Paparan Knalpot Diesel Mengubah Ekspresi Jaringan yang Terlibat dalam Degenerasi Saraf pada Otak Ikan Zebra Bagian 1

Abstrak

Penyakit neurodegeneratif merupakan penyebab utama kecacatan di dunia, namun etiologinya masih sulit dipahami. Faktor genetik hanya berperan kecil dalam risiko sebagian besar penyakit ini, sehingga menunjukkan bahwa faktor lingkungan memainkan peran penting dalam perkembangan penyakit ini.

Penyakit neurodegeneratif mengacu pada jenis penyakit yang menyebabkan degenerasi sel otak karena berbagai alasan. Yang umum termasuk penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, penyakit Huntington, dll. Penyakit-penyakit ini mempengaruhi neuron di otak, mengakibatkan gangguan fungsi otak dan gejala seperti memori, pemikiran, dan perubahan perilaku.

Namun, kita tidak perlu kehilangan sikap positif karena penyakit-penyakit tersebut. Ada banyak cara untuk membantu pasien meningkatkan daya ingat dan meringankan gejala. Mari kita lihat beberapa metode berikut:

Pertama, lakukan latihan fisik. Penelitian menunjukkan bahwa aktivitas fisik meningkatkan sirkulasi darah di otak dan meningkatkan pelepasan bahan kimia seperti dopamin dan endorfin, yang membantu melindungi dan meningkatkan fungsi neuron. Di saat yang sama, olahraga juga dapat membantu mengurangi masalah seperti kecemasan, depresi, dan insomnia, sehingga membuat pasien lebih nyaman menghadapi hidup.

Kedua, menjaga hubungan sosial. Penting juga bahwa jaringan sosial kita terhubung erat dengan area terkait di otak, dan interaksi sosial tidak hanya dapat mengurangi stres, tetapi juga meningkatkan kesehatan otak dengan meningkatkan kebahagiaan, melawan depresi, dan banyak lagi.

Terakhir, makanlah dengan baik dan tidur yang cukup. Kedua aspek ini dapat berdampak penting pada kesehatan otak. Pola makan yang baik tidak hanya perlu mencakup nutrisi yang cukup, tetapi juga perlu menghindari konsumsi terlalu banyak gula, lemak jenuh, dan kolesterol berulang kali. Selain itu, tidur yang cukup dapat membantu mengatasi masalah daya ingat pada berbagai tahap, terutama penyakit seperti penyakit Alzheimer.

Singkatnya, penyakit neurodegeneratif tidak berarti menyerah pada harapan hidup. Selain menjaga sikap positif, kita juga perlu menerapkan metode ilmiah dan efektif untuk meningkatkan kualitas hidup. Lebih banyak tawa dan lebih banyak sinar matahari akan membantu Anda tetap sehat. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat Cistanche deserticola berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam tanat, polisakarida, glikosida flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak melalui berbagai jalur.

Klik tahu 10 cara meningkatkan daya ingat

Paparan polusi udara dalam waktu lama baru-baru ini diketahui meningkatkan risiko penyakit Alzheimer dan Parkinson, namun mekanisme molekuler yang mendasari tindakannya belum dipahami dengan baik.

Embrio ikan zebra yang terkena ekstrak partikel knalpot diesel (DEPe) menyebabkan disfungsi autophagy dan hilangnya neuron. Di sini, kami mengekspos embrio ikan zebra ke DEPe dan melakukan analisis ekspresi proteomik dan transkriptomik throughput tinggi dari otak mereka untuk mengidentifikasi jalur patogen yang disebabkan oleh polusi udara. Pengobatan DEPe mengubah beberapa proses biologis dan jalur sinyal yang relevan dengan proses neurodegeneratif, termasuk metabolisme xenobiotik, pematangan fagosom, dan pemrosesan amiloid. Induksi ekspresi gen terbesar di otak terjadi pada Cyp1A (lebih dari 30-kali lipat).

Relevansi perubahan ekspresi ini dikonfirmasi dengan memblokir induksi menggunakan CRISPR/Cas9, yang menghasilkan peningkatan sensitivitas terhadap toksisitas DEPe secara dramatis, menegaskan bahwa induksi Cyp1A adalah mekanisme perlindungan kompensasi.

Studi-studi ini mengidentifikasi jalur molekuler yang terganggu yang mungkin berkontribusi terhadap patogenesis gangguan neurodegeneratif. Pada akhirnya, menentukan dasar molekuler tentang bagaimana polusi udara meningkatkan risiko degenerasi saraf akan membantu dalam pengembangan terapi pengubah penyakit.

Kata kunci

Polusi udara · Demensia · Penyakit Parkinson · Penyakit Alzheimer · Transkriptomik · Proteomik.

Perkenalan

Polusi udara merupakan penyumbang utama kematian dan berhubungan dengan penyakit pernapasan, penyakit jantung, stroke, kanker paru-paru, dan diabetes. Bukti epidemiologi yang muncul mendukung hubungan antara paparan polusi udara dan perkembangan penyakit neurodegeneratif, termasuk penyakit Alzheimer dan Parkinson (AD dan PD) (Fu et al. 2019). Terdapat sedikit penelitian yang menyelidiki mekanisme bagaimana polusi udara dapat meningkatkan risiko AD dan PD, namun hanya sedikit penelitian yang mendukung hubungan sebab akibat (Fu et al. 2019).

Akumulasi inklusi protein di otak merupakan ciri universal gangguan neurodegeneratif dan kemungkinan merupakan jalur umum yang menyebabkan disfungsi saraf dan kematian. Misalnya, pembentukan struktur amiloid-beta (A-beta) dan tau merupakan ciri patologis dari agregat AD dan -synuclein (-syn) atau Badan Lewy pada PD (Ross dan Poirier 2004; Woulfe 2008).

Perubahan pada proteostasis tampaknya setidaknya sebagian mendasari pembentukan agregat ini, namun mekanisme pastinya masih belum diketahui dan mungkin berbeda-beda pada setiap individu tergantung pada faktor risiko genetik dan lingkungan. Kita tahu bahwa peningkatan ekspresi atau penurunan degradasi A-beta atau -syn dapat menyebabkan AD dan PD (Bostancıklıoğlu 2019; Johnson et al. 2019).

Ciri umum lainnya pada gangguan neurodegeneratif adalah peradangan dan stres oksidatif. Mikroglia yang teraktivasi, yaitu sel inflamasi di SSP, dapat dengan mudah diketahui pada otopsi otak penderita AD dan PD dan kemungkinan besar berkontribusi terhadap patogenesis degenerasi saraf (Kannarkat dkk. 2013). Peradangan ini dan kemungkinan disfungsi mitokondria diperkirakan menyebabkan stres oksidatif yang juga terjadi pada otak yang diotopsi (Picca et al. 2020).

Mayoritas studi mekanistik mengenai polusi udara dan degenerasi saraf hingga saat ini berfokus pada peradangan (Jayaraj et al. 2017). Polusi udara tampaknya meningkatkan peradangan SSP dan stres oksidatif pada otak hewan dan manusia (Calderón-Garcidueñas et al. 2004, 2007, 2008a,b dan c; Levesque et al. 2011a, b, 2013; Moultonand Yang 2012; Mumaw et al. 2017; Yokota dkk.2013a, b).

Yang menarik adalah temuan bahwa polusi udara meningkatkan ekspresi beberapa gen peradangan pada olfactory bulb (OB) tikus, yaitu wilayah otak di mana patologi PD terlihat pada tahap awal penyakit (Levesque dkk. 2011a, b;Yokota dkk. 2013a) . Peradangan juga terlihat pada anjing yang tinggal di daerah perkotaan dibandingkan dengan anjing yang tinggal di daerah pedesaan, dan penulis berspekulasi bahwa perubahan ini disebabkan oleh tingginya tingkat polusi udara (Calderón-Garcidueñas et al. 2003).

Penulis yang sama juga menyatakan bahwa -syn terakumulasi di otak orang yang tinggal di perkotaan akibat polusi udara (Calderón-Garcidueñas dkk. 2004, 2008a,b). Dalam penelitian terbaru pada model ikan zebra, paparan DEPe dilaporkan menyebabkan neurotoksisitas dan penurunan jumlah neuron secara signifikan dengan mengganggu autophagy (Barnhill et al. 2020).

DEPe mengandung banyak komponen beracun dari polusi udara dan umumnya digunakan untuk memodelkan paparan dalam sistem kultur sel (Costa et al. 2014; Hesterberg et al. 2010; Levesque et al. 2011b). Autophagy adalah mekanisme intraseluler yang penting untuk menghilangkan dan memberantas protein yang salah lipatan dan organel yang rusak.

Memang benar, aktivitas autophagic yang tepat diperlukan untuk homeostasis seluler, dan autophagy disfungsional pada neuron menyebabkan perubahan kelangsungan hidup dan degenerasi saraf (Kesidou dkk. 2013). Terdapat keterbatasan yang jelas dalam banyak penelitian ini, namun semuanya menunjukkan bahwa paparan polusi udara meningkatkan risiko DA dan PD. Pemahaman kita mengenai mekanisme bagaimana polusi meningkatkan risiko ini masih terbatas, namun partikel ultrahalus dan beberapa komponen polusi udara dapat masuk ke otak baik secara langsung melalui bulbus olfaktorius atau melalui paru-paru melalui aliran darah (Kilian dan Kitazawa 2018).

Partikel-partikel ini terdiri dari inti karbon dan senyawa yang teradsorpsi seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, logam, nitrat, sulfat, dan unsur-unsur lainnya dan merupakan sebagian besar polutan udara, terutama di daerah perkotaan. Banyak dari senyawa ini terlibat dalam stres inoksidatif dan seluler. toksisitas menambah masuk akal pada hubungan sebab akibat dari polusi udara dan degenerasi saraf.

Investigasi multidisiplin yang terperinci, termasuk model seluler dan hewan, dapat memberikan wawasan tentang penyebab penyakit dan mengarahkan pendekatan terapeutik di masa depan (Cannon dan Greenamyre 2011). Di antara organisme model yang digunakan untuk penelitian in vivo, Danio rerio (ikan zebra) adalah model yang kuat untuk mempelajari toksikologi, genetika molekuler, toksikogenomik, dan penemuan obat.

Sebagian besar jalur biologis sangat terkonservasi pada vertebrata, dan sebagian besar gen fungsional manusia memiliki homolog pada ikan zebra (Vaz et al.2018). Selain itu, embrio ikan zebra berkembang dengan cepat dan mandiri, sehingga memungkinkan dilakukannya analisis pada setiap tahap perkembangan yang diinginkan. Ciri-ciri ini, ditambah dengan reproduksi yang cepat dan biaya peternakan yang rendah, menjadikan ikan zebra sebagai model yang baik untuk mempelajari dampak racun dari paparan lingkungan.

Untuk lebih memahami mekanisme molekuler di balik patogenesis penyakit ini, berbagai pendekatan profil ekspresi gen dengan throughput tinggi telah dikembangkan. Proteomik berbasis spektrometri massa dan sekuensing RNA throughput tinggi memberikan harapan khusus dalam mengidentifikasi jalur biologis yang diminati. Teknik-teknik ini telah banyak digunakan untuk memahami respons model seluler dan hewan terhadap rangsangan lingkungan (Duan et al. 2017; García-Estrada et al. 2013; Jamiet al. 2014a, b, 2015; Kosalková et al. 2012).

Dalam penelitian ini, kami telah melakukan analisis ekspresi efek pengobatan DEPe pada profil proteom dan transkriptome di dalam kepala embrio ikan zebra. Isolasi sampel dari kepala yang sebagian besar terdiri dari jaringan otak memungkinkan diperolehnya profil jaringan yang lebih spesifik dan meminimalkan efek yang berasal dari jaringan lain. Kami menjelaskan di sini perubahan ekspresi gen dan profil protein di beberapa jalur yang terlibat dalam degenerasi saraf di kepala ikan zebra yang terpajan DEPe. Hasil ini memberikan wawasan baru mengenai mekanisme yang memungkinkan polusi udara meningkatkan risiko AD dan PD.

Bahan dan metode

Perawatan ikan dan geneknockdown yang dimediasi CRISPR/Cas9-

Semua penelitian disetujui oleh Komite Hak Hewan UCLA. Ikan zebra (AB) dikembangbiakkan dengan rangsangan cahaya selama 1 jam, dan sejumlah 200 butir telur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 derajat. Embrio yang dihasilkan didekorionasi dalam pronase (2 mg/ml) dan diberi perlakuan dengan DEPe (Bahan Referensi Standar, NIST, Gaithersburg, MD) pada konsentrasi akhir 20 ug/ml atau kendaraan hingga 5 hari pasca-fertilisasi (DPF).

Konsentrasi ini dipilih karena mengakibatkan hilangnya neuron seperti yang dilaporkan sebelumnya tetapi tanpa kematian yang signifikan (Barnhillet al. 2020). Ikan knockdown Cyp1A disiapkan sebagai berikut. Menggunakan alat yang tersedia di http://crispr.mit.edu, CRISPR RNA (Cyp1A-crRNA ) dirancang berdasarkan lokasi situs PAM yang sesuai pada ekson pertama gen Cyp1A.

Desain terbaik dibeli dari DNA IDT (www.idtdna.com) bersama dengan tracrRNA CRISPR-Cas9 standar. CrRNA untuk Cyp1Agene dan tracrRNA secara terpisah diresuspensi dalam 10 mM Tris-EDTA untuk menghasilkan konsentrasi akhir 100 μM. Kemudian, tracrRNA dikombinasikan dengan crRNA dalam 1×duplex buffer (100 mM potasium asetat; 30 mM HEPES, pH 7,5; IDT DNA) untuk menghasilkan konsentrasi akhir 10 μM. Campuran dipanaskan hingga 95 derajat selama 5 menit dalam penangas air mendidih dan perlahan-lahan didinginkan hingga suhu kamar untuk memungkinkan anil rangkaian nukleotida komplementer incrRNA dan tracrRNA dan pembentukan RNA pemandu fungsional (gRNA).

Volume 3 μL gRNA anil kemudian digabungkan dengan volume yang sama dari DNA untai tunggal donor (ssDNA; 200 μM) sebagai urutan templat untuk Cyp1A mutan. Sejumlah 3 ug Cas9 Nuclease (IDT) dalam 1× buffer injeksi (5 mM KCl; 0,1 M natrium fosfat, pH 6,8) ditambahkan ke dalam campuran untuk membentuk kompleks akhir CRISPR/Cas9ribonucleoprotein (Cyp1A-RNP).

Untuk persiapan Scramble RNP (SC-RNP), Cyp1A-crRNA spesifik digantikan oleh Scramble-crRNA komersial tanpa target pada genom. Urutan semua oligonukleotida yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel Tambahan 1. Telur disuntikkan di bawah mikroskop stereo dengan sekitar 3 nL campuran injeksi RNP.

Lima suntikan ulangan biologis (setiap ulangan termasuk 400-600 telur yang disuntik dengan Cyp1A-RNP dan 100-200 disuntik dengan SC-RNP) dilakukan, dan semua suntikan mikro diselesaikan dalam waktu 60 menit. Telur ditempatkan ke dalam cawan Petri plastik 100 mm dan diinkubasi pada suhu 28 derajat dalam air telur. Tingkat kelangsungan hidup embrio dipantau hingga 7 hari.

Gambar ikan yang masih hidup ditinjau untuk menilai malformasi. Setiap larva diberi skor secara buta untuk mengetahui adanya 4 malformasi perkembangan termasuk malformasi kepala, malformasi ekor, edema jantung, dan edema kuning telur. Larva dengan keempat malformasi tersebut akan diberi skor 4, sedangkan larva yang berkembang normal akan diberi skor 0. Uji statistik T-test digunakan untuk mengevaluasi perbedaan yang signifikan.

For more information:1950477648nn@gmail.com