Pemodelan Penyakit Dengan Organoid Ginjal Ⅱ

4. Strategi Meningkatkan Platform Organoid Ginjal

Pameran organoid ginjal terkinistruktur yang berhubungan dengan ginjaltapi tidak miripginjal orang dewasa yang berfungsi. Dengan demikian, protokol yang dijelaskan dalam Bagian2.2 menimbulkan organoid ginjal yang tidak memiliki lingkungan biofisik seperti in vivo, termasuk aliran cairan melalui jaringan. Penelitian terbaru telah meningkatkan kemiripan organoid dengan ginjal orang dewasa, menggunakan teknik seperti transplantasi dan menggabungkan berbagai jenis organoid untuk mencapai struktur ginjal tingkat tinggi. Teknik-teknik ini dapat dikombinasikan dengan pendekatan bioteknologi untuk mengeksplorasi dan meningkatkan pematangan organoid. Di bawah ini, kami akan menyoroti strategi-strategi tersebut dan mendiskusikan pertimbangan-pertimbangan baru untuk menghasilkan generasi mendatangsistem organoid ginjal. 

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN CISTANCHE UNTUK PENGOBATAN CKD

4.1. Memperkenalkan Gradien

Kita tahu bahwa selama embriogenesis normal, mesonefros, metanefros, dan UB mengirimkan sinyal satu sama lain untuk membentuk pola perkembangan ginjal [6]. Selain itu, gradien biokimia yang terbentuk pada embrio awal sangat penting untuk mengarahkan pola dan perkembangan ginjal yang tepat [47]. Masalah penting dalam protokol pengembangan organoid ginjal kita saat ini adalah isolasi organoid ginjal dari jaringan tubuh lain selama perkembangan, dan dengan demikian kurangnya gradien biokimia yang terbentuk melalui interaksi dengan sistem jaringan embrio yang sedang berkembang. Oleh karena itu, interaksi tersebut bermanfaat untuk dimasukkan dalam pengembangan organoid. Taguchi dan Nishinakamura (2017) dan Tsujimoto dkk. (2020) telah mempertimbangkan beberapa interaksi ini untuk memfasilitasi pematangan organoid [17,24]. Dalam strategi mereka, pertama-tama mereka menggunakan faktor spesifik PIM dan AIM untuk mengembangkan organoid independen, kemudian mentransplantasikan organoid MM dan UB hasil kultur bersama ke tikus [17,24]. Organoid ginjal yang dikembangkan dengan cara ini menunjukkan struktur tingkat tinggi tetapi tidak dapat merekapitulasi percabangan UB yang luas seperti in vivo. Meskipun studi-studi ini menggarisbawahi pentingnya kultur bersama jaringan-jaringan di sekitarnya, mereka menyerukan peningkatan organoid melalui gradien yang sudah ada sejak awal perkembangan organoid.

Karena hampir mustahil untuk memasukkan setiap jaringan dari embrio yang sedang berkembang dan mengoptimalkan kondisinya, kami mengusulkan simulasi lingkungan, di mana sel-sel mengalami efek dari jaringan di sekitarnya. Hal ini dapat dicapai dengan merekayasa gradien biokimia untuk menumbuhkan sel, dimana gradien tersebut dapat meniru keberadaan jaringan di sekitarnya. Gradien tersebut kemudian dapat mengarahkan garis keturunan AIM dan PIM dalam suspensi sel yang sama, dan dengan demikian menginduksi pembentukan UB dan MM secara bersamaan. Misalnya, kita dapat membuat gradien GDNF dan memajukan percabangan UB dalam MM untuk menginduksi pembentukan sistem saluran pengumpul yang rumit pada ginjal orang dewasa.

Meskipun pendekatan berbasis gradien ini belum dieksplorasi untuk membentuk organoid ginjal, pendekatan ini telah digunakan untuk meningkatkan pematangan organoid lainnya. Misalnya, Ben-Reuven dan Reiner dkk. (2020) menyematkan manik-manik pelepas morfogen dalam hidrogel untuk membantu membentuk pola sumbu anterior-posterior organoid otak [48]. Dalam penelitian lain, Kamperman dkk. (2019) membentuk substrat sel dengan morfogen yang terbiotinilasi [49]. Selain pendekatan statis ini, para peneliti juga telah mengembangkan chip mikrofluida dengan penambahan morfogen yang digerakkan oleh sesama. Misalnya, Cui dkk. (2020) menggunakan ruang dengan ruang kemotaksis untuk distribusi morfogen dan ruang di mana sel induk dapat dikultur dalam hidrogel [50]. Oleh karena itu, para peneliti dapat menerapkan sistem serupa untuk memprogram pengembangan organoid ginjal menggunakan faktor-faktor spesifik yang dikontrol secara spasial untuk memediasi dampaknya. Hal ini akan membentuk gradien dan meniru distribusi morfogen alami yang relevan dengan perkembangan ginjal embrio. Misalnya, manik-manik dengan faktor spesifik untuk diferensiasi AIM dan PIM dapat diunggulkan pada sisi berlawanan dari hidrogel untuk meniru gradien AIM-PIM alami. Alternatifnya, untuk mengontrol diferensiasi hiPSC, sel atau organoid dapat diunggulkan ke dalam perangkat mikrofluida, sehingga sel/organoid dari garis keturunan berbeda berada pada sisi yang berlawanan (lihat Gambar 5A). HiPSC yang tertanam dalam hidrogel dapat dikultur di antara kedua struktur ini, yang dapat berfungsi sebagai sumber faktor morfogenik. Pendekatan ini dapat digunakan untuk meniru interaksi antara mesonefros dan metanefros, yang tidak dimiliki oleh protokol organoid ginjal saat ini (lihat Gambar 5A). Dengan demikian, penelitian di masa depan harus bertujuan untuk meniru isyarat biokimia dari berbagai jenis jaringan yang relevan dengan perkembangan ginjal, termasuk antara UB dan MM, serta antara ginjal yang sedang berkembang dan pembuluh darah. Desain sistem terkait dapat mengeksplorasi opsi untuk menetapkan gradien untuk meniru interaksi tersebut.

4.2. Perfusi Organoid dengan Mikrofluida

Aliran cairan sangat penting untukfisiologi ginjalkarena ia memulai rangkaian peristiwa intraseluler sebagai respons terhadap mekanosensing dan memfasilitasi transportasi melintasi jaringan [51]. Oleh karena itu, jika kita ingin menghasilkan organoid ginjal yang berfungsi dan mempertahankannya untuk jangka waktu yang lama, kita harus mengintegrasikan jaringan pembuluh darah yang stabil dan dapat diperfusi ke dalam sistem model organoid kita. Aliran cairan telah dimasukkan ke organoid ginjal melalui dua cara utama, mikrofluida dan transplantasi. Homan dkk. (2019) memasukkan isyarat biofisik dalam chip bio-cetak 3D, dimana organoid dikultur dalam ruangan dengan aliran fluida dinamis [52]. Pengaturan ini mensimulasikan mikrofluida dan mendorong pembentukan jaringan pembuluh darah, namun tidak merekapitulasi perfusi melalui struktur pembuluh darah dan tubulus untuk meniru fisiologi ginjal. Namun demikian, penelitian ini menyoroti pentingnya lingkungan biofisik dalam pematangan organoid.

Gambar 5. Usulan perbaikan pada platform organoid ginjal. (A) Pendekatan untuk menghasilkan gradien di mana hiPSC dapat dikultur untuk berevolusi menjadi organoid ginjal. Dari kiri ke kanan: cluster iPSC dalam hidrogel diapit oleh manik-manik yang memancarkan morfogen, cluster hiPSC dalam hidrogel diapit oleh organoid yang memancarkan morfogen, sistem chip multi-bilik dengan cluster hiPSC yang dikultur dalam hidrogel dan secara bilateral terpapar pada morfogen dari garis keturunan NP dan UB yang terkandung dalam cairan. (B) Usulan sistem chip untuk membiakkan organoid ginjal di samping saluran endotel bercabang, dengan tindak lanjut dalam hidrogel (misalnya matriks kolagen). (C) Usulan pengaturan perancah, di mana organoid ginjal dapat ditumbuhkan dan kemudian ditransplantasikan. Dari kiri ke kanan: perancah berpori dengan saluran endotel bercabang (merah), organoid ginjal berbiji, dan manik-manik morfogen berbiji (bola merah dan biru); perancah berpori dengan organoid NP yang mengelilingi organoid UB

Kami percaya bahwa seseorang dapat mengembangkan organoid dalam platform organ-on-chip mikrofluida yang disalurkan untuk memodelkan ginjal manusia, seperti yang telah dilakukan dalam sistem spheroidal lainnya. Misalnya, tidak seperti Homan dkk. (2019), yang menempatkan organoid di ruang sesama cairan, Nashimoto dkk. (2017) membiakkan spheroid fibroblas paru manusia dalam matriks ekstraseluler (ECM) antara dua saluran endotel [52,53]. Saluran tersebut memunculkan jaringan pembuluh darah perfusi yang terbentuk melalui angiogenesis. Menggunakan pendekatan yang agak mirip dengan Nashimoto dkk. (2017), kami mengusulkan untuk menempatkan cluster hiPSC di sebelah pembuluh endotel perfusi yang dapat dibangun menjadi sebuah chip, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5B [53]. Dengan penambahan sinyal spesifik organoid ginjal yang tumbuh, saluran pembuluh darah dapat diarahkan untuk bercabang dan menyerang organoid saat organoid tersebut mulai berdiferensiasi. Konfigurasi ini akan mereplikasi tahap awal perkembangan ginjal [54]. Dengan perfusi berkelanjutan dari sinyal morfogenetik yang diperlukan untuk perkembangan ginjal, organoid ginjal seharusnya mampu mereplikasi proses pembentukan ginjal manusia dengan lebih baik. Penting juga bahwa parameter sistem, seperti tekanan fluida, komposisi dan konfigurasi ECM, dan tahap organoid dipertimbangkan dan dioptimalkan dengan cermat. Selanjutnya, sejak Schumacher dkk. (2021) telah menunjukkan bahwa hipoksia menyebabkan peningkatan angiogenesis pada organoid ginjal, sistem ex vivo seperti itu dapat dikultur dengan adanya penurunan oksigen untuk menginduksi vaskularisasi dengan lebih efisien [55]. Pada akhirnya, strategi ini harus memfasilitasi pematangan organoid, merekapitulasi perfusi vaskular dan tubular, dan menjalankan fungsi fisiologis yang terjadi secara in vivo.

4.3. Memajukan Pematangan Organoid melalui Transplantasi

Penelitian telah menunjukkan bahwa transplantasi organoid ginjal ke inang, seperti tikus, telur ayam, atau tikus, dapat memberikan jalur yang memungkinkan untuk vaskularisasi [16,33,56]. Namun, organoid yang ditransplantasikan menunjukkan keberhasilan yang terbatas sebagai struktur fungsional. Rintangan utama dalam strategi ini adalah merekapitulasi percabangan UB yang luas dalam MM organoid yang ditransplantasikan. Selain itu, segmen nefron dalam organoid tidak memiliki orientasi yang tepat terhadap saluran pengumpul. Ciri-ciri ini penting agar organoid yang ditransplantasikan dapat menjalankan fungsi ginjal manusia dewasa. Selain itu, organoid pasca transplantasi berintegrasi dengan inang, sehingga sulit untuk membedakan batas jaringan organoid vs. inang, dan dengan demikian membatasi analisis spesifik organoid.

Strategi rekayasa jaringan menyediakan berbagai alat untukmeningkatkan perkembangan organoid ginjaldalam hal pematangan dan integrasi fungsional. Biasanya, pendekatan rekayasa jaringan menggunakan perancah (misalnya perancah fibroin sutra) dalam berbagai konfigurasi, seperti film, tikar, hidrogel, dan spons, untuk mendukung susunan sel dan merekapitulasi berbagai isyarat biofisik dari masalah yang diinginkan. Misalnya, dalam sebuah penelitian, Gupta dkk. (2019) menggunakan perancah sutra berpori untuk menumbuhkan organoid, diikuti dengan transplantasi [31]. Dalam pendekatan ini, biomaterial dan konfigurasi perancah memberikan kerangka kerja untuk mendukung pengembangan organoid dan memberikan stabilitas pada transplantasi. Namun, sistem ini tidak memiliki isyarat fungsional untuk mendukung pematangan organoid, seperti pengembangan pembuluh darah bersama dengan sesamanya yang berdekatan dengan struktur berkembang lainnya.

Penelitian di masa depan dapat mengembangkan strategi serupa dan memasukkan isyarat fungsional untuk mendukung pematangan organoid. Misalnya, seperti diuraikan dalam Gambar 5C, perancah berpori dapat dikonfigurasikan dengan saluran perfusi dan diisi dengan faktor morfogenik untuk mengembangkan sistem pengembangan organoid yang relevan melalui transplantasi. Pra-penyemaian dengan sel endotel dapat mendukung perkembangan pembuluh darah yang terarah, sedangkan struktur berpori terbuka dapat diunggulkan dengan hiPSC dan diprogram melalui faktor morfogenetik untuk pengembangan organoid. Sebagai alternatif, matriks ekstraseluler (ECM) yang disekresikan dari jaringan ginjal dapat, dengan sendirinya, berfungsi sebagai bahan perancah untuk rekayasa jaringan organoid ginjal. Misalnya, ginjal yang mengalami dekellularisasi telah digunakan untuk mendukung pematangan organoid. Matriks tersebut dapat digunakan untuk membiakkan dan mentransplantasikan organoid atau untuk mendapatkan perancah rekayasa jaringan dari biomaterial tersebut.

Selain itu, perancah menghadirkan peluang yang belum dimanfaatkan untuk menyatukan beberapa garis keturunan organoid pada posisi yang dipilih. Misalnya, Taguchi dan Nishinakamura (2017) dan Tsujimoto dkk. (2020) mentransplantasikan organoid UB dan NP, memungkinkan mereka melakukan vaskularisasi [17,24]; namun, mereka tidak memiliki perancah ekstraseluler untuk mengarahkan organoid multi-garis keturunan mereka. Dengan memanfaatkan perancah, kita dapat meniru pembentukan nefron di sekitar struktur pengumpulan tunggal dengan mengarahkan organoid UB di tengah dan bawah perancah. Pada saat yang sama, kita dapat menyemai organoid NP di sepanjang bagian luarnya (lihat Gambar 5C). Pendekatan rekayasa jaringan serupa dapat dikembangkan untuk memajukan pematangan organoid. Namun demikian, ketika merancang pendekatan berbasis rekayasa jaringan untuk transplantasi organoid, parameter seperti konfigurasi dan kompatibilitas biomaterial harus dipilih dengan cermat, sesuai dengan kebutuhan ginjal.

5. Kesimpulan

Perkembanganorganoid ginjalmerupakan terobosan besar secara in vitropemodelan penyakit ginjal. Organoid ginjalmemungkinkan untuk studi individual tentangpenyakit ginjal genetikdan skrining obat dalam platform yang berasal dari manusia. Meskipun organoid ginjal sangat menjanjikan, organoid ginjal masih belum matang dan terisolasi dalam bentuknya saat ini. Untuk benar-benar memodelkanginjal manusiadan penyakit terkait, kita perlu mematangkan penyakit tersebut dengan merekapitulasi perkembangan interaksi ginjal. Secara khusus, kita perlu memajukan interaksi antara UB dan MM secara in vitro dan memperkenalkan pembuluh darah yang diturunkan dari manusia ke organoid ginjal. Kita juga harus mempertimbangkan pendekatan morfogen berbasis gradien untuk paralel dengan perkembangan embrio manusia in vivo. Organoid ginjal memiliki potensi besar untuk studi genetik orang dewasa danpenyakit ginjal janindan skrining obat. Kemajuan mereka dapat mengarah pada pengembangan penyelamatan jiwapenyakit ginjalperawatan dengan cara yang lebih cepat dan akurat dibandingkan sebelumnya.

Referensi

1. Bannier-Hélaouët, M.; Pos, Y.; Korving, J.; Trani Bustos, M.; Gehart, H.; Begthel, H.; Bar-Efraim, KAMU; van der Vaart, J.; Kalmann, R.; Imhoff, SM; dkk. Menjelajahi Kelenjar Lakrimal Manusia Menggunakan Organoid dan Urutan Sel Tunggal.Sel Induk Sel2021, 28, 1221–1232.e7. [Referensi Silang] [PubMed]

2. Lee, J.; Rabbani, CC; Gao, H.; Steinhart, BAPAK; Woodruff, BM; Pflulum, ZE; Kim, A.; Neraka, S.; Liu, Y.; Penjual Kapal, TZ; dkk. Kulit manusia yang memiliki rambut seluruhnya dihasilkan dari sel induk berpotensi majemuk.Alam2020, 582, 399–404. [Referensi Silang] [PubMed]

3. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Induksi sel induk berpotensi majemuk dari kultur embrio tikus dan fibroblas dewasa dengan faktor tertentu.Sel2006, 126, 663–676. [Referensi Silang] [PubMed] 

4. Fakta Global: Tentang Penyakit Ginjal. Tersedia daring:https://www.kidney.org/kidneydisease/global-facts-about-kidney disease#:~{}:text=10%25%20of%20the%20population%20worldwide,have%20access%20to%20affordable %20perawatan(diakses pada 6 Juli 2022).

5. Rehman, S.; Ahmad, D.Embriologi, Ginjal, Kandung Kemih, dan Ureter; StatPearls: Treasure Island, FL, AS, 2022.

6. Reidy, KJ; Rosenblum, ND Cell dan biologi molekuler perkembangan ginjal.Semin. Nefrol.2009, 29, 321–337. [Referensi Silang] [PubMed] 

7. Ryan, D.; Sutherland, M.; Flores, TJ; Kent, AL; Dahlstrom, J.; Puelles, V.; Bertram, J.; McMahon, AP; Sedikit, MH; Moore, L.; dkk. Perkembangan ginjal janin manusia dari pertengahan hingga akhir kehamilan pada bayi laki-laki dan perempuan.eBioMedis2017, 27, 275–283. [Referensi Silang] 

8. Al-Awqati, Q.; Oliver, JA Stem sel di ginjal.Ginjal Int.2002, 61, 387–395. [Referensi Silang] 

9. Tran, F.; Klein, C.; Arlt, A.; Saya, S.; Knappe, E.; Simmons, A.; Rosenstiel, P.; Seibler, P. Sel induk dan teknologi organoid dalam pengobatan presisi pada peradangan: Apakah kita sudah sampai di sana?Depan. imunol.2020, 11, 573562. [Referensi Silang]

10. Embun beku, J.; Clevers, H. Aplikasi translasi organoid yang berasal dari sel induk dewasa.Perkembangan2017, 144, 968–975. [Referensi Silang] 

11. Hishikawa, K.; Takase, O.; Yoshikawa, M.; Tsujimura, T.; Nangaku, M.; Takato, T. Sel mirip induk dewasa di ginjal.Dunia J. Sel Punca2015, 7, 490–494. [Referensi Silang]