Ekspresi Gen Reseptor Mirip Tol dan Respon Glial di Berbagai Wilayah Otak Scrapie Alami Bagian 2

2.2. Gambaran Neuropatologis pada Hipokampus Domba yang Terinfeksi Serapie Secara Alami

Pada domba yang terinfeksi scrapie dan kontrol, empat area hipokampus berikut diperiksa secara lebih rinci untuk semua penanda patologis: lapisan sel piramidal CA1, CA3, dan CA4, dan SLM (Gambar 3).

Penelitian terbaru menunjukkan bahwa lapisan sel piramidal memainkan peran penting dalam memori. Lapisan sel piramidal adalah saraf di otak yang terutama bertanggung jawab atas persepsi lingkungan eksternal dan penyimpanan memori.

Selama pembelajaran dan memori, lapisan sel piramidal melepaskan beberapa neurotransmiter, yang dapat merangsang komunikasi antar neuron, sehingga meningkatkan penyimpanan dan pengambilan memori. Selain itu, lapisan sel piramidal juga dapat menyaring dan mengintegrasikan informasi dalam proses pembelajaran dan memori, sehingga membantu kita menguasai pengetahuan dan keterampilan baru dengan cepat.

Penelitian juga menemukan bahwa fungsi dan kesehatan lapisan sel piramidal berdampak besar pada kinerja memori. Jika lapisan sel piramidal rusak atau mengalami stres berat, daya ingat mungkin akan sangat terpengaruh. Oleh karena itu, kesehatan dan pemeliharaan lapisan sel piramidal perlu kita perhatikan agar kemampuan belajar dan daya ingat tetap baik.

Rekomendasi untuk kesehatan dan pemeliharaan lapisan sel piramidal meliputi pola makan, olahraga, dan tidur. Misalnya, pola makan yang kaya asam lemak dan antioksidan dapat membantu meningkatkan kesehatan lapisan sel piramidal; olahraga teratur dapat meningkatkan fungsi dan ketahanan sistem saraf; dan kebiasaan tidur yang baik dapat membantu mengurangi stres pada lapisan sel piramidal dan meningkatkan konsolidasi dan pengambilan memori.

Singkatnya, lapisan sel piramidal berperan penting dalam pembelajaran dan memori. Kita harus memperhatikan kesehatan dan pemeliharaan lapisan sel piramidal untuk meningkatkan kemampuan belajar dan memori kita.

Klik Ketahui Memori Jangka Pendek cara meningkatkannya

Pada saat yang sama, kita harus menghindari kelelahan dan stres yang berlebihan, memberikan otak istirahat dan waktu pemulihan yang cukup, dan membiarkan ingatan kita terus ditingkatkan dan disempurnakan.

Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat kita. Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena memiliki efek antioksidan, antiinflamasi, dan anti penuaan, yang dapat membantu mengurangi reaksi oksidasi dan inflamasi di otak, sehingga melindungi kesehatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf.

Efek tersebut dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar, dan kecepatan berpikir, serta dapat mencegah terjadinya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Gambar 3. Distribusi lesi neuropatologis (HE), deposisi PrPSc, astrogliosis (GFAP), dan mikrogliosis (Iba1), di empat daerah hipokampus berbeda pada domba yang terinfeksi dan kontrol scrapie: lapisan sel piramidal CornuAmmonis (CA) 1, 3, dan 4 , dan stratum lacunosum-moleculare (SLM).

Grafik menggambarkan nilai penilaian semi kuantitatif untuk setiap parameter yang dianalisis. (A) Perubahan spongiform ringan diamati di seluruh wilayah hipokampus yang dianalisis. (B) Pola PrPSc intraneuronal (L42) pada CA1, CA3, dan CA4 dan pola PrPSc granular halus yang tersebar luas di SLM. (C) Peningkatan pewarnaan Iba1 pada domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan domba kontrol.

Gambar yang diperbesar menunjukkan beberapa perbedaan morfologi yang diamati. (D) Tanda-tanda astrogliosis reaktif sedang pada domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan dengan kontrol. Skor berkisar dari 0 (negatif) hingga 5 (intensitas maksimum).

Perbedaan yang signifikan ditentukan dengan menggunakan uji-t Student atau uji Mann-Whitney U untuk masing-masing data yang berdistribusi normal dan tidak normal. * p < 0.05, ** p < 0,01. Bilah skala=200 µm.

Spongiosis di hipokampus sangat ringan, dan kadang-kadang vakuola diamati di CA1, CA3, dan CA4, dan SLM (Gambar 3A). Hilangnya neuron yang terbatas ini kontras dengan deposisi PrPSc yang jarang namun intens secara fokus pada CA1 dan CA3 (Gambar 3B).

Pewarnaan PrPSc yang sangat ringan diamati pada CA4 dan SLM. Pola PrPSc yang berbeda diamati di area otak ini (Gambar S2). Sedangkan pola PrPSc yang berhubungan dengan intraneuronal dan neuropil mendominasi pada CA1 dan CA3, deposisi intraglial adalah pola morfologi utama yang diamati pada SLM.

Pola PrPSc intraneuronal dan neuropil yang ringan secara konsisten diamati pada CA4, meskipun intensitasnya lebih rendah daripada yang diamati pada CA1 dan CA3. Iba1 diekspresikan secara konstitutif dan didistribusikan secara jarang pada sampel kontrol. Sebaliknya, mikrogliosis yang nyata diamati pada CA1, CA3, dan CA4 dan SLM pada domba yang terinfeksi scrapie.

Namun, ciri morfologi mikroglial berbeda secara signifikan antara wilayah otak ini. Pada lapisan piramidal CA1, sebagian besar sel mikroglial menunjukkan proses pendek dengan badan sel membesar, ciri morfologi hipertrofik.

Pada CA4, sel mikroglial juga hipertrofik tetapi menunjukkan cabang yang lebih panjang dan lebih tipis dibandingkan sel mikroglial CA1. Sementara itu, mikroglia hipertrofik pada SLM menunjukkan proses yang pendek dan tipis dengan badan sel yang membengkak. Sebaliknya, di CA3, kami mengamati morfologi batang-mikroglia yang disebutkan di atas [42].

Sel mikroglial ini mempunyai badan sel yang memanjang, dengan proses primer paralel panjang yang berorientasi tegak lurus terhadap lapisan sel piramidal CA3, dan cabang tambahan yang lebih pendek dibandingkan proses primer panjang.

Imunostaining GFAP meningkat secara signifikan pada lapisan sel piramidal CA1 dan CA3 dari domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan domba kontrol. Menariknya, skor PrPSc tertinggi pada CA1 dan CA3. Tidak ada perbedaan yang diamati pada lapisan sel piramidal CA4 atau SLM.

2.3. Neuropatologi Tikus tg338 yang Terinfeksi Scrapie

Penanda neuropatologis yang sama dari spongiosis, deposisi PrPSc, mikrogliosis, dan astrogliosis yang dianalisis pada domba diperiksa di thalamus tikus yang terkena dampak klinistg338 yang telah terinfeksi scrapie intraserebral (Gambar 4).

Dibandingkan dengan kontrol, perbedaan yang signifikan (p <0.05) pada spongiosis diamati pada thalamus tikus yang terinfeksi scrapie, dimana vakuola terbatas pada neuropil.

Deposit PrPSc tersebar luas di tingkat sitoplasma dan neuropil. Penilaian gliosis menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam imunostaining Iba1 dan GFAP antara tikus yang terinfeksi scrapie dan tikus kontrol, dengan astrosit dan mikroglia menunjukkan morfologi hipertrofik.

Akumulasi PrPres juga dinilai oleh WB pada semua tikus yang terinfeksi scrapie, menunjukkan pola pita 19 kDa yang konstan (Gambar 5). Intensitas sinyal PrPres pada tikus tg338 lebih homogen antar individu dibandingkan pada domba, seperti yang diharapkan untuk infeksi eksperimental di mana dosis, usia inokulasi, dan waktu pengorbanan dikontrol.

Tidak ada sinyal yang terdeteksi pada tikus kontrol yang diinokulasi dengan homogenat otak normal, tidak sesuai dengan hasil IHC negatif.

Gambar 4. Bagian thalamus dari tikus kontrol yang terinfeksi scrapie (inokulasi intraserebral) dan tikus kontrol yang disesuaikan usianya yang diberi imunostain untuk menilai spongiosis (hematoksilin-eosin), pengendapan PrPSc (antibodi R486), astrosit (protein asam glial fibrillary; GFAP), dan mikroglia (kalsium terionisasi -molekul adaptor pengikat-1; (A, E) Lesi spongiform parah yang terletak terutama di neuropil tikus yang terinfeksi scrapie dibandingkan tikus kontrol. (B, F) Beberapa neuron positif PrPSc terlihat jelas pada tikus yang terinfeksi scrapie, namun tidak ada pada kontrol. (C, G) Mikroglia teraktivasi menunjukkan proses imunostaining yang lebih intens dan tebal pada tikus yang terinfeksi scrapie dibandingkan kontrol. (D, H) Peningkatan astrogliosis dengan badan sel hipertrofik dan proses pada tikus yang terinfeksi scrapie dibandingkan kontrol. Skor berkisar dari 0(negatif) hingga 5 (intensitas maksimum).

Perbedaan yang signifikan ditentukan dengan menggunakan uji Mann-Whitney U uji-t Student untuk data yang berdistribusi normal dan tidak normal. * p < 0.05,** p < 0,01. Bilah skala=200 µm.

Gambar 5. Deteksi Western blot terhadap akumulasi PrPres di SSP tikus tg338 yang terkena dampak klinis yang diinokulasi intraserebral dengan scrapie dibandingkan dengan kontrol yang cocok.

Jumlah protein yang setara dimuat untuk perbandingan yang memadai dan imunoblot dijalankan menggunakan antibodi monoklonal SHA31. Penanda berat molekul (kDa) ditunjukkan di sisi kiri immunoblot.

Peningkatan regulasi ekspresi TLR sebagai respons terhadap Prpsc sebelumnya telah dilaporkan dalam kondisi eksperimental in vivo dan in vitro. Oleh karena itu, setelah mengkarakterisasi adanya perubahan neuropatologis utama yang diinduksi prion di SSP dalam konteks penyakit alami dan eksperimental, kami menyelidikinya. apakah perubahan ini berkorelasi dengan perubahan ekspresi gen TLR.

Untuk tujuan ini, kami melakukan qPCR menggunakan sampel dari empat wilayah otak domba untuk menilai ekspresi MyD8g dan Trif, dua protein adaptor utama yang terlibat dalam pensinyalan TLR; CD36, reseptor pemulung yang bekerja sama dengan TLR; dan TLR mRNA.

Selain itu, kami mengukur tingkat empat pro dan anti. sitokin inflamasi di thalamus dan hipokampus domba untuk menilai lebih lanjut respon inflamasi. Pada tikus tg338, kami mengukur level mRNA MyD88 dan TLR1-9 di thalamus.

Gen yang perbedaan signifikannya diamati pada kontrol, dan perubahan lipatan yang terkait, ditunjukkan pada Tabel $l, dan nilai ACt dari kontrol dan domba yang terinfeksi scrapie ditunjukkan pada Gambar $3.

Jumlah gen yang diubah menurun dalam arah ekor-rostral. Medula oblongata domba yang terinfeksi scrapie adalah wilayah di mana perubahan terbesar dalam ekspresi gen TLR diamati (Gambar 6). Di wilayah ini, ekspresi TLR2, 3, 4, 6,7, 8, 9, dan CD36 secara signifikan lebih tinggi (p <0.01) pada hewan yang terinfeksi scrapie dibandingkan hewan kontrol.
Di thalamus, TLR6, MyD88, dan CD36 mengalami peningkatan regulasi secara signifikan pada kelompok yang terinfeksi scrapie (p < 0.05), sedangkan TLR2 dan TLR3 menunjukkan kecenderungan peningkatan regulasi (p < {{12} }.1). Di korteks frontal (daerah paling rostral), TLR4 dan CD36 adalah satu-satunya gen yang diekspresikan secara berlebihan (p <0,05).

Hebatnya, pola ekspresi yang kontras ditemukan di hipokampus domba yang terinfeksi scrapie, di mana TLR2 dan MyD88 mengalami penurunan regulasi (p < 0.01) dan TLR1 menunjukkan kecenderungan penurunan regulasi (p < 0,1) .

Selain itu, hipokampus adalah satu-satunya area di mana ekspresi CD36 tidak meningkat. Secara keseluruhan, TLR4 adalah gen yang paling banyak diregulasi pada domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan domba kontrol di keempat wilayah otak, meskipun tidak ada perbedaan signifikan yang teramati di thalamus atau hipokampus karena variabilitas intra-individu.

Analisis tingkat sitokin mengungkapkan ekspresi berlebih TGF-, IL-10, dan IL-6 di thalamus domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan domba kontrol, tetapi tidak ada perubahan di hipokampus (Gambar 7).

Gambar 6. Ekspresi gen TLR 1-10, MyD88, Trif, dan CD36 di medula oblongata (A), thalamus (B), frontal cortex (C), dan hippocampus (D) pada domba kontrol dan yang terinfeksi scrapie .

Data direpresentasikan sebagai lipatan rata-rata ± peningkatan SEM pada domba kontrol (dinyatakan sebagai skor 1). Nilai rata-rata dibandingkan dengan menggunakan uji Student t-test atau Mann-Whitney U untuk masing-masing data berdistribusi normal dan tidak normal. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

Gambar 7. Ekspresi gen sitokin anti-inflamasi TGF- dan IL-10, dan sitokin proinflamasi TNF- dan IL-6, di thalamus (A) dan hippocampus (B) kontrol dan secara alami scrapie -domba yang terinfeksi.

Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± perubahan lipat SEM mengenai kontrol (dinyatakan sebagai skor 1). Skor rata-rata dibandingkan dengan menggunakan uji Student t-test atau Mann-Whitney U untuk masing-masing data yang berdistribusi normal dan tidak normal. * hal < 0.

Untuk menguji apakah perubahan ekspresi TLR di SSP pada penyakit alami sebanding dengan yang diinduksi dalam model murine tg338 setelah infeksi intraserebral dengan scrapie, tingkat transkripsi TLR dan MyD88 dievaluasi di thalamus tikus g338 (Gambar 8). Level mRNA TLR1 dan TLR2 meningkat secara signifikan (p <0.01) dibandingkan dengan kontrol, dan terdapat kecenderungan peningkatan regulasi TLR7 (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

Gambar 8. Ekspresi gen TLR1-7, TLR9, dan MyD88 di thalamus tikus tg338 yang terkena dampak klinis yang diinokulasi secara intraserebral dengan inokulum scrapie-positif versus kontrol (scrapie-negativeinoculum). Hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± perubahan SEM kali lipat mengenai kontrol (dinyatakan sebagai skor 1). Skor rata-rata dibandingkan dengan menggunakan uji-t Student atau uji Mann-Whitney U untuk masing-masing data yang berdistribusi normal dan tidak normal. # p < {{10}}.1, ** p < 0,01.

2.5. Penilaian Tingkat Protein TLR4 Mengonfirmasi Peningkatan Regulasi yang Terdeteksi oleh qPCR pada Domba yang Terinfeksi Scrapie

Untuk memastikan bahwa peningkatan mRNA TLR4 yang diamati berarti perubahan kadar protein, TLR4 dievaluasi oleh WB di medula oblongata, thalamus, hipokampus, dan korteks frontal dari empat domba yang terinfeksi scrapie dan empat domba kontrol (Gambar 9).

Sesuai dengan hasil qPCR, kadar protein TLR4 meningkat secara signifikan (p <00,05) di keempat wilayah otak domba yang terinfeksi scrapie.

Gambar 9. Ekspresi protein TLR4 di medula oblongata (Mo), thalamus (Th), hipokampus (Hc), dan korteks frontal (Fc) domba yang terinfeksi scrapie versus domba kontrol (n=4 per kelompok). -aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan.

Grafik tersebut menggambarkan nilai densitometri dan menunjukkan peningkatan signifikan dalam ekspresi TLR4 di semua wilayah pada domba yang terinfeksi scrapie dibandingkan domba kontrol. Data dinyatakan sebagai mean ± SEM. Skor rata-rata dibandingkan dengan menggunakan uji-t Student. * hal < 0.05.

3. Diskusi

Dalam beberapa tahun terakhir, studi tentang respon neuroinflamasi pada penyakit prion telah menghasilkan pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme yang mendasari dan konsekuensinya.

Neuroinflamasi melibatkan mikrogliosis reaktif dan astrogliosis [43], keduanya dapat dideteksi sebelum timbulnya tanda-tanda klinis dan mendahului spongiosis dan hilangnya neuron [7,8,18].

Apakah aktivasi mikroglial pada penyakit prion bermanfaat atau berbahaya masih menjadi perdebatan. Beberapa penulis berpendapat bahwa aktivasi dan proliferasi mikroglial berkontribusi terhadap proses inflamasi saraf dan akibat degenerasi saraf [8,18,44].

Namun, penelitian lain menunjukkan peran protektif mikroglia secara keseluruhan, dan penelitian in vitro menunjukkan bahwa mikroglia dapat menginternalisasi dan mendegradasi PrPSc [27,45]. Sejalan dengan temuan ini, percobaan in vivo menunjukkan bahwa penipisan mikroglial menurunkan masa kelangsungan hidup, mungkin karena berkurangnya pembersihan PrPSc [46,47].

Oleh karena itu, masuk akal bahwa beberapa fenotip mikroglial reaktif ada selama proses penyakit, memberikan efek neuroprotektif pada tahap awal penyakit dan, seiring perkembangan penyakit, memberikan jalan bagi fenotip proinflamasi yang menimbulkan efek merugikan [9,10]. Salah satu hipotesis mengusulkan bahwa pensinyalan TLR memediasi aktivasi sel glial pada penyakit prion.

Penyerapan mikroglia serat amiloid pada penyakit Alzheimer diketahui didorong oleh aktivasi TLR [48,49]. Jadi, sementara aktivasi TLR pada sel glial mungkin berperan dalam pembersihan protein teragregasi atau abnormal (misalnya protein prion), aktivasi kronis mungkin merugikan inang, mengakibatkan neurotoksisitas dan kematian sel saraf [50].

Sampai saat ini, data mengenai peran TLR dalam patogenesis prion sangat terbatas. Beberapa penelitian telah mengukur perubahan ekspresi TLR di SSP pada model murine, dan salah satu penelitian telah melaporkan perubahan ekspresi TLR dalam darah domba, dengan semua kasus menggunakan hewan percobaan yang terinfeksi penyakit prion [22,26,30].

For more information:1950477648nn@gmail.com