aktin [40]. Flavonoid seperti quercetin telah dilaporkan mempengaruhi sitoskeleton aktin yang diperlukan untuk makropinositosis [52,53]. Temuan kami menunjukkan bahwa diosmin secara signifikan mengurangi kemampuan sel MDCK untuk menginternalisasi kristal COM. Efek penghambatan diosmin tersebut mungkin terkait dengan perakitan atau organisasi sitoskeleton aktin di dalam sel yang secara langsung mempengaruhi jalur makropinositosis [54,55].
Setelah internalisasi, kristal COM didegradasi oleh endolisosom yang menghasilkan peningkatan ion kalsium dan oksalat bebas di interstitium ginjal [37]. Peningkatan ion kalsium dan oksalat tersebut dapat menyebabkan neokristalisasi COM di interstitium ginjal [56,57]. Selain itu, kehadiran kristal COM interstisial mungkin dari cacat persimpangan ketat dan hambatan adhesi paraseluler, mengakibatkan peningkatan permeabilitas paraseluler dan translokasi kristal [58-60]. Kristal ini kemudian dapat menginvasi interstitium ginjal melalui ECM dan selanjutnya memicu beberapa respon inflamasi dan kerusakan jaringan [58-60]. Dalam penelitian ini, kami mengamati bahwa invasi kristal COM melalui ruang migrasi ECM diinduksi oleh semua konsentrasi diosmin. Diosmin mungkin mengikat permukaan kristal COM dan berinteraksi dengan sistem plasminogen-plasmin yang mendorong migrasi kristal di ruang migrasi ECM [38,39].
Cistanche untuk ginjal
Karenadiosminmenginduksi efek penghambatan dan peningkatan pada berbagai proses pembentukan batu COM yang berbeda, oleh karena itu kami menentukan hubungannya menggunakan uji korelasi Pearson. Analisis korelasi mengungkapkan bahwa jumlah kristal berbanding terbalik dengan ukuran kristal dan pertumbuhan kristal ( Ukuran kristal) (Gbr. 7A dan B). Ukuran kristal berkorelasi kuat dengan pertumbuhan kristal (Gbr. 7C) tetapi berkorelasi terbalik dengan massa kristal (Gbr. 7D). Akhirnya, massa kristal berkorelasi kuat dengan jumlah kristal dan agregasi kristal (Gbr. 7E dan F). Dari analisis korelasi, data menunjukkan bahwa jumlah kristal dan massa kristal lebih relevan untuk mencerminkan kristalisasi daripada ukuran kristal (Gbr. 7A, D dan E). Selain itu, ukuran neokristal selama kristalisasi terkait dengan pertumbuhan kristal yang terbentuk sebelumnya (Gbr. 7C), sedangkan derajat kristalisasi (seperti yang dicerminkan oleh jumlah kristal dan massa kristal) terkait erat dengan tingkat agregasi kristal (Gbr. 7E dan F). Namun, korelasi ini kemungkinan besar khusus untuk efek diosmin, sedangkan efek dari modulator lain mungkin atau mungkin tidak memiliki korelasi yang sama. Misalnya, fibronektin menurunkan massa kristal dan menghambat pertumbuhan kristal, tetapi mendorong agregasi kristal [31]. Selain itu, Escherichia coli viabel yang utuh meningkatkan ukuran dan massa kristal tetapi tidak berpengaruh pada jumlah kristal [33]. Data ini menunjukkan bahwa korelasi antara berbagai uji kristal COM tidak universal untuk semua modulator.
Akhirnya, kami telah merangkum hasil yang diperoleh dari berbagai pengujian dan mengintegrasikannya dengan mekanisme patogenginjalpenyakit batu (lihat skema pada Gambar. 8). Dari analisis korelasi, diosmin mendorong kristalisasi (Gbr. 8A). Antara kristalisasi dan pertumbuhan kristal,diosminmenjaga keseimbangan yang baik dengan mempromosikan kristalisasi tetapi, di sisi lain, menghambat pertumbuhan kristal (Gbr. 8B). Mengenai semua efek pada kristal COM saja (tanpa mempertimbangkan sel dan ECM yang juga campur tangan), aktivitas mempromosikan diosmin lebih menonjol daripada aktivitas penghambatannya pada kristal COM karena mempromosikan kristalisasi dan agregasi kristal, tetapi hanya menghambat pertumbuhan kristal ( Gambar 8C). Meskipun kristalisasi meningkat, ukuran kristal menurun dan berhubungan dengan penghambatan pertumbuhan (Gbr. 7C). Data ini konsisten dengan hasil yang dilaporkan oleh Kavanagh et al. [61-63], menunjukkan bahwa peningkatan kristalisasi menyebabkan penurunan jenuh ion kalsium dan oksalat dalam larutan, sehingga menurunkan pertumbuhan. Namun, pertumbuhan kristal bukan satu-satunya faktor yang menentukanginjalpatogenesis batu [64], terutama ketika massa kristal menguasai dan dikaitkan dengan peningkatan agregasi kristal (Gbr. 7F) yang dapat meningkatkan kemungkinan bahan kristal untuk terjebak dalam segmen tubular kecil (dalam hipotesis intratubular), sehingga meningkatkan kemungkinan pembentukan batu. Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan data yang konsisten dengan temuan kami, menunjukkan bahwa peningkatan jumlah kristal dikaitkan dengan peningkatan agregasi kristal dan pembesaran batu [63].
Gambar 7. Analisis korelasi. (A)–(F): Korelasi antara jumlah kristal COM, ukuran kristal, Ukuran kristal, massa kristal, dan jumlah agregat kristal dianalisis dengan uji korelasi Pearson.
Gambar 8. Skema yang merangkum efek modulasi daridiosmindi COMginjalproses pembentukan batu. (A): Pengaruh diosmin pada kristalisasi COM. (B): Pengaruh diosmin pada kristalisasi COM dan pertumbuhan kristal. (C): Pengaruh diosmin pada kristalisasi COM, pertumbuhan dan agregasi. (D): Pengaruh diosmin pada seluruh proses pembentukan batu ginjal COM.
Ketika interaksi dengan sel tubulus ginjal dan ECM dipertimbangkan, gambaran global dari efek ganda daridiosminpada COM pembentukan batu ginjal menjadi lebih jelas (Gbr. 8D). Diosmin menghambat adhesi sel kristal, sehingga mengurangi internalisasi kristal ke dalam sel. Hal ini dapat dijelaskan bahwa ukuran kristal COM yang lebih kecil memiliki kemampuan adhesif yang lebih rendah untuk mengikat sel tubulus ginjal dibandingkan dengan yang lebih besar seperti yang dilaporkan dalam penelitian terbaru kami [34] dan penelitian sebelumnya oleh kelompok lain [65]. Kemampuan perekat yang lebih kecil dari kristal COM yang lebih kecil adalah karena gaya perekatnya yang lebih sedikit ke permukaan sel dan jumlah reseptor kristal COM yang terikat padanya lebih sedikit seperti yang ditentukan oleh mikroskop gaya atom dan analisis proteom [34]. Diosmin juga menghambat internalisasi kristal. Perhatikan bahwa proses internalisasi adalah pedang bermata dua yang membutuhkan interpretasi yang cermat. Internalisasi atau endositosis dalam salah satu mekanisme pertahanan yang digunakan sel untuk eliminasi kristal oleh endolisosom. Namun, degradasi kristal utuh menghasilkan ion kalsium dan oksalat bebas yang dapat berpindah dari kompartemen intraseluler ke interstitium ginjal, di mana mereka dapat menghasilkan neokristal [56,57]. Di sisi lain, diosmin mempromosikan invasi kristal melalui ECM, yang merupakan salah satu mekanisme penting untuk patogenesis batu ginjal (terutama dalam model plak Randall) [58-60]. Secara keseluruhan, Gambar. 8D merangkum semua efek modulasi ganda diosmin pada COMginjalproses pembentukan batu. Perlu dicatat bahwa keseimbangan antara efek pendorong dan penghambat ini tidak dapat dihitung secara tepat (tidak seperti persamaan matematika). Selain itu, ada beberapa faktor endogen dan eksogen lain yang juga dapat mengintervensi proses pembentukan batu. Akhirnya, diosmin juga menunjukkan beberapa efek tidak langsung pada pembentukan batu ginjal, termasuk sifat antioksidan dan anti-inflamasinya [5,6] yang harus diperhitungkan. Oleh karena itu, hasil akhir dari efek modulasi ganda inidiosmindi COMginjalpembentukan batu membutuhkan penyelidikan in vivo lebih lanjut dan studi prospektif kohort besar.
5. Kesimpulan
Singkatnya, kami melaporkan di sini efek ganda diosmin pada modulasi kristal COM dengan cara yang bergantung pada dosis. Sementara itu menghambat pertumbuhan kristal COM, adhesi sel kristal, dan internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal,diosminmempromosikan kristalisasi COM, agregasi, dan invasi melalui ECM. Oleh karena itu, peran anti-urolitiasis diragukan dan harus berhati-hati dalam penggunaannya pada penyakit batu ginjal.
Pernyataan kontribusi kepenulisan CReditT
Supaporn Khamchun: Konseptualisasi, Metodologi, Perangkat Lunak, Validasi, Analisis Formal, Investigasi, Kurasi Data, Penulisan – draf asli, Visualisasi, Sunisa Yoodee: Konseptualisasi, Metodologi, Perangkat Lunak, Validasi, Analisis Formal, Investigasi, Kurasi data, Penulisan – draf asli, Visualisasi, Kunjungi Thongboonkerd: Konseptualisasi, Metodologi, Perangkat Lunak, Validasi, Sumber Daya, Penulisan – tinjauan & pengeditan, Pengawasan, Administrasi proyek, Akuisisi pendanaan.
Pernyataan konflik kepentingan
Para penulis menyatakan TIDAK ADA konflik kepentingan.
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih atas bantuan teknis Kittiya Suwannakud. Pekerjaan ini didukung oleh Kantor Dewan Kebijakan Riset dan Inovasi Sains Pendidikan Tinggi Nasional (NXPO) melalui PMU-B dan Thailand Research Fund (IRN60W0004). VT juga didukung oleh Hibah "Chalermphrakiat", Fakultas Kedokteran Rumah Sakit Siriraj.
Referensi
[1] A. Bogucka-Kocka, M. Wozniak, M. Feldo, J. Kockic, K. Szewczyk,Diosmin– teknik isolasi, penentuan bahan tanaman dan formulasi farmasi, dan penggunaan klinis, Nat. Melecut. Kom. 8 (2013) 545–550.
[2] Y. Zheng, R. Zhang, W. Shi, L. Li, H. Liu, Z. Chen, L. Wu, Metabolisme dan aktivitas farmakologis dari senyawa diosmin yang bermanfaat bagi kesehatan, Food Funct. 11 (2020) 8472–8492.
[3] MR Cesarone, G. Belcaro, L. Pellegrini, A. Ledda, G. Vinciguerra, A. Ricci, A. Di Renzo, I. Ruffini, G. Gizzi, E. Ippolito, F. Fano, M. Dugall , G. Acerbi, U. Cornelli, M. Hosoi, M. Cacchio, Venoruton vs Daflon: evaluasi efek pada kualitas hidup pada insufisiensi vena kronis, Angiology 57 (2006) 131-138.
[4] KA Lyseng-Williamson, CM Perry, Fraksi flavonoid murni yang dimurnikan mikro: tinjauan penggunaannya pada insufisiensi vena kronis, borok vena dan wasir, Obat 63 (2003) 71-100.
[5] AS Shalkami, M. Hassan, AG Bakr, Anti-inflamasi, aktivitas antioksidan dan anti-apoptosis diosmin pada kolitis ulserativa yang diinduksi asam asetat, Hum. Eks. racun. 37 (2018) 78–86.
[6] M. Berkoz, Diosmin menekan mediator proinflamasi pada makrofag RAW264.7 yang diinduksi lipopolisakarida melalui jalur sinyal NF-kappaB dan MAPKs, Gen. Physiol. Biofis. 38 (2019) 315–324.
[7] M. Rajasekar, K. Suresh, K. Sivakumar, Diosmin menginduksi apoptosis melalui modulasi pensinyalan STAT-3 pada 7,12 dimethylbenz(a)antrasena yang menginduksi karsinogenesis kantong bukal berbahaya, Biomed. Farmasi. 83 (2016) 1064–1070.
[8] A. Lewinska, J. Adamczyk-Grochala, E. Kwasniewicz, A. Deregowska, M. Wnuk, penuaan yang diinduksi Diosmin, apoptosis dan autophagy dalam sel kanker payudara dengan status p53 yang berbeda dan aktivitas ERK, Toxicol. Lett. 265 (2017) 117-130.
[9] AC Pushkaran, V. Vinod, M. Vanuopadath, SS Nair, SV Nair, AK Vasudevan, R. Biswas, CG Mohan, Kombinasi diosmin obat repurposed dengan asam amoksisilin-klavulanat menyebabkan penghambatan sinergis pertumbuhan mikobakteri, Sci. Rep.9 (2019) 6800.
[10] CC Hsu, MH Lin, JT Cheng, MC Wu, tindakan antihiperglikemik diosmin, flavonoid jeruk, diinduksi melalui endogen beta-endorfin pada tikus diabetes tipe I seperti, Clin. Eks. Farmasi. Fisiol. 44 (2017) 549–555.
[11] O. Senthamizhselvan, J. Manivannan, T. Silambarasan, B. Raja,Diosminpretreatment meningkatkan fungsi jantung dan menekan stres oksidatif pada jantung tikus setelah iskemia/reperfusi, Eur. J. Farmasi. 736 (2014) 131–137.
[12] N. Tong, Z. Zhang, Y. Gong, L. Yin, X. Wu, Diosmin melindungi retina tikus dari cedera iskemia/reperfusi, J. Ocul. Farmasi. Ada. 28 (2012) 459–466.
[13] AE Elhelaly, G. AlBasher, S. Alfarraj, R. Almeer, EI Bahbah, MMA Fouda, SG Bungau, L. Aleya, MM Abdel-Daim, Efek protektif hesperidin dan diosmin terhadap hati, ginjal, dan kerusakan oksidatif otak pada tikus, Environ. Sci. polusi. Res. Int. 26 (2019) 35151–35162.
[14] C. Thongprayoon, AE Krambeck, Aturan AD, Menentukan beban sebenarnya dariginjalpenyakit batu, Nat. Pdt. Nefrol. 16 (2020) 736–746.
[15] K. Bishop, T. Momah, J. Ricks, Nefrolitiasis, Prim. Perawatan 47 (2020) 661–671.
[16] A. Viljoen, R. Chaudhry, J. Bycroft, Batu ginjal, Ann. klinik Biochem 56 (2019) 15–27.
[17] PM Ferraro, R. Marano, A. Primiano, J. Gervasoni, M. Bargagli, G. Rovere, PF Bassi, G. Gambaro, Komposisi batu dan kalsifikasi vaskular pada pasien dengan nefrolitiasis, J. Nephrol. 32 (2019) 589–594.
[18] G. Schubert, Analisis batu, Urol. Res. 34 (2006) 146–150.
19 ), 1700192.
[20] P. Peerapen, S. Chaiyarit, V. Thongbookerd, Analisis jaringan protein dan studi fungsional sitotoksisitas yang diinduksi kristal kalsium oksalat dalam sel epitel tubulus ginjal, Proteomik 18 (2018), 1800008.
[21] KP Aggarwal, S. Narula, M. Kakkar, C. Tandon, Nephrolithiasis: mekanisme molekuler pembentukan batu ginjal dan peran penting yang dimainkan oleh modulator, Biomed. Res. Int. 2013 (2013), 292953.
[22] VN Ratkalkar, JG Kleinman, Mekanisme pembentukan batu, Clin. Pdt. Penambang Tulang. Meta 9 (2011) 187–197.
[23] X. Zeng, Y. Xi, W. Jiang, Peran protektif flavonoid dan ekstrak tumbuhan kaya flavonoid terhadap urolitiasis: ulasan, Crit. Pdt. Ilmu Pangan. nutrisi 59 (2019) 2125–2135.
[24] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, MH Farzaei, S. Zingue, SM Nabavi, A. Bishayee, Tanaman makanan untuk pencegahan dan pengelolaanginjalbatu: bukti praklinis dan klinis dan mekanisme molekuler, Int. J. Mol. Sci. 19 (2018) 765.
[25] S. Ahmed, MM Hasan, H. Khan, ZA Mahmood, S. Patel, Wawasan mekanistik polifenol dalam mitigasi urolitiasis kalsium oksalat, Biomed. Farmasi. 106 (2018) 1292–1299.
[26] VV Prabhu, D. Sathyamurthy, A. Ramasamy, S. Das, M. Anuradha, S. Pachiappan, Evaluasi efek perlindungan diosmin (flavonoid jeruk) pada urolitiasis yang diinduksi kimia pada tikus percobaan, Pharm. Biol. 54 (2016) 1513–1521.
[27] A. Noorafshan, S. Karbalay-Doust, F. Karimi,Diosminmengurangi deposisi kalsium oksalat dan degenerasi jaringan pada nefrolitiasis pada tikus: studi stereologis, Korean J. Urol. 54 (2013) 252–257.
[28] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Chutipongtanate, Faktor-faktor yang menentukan jenis dan morfologi kristal kalsium oksalat: konsentrasi molar, buffering, pH, pengadukan dan suhu, Clin. Chim. Acta 367 (2006) 120-131.
[29] V. Thongboonkerd, T. Semangoen, S. Sinchaikul, ST Chen, Analisis proteomik dari sitotoksisitas yang diinduksi kristal kalsium oksalat monohidrat dalam sel tubulus ginjal distal, J. Proteome Res. 7 (2008) 4689–4700.
[30] P. Amimanan, R. Tavichakorntrakool, K. Fong-ngern, P. Sribenjalux, A. Lulitanond, V. Prasongwatana, C. Wongkham, P. Boonsiri, WJ Umka, V. Thongboonkerd, Faktor pemanjangan Tu pada Escherichia coli diisolasi dari urin pasien batu ginjal mempromosikan pertumbuhan dan agregasi kristal kalsium oksalat, Sci. Rep.7 (2017) 2953.
[31] S. Khamchun, K. Sueksakit, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Efek modulasi fibronektin pada kristalisasi kalsium oksalat, pertumbuhan, agregasi, adhesi pada sel tubulus ginjal, dan invasi melalui matriks ekstraseluler, J. Biol. Inorg. Kimia 24 (2019) 235–246.
[32] S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Mendefinisikan dan analisis sistematis indeks agregasi untuk mengevaluasi derajat agregasi kristal kalsium oksalat, Front. Kimia 5 (2017) 113.
[33] R. Kanlaya, O. Naruepantawart, V. Thongboonkerd, Flagellum bertanggung jawab untuk mempromosikan efek Escherichia coli yang layak pada kristalisasi kalsium oksalat, pertumbuhan kristal, dan agregasi kristal, Front. Mikrobiol 10 (2019) 2507.
[34] P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Diferensial terikat protein dan kemampuan perekat kristal kalsium oksalat monohidrat dengan berbagai ukuran, Int. J.Biol. Makromol. 163 (2020) 2210–2223.
[35] K. Fong-ngern, K. Sueksakit, V. Thongboonkerd, Protein kejutan panas permukaan 90 berfungsi sebagai reseptor potensial untuk kristal kalsium oksalat pada membran apikal sel epitel tubulus ginjal, J. Biol. Inorg. Kimia 21 (2016) 463–474.
[36] S. Chaiyarit, S. Mungdee, V. Thongboonkerd, Pelabelan non-radioaktif kristal kalsium oksalat untuk penyelidikan interaksi sel kristal dan internalisasi, Anal. Metode 2 (2010) 1536–1541.
[37] S. Chaiyarit, N. Singhto, V. Thongbookerd, Kristal kalsium oksalat monohidrat yang diinternalisasi ke dalam sel tubulus ginjal didegradasi dan dilarutkan oleh endolisosom, Chem. Biol. Berinteraksi. 246 (2016) 30–35.
[38] W. Chiangjong, V. Thongboonkerd, Sebuah uji baru untuk mengevaluasi efek mempromosikan protein pada invasi kristal kalsium oksalat melalui matriks ekstraseluler berdasarkan aktivitas plasminogen/plasmin, Talanta 101 (2012) 240-245.
[39] W. Chiangjong, V. Thongbookerd, Kristal kalsium oksalat meningkatkan sekresi enolase-1 dari sel tubulus ginjal yang kemudian meningkatkan invasi kristal dan monosit melalui interstitium ginjal, Sci. Rep.6 (2016) 24064.
[40] R. Kanlaya, K. Sintiprungrat, S. Chaiyarit, V. Thongboonkerd, Macropinocytosis adalah mekanisme utama untuk endositosis kristal kalsium oksalat ke dalam sel tubulus ginjal, Cell Biochem. Biofis. 67 (2013) 1171–1179.
[41] S. Sassanarakkit, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, StoneMod: database untukginjalprotein modulasi batu dengan bukti eksperimental, Sci. Rep.10 (2020) 15109.
[42] G. Eraslan, ZS Sarica, LC Bayram, MY Tekeli, M. Kanbur, M. Karabacak, Efek diosmin pada kerusakan hati dan ginjal yang diinduksi aflatoksin, Environ. Sci. polusi. Res. Int. 24 (2017) 27931–27941.
[43] R. Russo, D. Chandradhara, N. De Tommasi, Bioavailabilitas komparatif duadiosminformulasi setelah pemberian oral pada sukarelawan sehat, Molecules 23 (2018) 2174.
[44] JQ Silveira, TB Cesar, JA Manthey, EA Baldwin, J. Bai, S. Raithore, Farmakokinetik glikosida flavanon setelah konsumsi dosis tunggal jus jeruk segar versus jus jeruk yang diproses secara komersial pada manusia sehat, J. Agric . Kimia Makanan. 62 (2014) 12576–12584.
[45] A. Frackowiak, P. Skibinski, W. Gawel, E. Zaczynska, A. Czarny, R. Gancarz, Sintesis turunan glikosida hidroksiantrakuinon dengan kemampuan melarutkan dan menghambat pembentukan kristal kalsium oksalat. Senyawa potensial dalam terapi batu ginjal, Eur. J. Med. Kimia 45 (2010) 1001–1007.
[46] F. Grases, J. Perello, B. Isern, RM Prieto, Studi krim berbasis heksafosfat myo-inositol untuk mencegah kalsinosis kutis distrofi, Br. J. Dermatol. 152 (2005) 1022–1025.
[47] V. Thongboonkerd, Proteomik interaksi sel kristal: model untuk penelitian batu ginjal, Sel 8 (2019) 1076.
[48] CF Verkoelen, Retensi kristal pada penyakit batu ginjal: peran penting untuk hyaluronan glikosaminoglikan? Selai. Soc. Nefrol. 17 (2006) 1673–1687.
[49] K. Fong-ngern, A. Vinaiphat, V. Thongboonkerd, Cedera mikrovillar pada sel epitel tubulus ginjal yang diinduksi oleh kristal kalsium oksalat dan peran protektif epigallocatechin-3-gallate, FASEB J. 31 (2017) 120 -131.
[50] J. Zhou, J. Jin, X. Li, Z. Zhao, L. Zhang, Q. Wang, J. Li, Q. Zhang, S. Xiang, Flavonoid total Desmodium styracifolium melemahkan pembentukan hidroksi- Urolitiasis kalsium oksalat yang diinduksi L-prolin pada tikus, Urolitiasis 46 (2018) 231–241.
[51] J. Manissorn, K. Fong-ngern, P. Peerapen, V. Thongboonkerd, Evaluasi sistematis untuk efek pH urin pada kristalisasi kalsium oksalat, adhesi sel kristal dan internalisasi ke dalam sel tubulus ginjal, Sci. Rep.7 (2017) 1798.
[52] S. Cui, J. Qian, P. Bo, Efek penghambatan pada fagositosis Candida albicans yang diinduksi oleh pretreatment dengan quercetin melalui interferensi sitoskeleton aktin, J. Tradit. Dagu. Med. 33 (2013) 804–809.
[53] S. Cui, Q. Wu, J. Wang, M. Li, J. Qian, S. Li, Quercetin menghambat migrasi makrofag yang diinduksi LPS dengan menekan jalur iNOS/FAK/paxillin dan memodulasi sitoskeleton, Perekat Sel . migrasi 13 (2019) 1–12.
[54] Y. Li, WG Gonzalez, A. Andreev, W. Tang, S. Gandhi, A. Cunha, D. Prober, C. Lois, ME Bronner, daur ulang membran yang dimediasi Macropinocytosis mendorong migrasi puncak saraf dengan mengirimkan F- aktin ke lamellipodium, Proc. Natal akad. Sci. AS 117 (2020) 27400–27411.
[55] H. Inaba, K. Yoda, H. Adachi, RapGEF GflB yang mengikat F-aktin diperlukan untuk makropinositosis yang efisien di Dictyostelium, J. Cell Sci. 130 (2017) 3158–3172.
[56] A. Khan, Prevalensi, mekanisme patofisiologi dan faktor yang mempengaruhi urolitiasis, Int. Url. Nefrol. 50 (2018) 799–806.
[57] AP Evan, EM Worcester, FL Coe, J. Williams Jr., JE Lingeman, Mekanisme pembentukan batu ginjal manusia, Urolitiasis 43 (Suppl 1) (2015) 19-32.
[58] S. Chaiyarit, V. Thongbookerd, Disfungsi mitokondria danginjalpenyakit batu, Depan. Fisiol. 11 (2020), 566506.
[59] SR Khan, Aspek histologis dari model pembentukan batu "partikel tetap": penelitian pada hewan, Urolitiasis 45 (2017) 75–87.
[60] VY Bird, SR Khan, Bagaimana batu terbentuk? Apakah penyatuan teori tentang pembentukan batu mungkin? Lengkungan. khususnya Url. 70 (2017) 12–27.
[61] JP Kavanagh, Metode untuk studi kristalisasi kalsium oksalat dan aplikasinya untuk penelitian urolitiasis, Scanning Microsc. 6 (1992) 685–704, diskusi 704-5.
[62] JP Kavanagh, L. Jones, PN Rao, Kinetika kristalisasi kalsium oksalat pada konsentrasi yang berbeda dari urin manusia dan buatan, dengan rasio kalsium terhadap oksalat yang konstan, Urol. Res. 27 (1999) 231–237.
[63] NK Saw, PN Rao, JP Kavanagh, A. nidus, crystalluria dan agregasi: bahan utama untuk pembesaran batu, Urol. Res. 36 (2008) 11–15.
[64] A. Borissova, GE Goltz, JP Kavanagh, TA Wilkins, Reverse engineering ginjal: pemodelan kristalisasi kalsium oksalat monohidrat di nefron, Med. Biol. Ind. Hitung. 48 (2010) 649–659.
[65] LA Thurgood, ES Sorensen, RL Ryall, Pengaruh osteopontin intrakristalin dan permukaan-terikat pada perlekatan kristal kalsium oksalat dihidrat ke sel ginjal anjing Madin-Darby (MDCK) dalam urin manusia ultrafiltered, BJU Int. 109 (2012) 1100-1109.
