Konjugat Dendrimer–tesaglitazar Menginduksi Pergeseran Fenotip Mikroglia Dan Meningkatkan Fagositosis -amiloid† Bagian 1

Mengubah mikroglia dari keadaan 'pro-inflamasi' yang memperburuk penyakit menjadi fenotip 'anti-inflamasi' yang bersifat neuroprotektif adalah strategi yang menjanjikan untuk mengatasi berbagai penyakit neurodegeneratif.

Mikroglia adalah sejenis sel di sistem saraf pusat yang terutama bertanggung jawab untuk menjaga kesehatan dan fungsi neuron. Mereka dapat mengeluarkan berbagai faktor pertumbuhan dan faktor neurotropik dan dapat mempertahankan aktivitas metabolisme normal neuron dengan membersihkan bahan limbah di sekitar neuron. Penelitian dalam beberapa tahun terakhir menunjukkan bahwa mikroglia berkaitan erat dengan memori. Mari kita lihat bersama-sama.

Pertama, mikroglia dapat menstimulasi neuron dan mendorong aktivasi neuron, sehingga meningkatkan daya ingat. Dengan melepaskan serangkaian neurotransmitter, seperti glutamat dan alanin, mikroglia dapat meningkatkan transmisi sinyal antar neuron dan dapat meningkatkan resonansi sinyal glial-neuron antara membran prasinaps, yang selanjutnya meningkatkan rangsangan saraf dan pembentukan memori.

Kedua, mikroglia juga dapat membersihkan limbah di sekitar neuron, menjaga aktivitas metabolisme normal neuron, dan mengurangi kematian neuron, sehingga mendorong peningkatan daya ingat. Ketika terlalu banyak sampah menumpuk di sekitar neuron, hal itu akan mempengaruhi aktivitas metabolisme normal neuron, menyebabkan kematian neuron dan melemahnya fungsi, sehingga menurunkan kinerja memori. Mikroglia dapat menjaga lingkungan metabolisme normal neuron dan mengurangi kematian neuron dengan menelan dan menguraikan limbah di sekitarnya, sehingga meningkatkan daya ingat.

Singkatnya, mikroglia berkaitan erat dengan memori. Dengan meningkatkan eksitasi neuron dan membersihkan limbah di sekitarnya, mikroglia dapat lebih meningkatkan daya ingat dan menjaga otak kita tetap sehat dan aktif. Kita harus memperhatikan perlindungan kesehatan mikroglia untuk mencapai daya ingat yang lebih baik. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat Cistanche berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam tanat, polisakarida, glikosida flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak dalam berbagai cara.

Klik tahu 10 cara meningkatkan daya ingat

Mikroglia proinflamasi berkontribusi terhadap perkembangan penyakit dengan melepaskan zat neurotoksik dan mempercepat akumulasi protein patogen. PPAR dan agonis PPAR keduanya telah terbukti mengubah mikroglia dari fenotip pro-inflamasi ('M1-like') menjadi fenotip alternatif yang diaktifkan ('M2-like'). Strategi tersebut telah dieksplorasi dalam uji klinis untuk penyakit neurologis, seperti penyakit Alzheimer dan Parkinson, namun kemungkinan besar gagal karena penetrasi penghalang darah-otak (BBB) ​​yang buruk.

Dendrimer poliamidoamin yang diakhiri hidroksil (tanpa pengikatan ligan penargetan apa pun) telah terbukti melewati BBB yang terganggu di lokasi peradangan saraf dan terakumulasi dalam mikroglia yang teraktivasi.

Oleh karena itu, konjugasi dendrimer dari PPAR / agonis ganda dapat memungkinkan peralihan fenotip yang ditargetkan dari mikroglia teraktivasi. Di sini kami menyajikan sintesis dan karakterisasi konjugat dendrimer-PPAR / agonis ganda (D-tesaglitazar) baru.

Secara in vitro, D-tesaglitazar menginduksi pergeseran fenotipe 'M1 ke M2', menurunkan sekresi spesies oksigen reaktif, meningkatkan ekspresi gen untuk fagositosis dan degradasi enzimatik protein patogen (misalnya -amiloid, -sinuklein), dan meningkatkan fagositosis -amiloid.

Hasil ini mendukung pengembangan lebih lanjut D-tesaglitazar menuju penerjemahan untuk berbagai penyakit neurodegeneratif, terutama Penyakit Alzheimer dan Parkinson.

Perkenalan

Di Amerika Serikat saja, saat ini terdapat lebih dari 5,3 juta orang dengan penyakit Alzheimer (AD) dan 1 juta orang dengan penyakit Parkinson (PD).1 Karena bertambahnya usia merupakan faktor risiko terbesar bagi banyak penyakit neurodegeneratif, maka prevalensi dan biaya pengobatan untuk penyakit-penyakit ini juga meningkat. akan terus meningkat seiring bertambahnya usia penduduk.

Selain itu, kurangnya keberhasilan baru-baru ini dalam mengembangkan obat baru untuk mengobati penyakit-penyakit ini telah menyoroti perlunya pengembangan terapi inovatif.2,3 Kegagalan klinis ini menyoroti kesulitan dalam mengembangkan suatu obat, termasuk memberikan konsentrasi obat yang cukup tinggi ke otak untuk mendapatkan kemanjuran tanpa adanya obat-obatan tersebut. menyebabkan efek samping yang merugikan.

Penyakit neurodegeneratif seperti AD dan PD memiliki tiga komponen neuropatologis utama: peradangan saraf, akumulasi protein patogen, dan kematian neuron.4–7 Pada orang sehat, sel imun bawaan otak (themicroglia) terus-menerus memfagosit protein yang salah lipatannya (misalnya -amyloid, -synuclein ) yang menyebabkan kematian neuron saat diproduksi, sehingga mencegah pembentukan agregat khas.

Namun, pada orang yang akhirnya mengembangkan penyakit neurodegeneratif, mikroglia tidak lagi menghilangkan protein ini secara efektif dan berubah menjadi fenotip proinflamasi yang memperburuk penyakit (biasanya disebut sebagai M1).

Meskipun klasifikasi aktivasi mikroglial yang didominasi pro-inflamasi/anti-inflamasi (M1/M2) merupakan penyederhanaan spektrum polarisasi makrofag yang berlebihan, klasifikasi ini masih digunakan sebagai nomenklatur yang luas untuk menggambarkan fenotip mikroglia yang dominan dalam peradangan saraf dan respons terhadap terapi.

Mikroglia mirip M1-melepaskan spesies oksigen reaktif dan mediator inflamasi lainnya yang menginduksi kematian neuron dan memperburuk patologi penyakit dengan meningkatkan produksi protein patogen (misalnya -amiloid, -sinuklein).

Selain itu, faktor risiko genetik utama untuk pengembangan AD (TREM2 dan APOE) diekspresikan pada tingkat mikroglia yang tinggi, dan jalur TREM2/APOE telah terbukti menyebabkan pergeseran fenotip amikroglia pada AD, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), dan multiple sclerosis. model binatang.8

Temuan ini lebih lanjut menunjukkan peran mikroglia dalam patologi berbagai penyakit neurodegeneratif manusia. Pendekatan untuk memanipulasi fenotipe mikroglia akan memungkinkan para peneliti memahami perannya dalam penyakit neurodegeneratif, selain berpotensi menjadi terapi yang efektif.

Pengalihan mikroglia dari fenotip M1 ke anti-inflamasi dan neuroprotektif (M2) telah diusulkan sebagai strategi terapi untuk mengobati berbagai penyakit neurodegeneratif.5,6 Dua agonis PPAR yang saat ini disetujui FDA, obat diabetes tipe II rosiglitazone dan pioglitazone, telah terbukti menginduksi efek samping. Pergeseran fenotip M1 ke M2 pada makrofag dan mikroglia in vitro dan in vivo.

9,10 Agonis PPAR telah terbukti mengurangi sekresi spesies oksigen reaktif yang diinduksi LPS dengan mengurangi aktivitas NF-κB dengan menginduksi degradasi dan ekspor NF-κB dari nukleus, serta transrepresi yang bergantung pada ligan.11

Selain itu, penelitian epidemiologi menunjukkan bahwa pasien diabetes yang memakai rosiglitazone atau pioglitazone mempunyai risiko lebih rendah untuk mengembangkan AD dan PD.12 Selanjutnya, rosiglitazone dan pioglitazone diselidiki melalui uji klinis fase III untuk DA, namun gagal.13

Salah satu penjelasan yang mungkin atas kegagalan uji klinis yang disebutkan di atas adalah buruknya transportasi obat-obatan ini melintasi sawar darah-otak (BBB), sehingga membatasi jumlah obat yang mencapai otak pasien yang terdaftar dalam uji klinis ini.14

Memang benar, diperkirakan bahwa BBB mencegah sekitar 98% dari semua obat bermolekul kecil mencapai otak, dan hanya sebagian kecil obat yang masuk ke otak mencapai mikroglia.15

Selain itu, PPAR merupakan reseptor nuklir lain dalam keluarga PPAR.16 PPAR berperan dalam homeostasis lipid dan mengatur peradangan, dan agonis PPAR juga telah terbukti menunjukkan efek anti-inflamasi pada mikroglia.

Studi klinis menggunakan neuroimaging, analisis jaringan post-mortem, dan biomarker CSF telah memberikan bukti bahwa BBB terganggu pada AD dan PD, serta penyakit neurodegeneratif lainnya.

17 Dendrimer generasi-4 poliamidoamin terminasi hidroksil (G4-PAMAM-OH) telah terbukti secara intrinsik memotong BBB yang terganggu dan terakumulasi dalam mikroglia teraktivasi tanpa memerlukan ligan penargetan, setelah pemberian sistemik dalam berbagai model penyakit peradangan saraf , termasuk pada hewan pengerat, kelinci, anjing, dan primata bukan manusia.18–28 Secara signifikan, G4-PAMAM-OH dapat diberikan secara sistemik dan melewati BBB pada model penyakit dengan gangguan BBB ringan seperti Sindrom Rett.29

Selain itu, tingkat penyerapan G4-PAMAM-OH ke dalam otak berbanding lurus dengan tingkat keparahan penyakit pada model kelinci Cerebral Palsy.30 Dendrimer yang diakhiri dengan hidroksil memiliki keuntungan karena diberikan secara non-invasif dibandingkan dengan pengiriman lokal yang sangat invasif melalui tengkorak yang diperlukan dalam penelitian sebelumnya dengan nanopartikel lain seperti poli-εkaprolakton dan PEG, dendrimer PAMAM bermuatan negatif, titik kuantum, dan formulasi nano yang terdiri dari polietilenimin (PEI) dan dekstran sulfat.31–35

Selain itu, dendrimer hidroksil PAMAM ini memiliki posisi yang ideal untuk penerjemahan karena skalabilitasnya dan profil keamanan in vivo yang dapat ditoleransi dengan baik.36–38 Karena data kemanjuran praklinis yang positif, (G4-PAMAM-OH)-N- konjugat asetil-sistein saat ini sedang dievaluasi dalam uji klinis awal untuk adrenoleukodistrofi serebral masa kanak-kanak (NCT03500627) dan peradangan terkait penyakit virus corona yang parah2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Kami mempelajari konjugat dendrimer-obat tesaglitazar(Tesa) yang melekat pada generasi-4 PAMAMdendrimer yang diakhiri hidroksil. Tesaglitazar adalah PPAR / agonis ganda yang kuat yang menggabungkan efek menguntungkan dari PPAR dan agonis PPAR. Ini mengandung gugus fungsi asam karboksilat untuk konjugasi kovalen ke dendrimer dan untuk pelepasan selanjutnya.

Gitar tambahan telah dikembangkan dan diuji secara klinis, namun Tesa dipilih karena rasio aktivitas PPAR terhadap PPAR yang lebih besar, struktur kimia yang relatif sederhana, dan profil keamanannya.39–43

Tesa sebelumnya telah mencapai uji klinis fase III untuk diabetes tipe 2 di Amerika Serikat tetapi gagal karena toksisitas yang bergantung pada dosis, yang dapat dicegah dengan mengurangi dosis pemberian yang diperlukan dengan pengiriman dendrimer terkontrol.39,40,44Karena Tesa adalah tesa PPAR / agonis ganda, pengiriman yang ditargetkan ke mikroglia teraktivasi di lokasi peradangan saraf bisa sangat bermanfaat.

Di sini, kami mendemonstrasikan sintesis dan karakterisasi konjugat dendrimer-tesaglitazar (D-Tesa) dan menunjukkan kemampuan senyawa ini untuk menginduksi perubahan fenotip 'M1 ke M2' dalam mikroglia dan meningkatkan fagositosis yang diberi label fluoresensi -amiloid.

Bahan dan metode

Bahan

1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-etil karbodiimida methiodida(EDC), 4(dimetilamino)piridin (DMAP), CuSO4·5H2O,natrium askorbat, asam heksinoat, dan albumin serum sapi (BSA) dibeli dari Sigma Aldrich US dan digunakan sebagai diterima (St Louis, MO).

Tesaglitazar diperoleh dari AstaTech Inc. (Bristol, PA). Dendrimer PAMAM inti etilendiamin (generasi 4 dengan 64 gugus akhir hidroksil) diterima dari Dendritech Inc. (Midland, MI) sebagai larutan dalam metanol.

Dendrimer disimpan dalam metanol pada suhu 4 derajat dan metanol diuapkan sebelum digunakan. Membran dialisis dengan batas berat molekul (MWCO) 1 kDa dibeli dari Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Semua pelarut lain digunakan dalam bentuk anhidratnya. Semua reaksi, kecuali tembaga(I), reaksi klik sikloadisi alkyne-azide (CuAAC) yang dikatalisis, dilakukan dalam kondisi anhidrat dalam media organik dengan peralatan gelas yang dikeringkan dalam oven dengan nitrogen inert. suasana.

Untuk kultur sel: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovineserum (FBS), penisilin-streptomisin (P/S), 00,05% trypsin-EDTA, dan reagen MTT diperoleh dari Invitrogen(Carlsbad, CA , AS).

Reagen Griess diperoleh dari Promega (Madison, WI) dan TNF-ELISA diperoleh dari R&D Systems (Minneapolis, MN). Metanol tingkat analitik dibeli dari Sigma-Aldrich. Trypan blue diperoleh dari Corning (Manassas, VA, USA).

Prosedur sintesis konjugat D-Tesa
Tetraetilen glikol mono azida (2) disintesis menggunakan protokol yang diterbitkan sebelumnya.45

Sintesis dan pemurnian Tesa-TEG-azide (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) dilarutkan dalam 10 ml dimetilformamida (DMF). Ke dalam larutan yang diaduk ini, tetrametilen glikol mono-azida (2, 662,1 mg, 3,02 mmol) dalam DMF (1 ml) ditambahkan tetes demi tetes. DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) dan EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) kemudian ditambahkan ke dalam campuran reaksi, dan reaksi diaduk dengan pembersih nitrogen pada suhu kamar selama 24 jam.

Reaksi dipantau menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Campuran reaksi diencerkan dengan 100 ml diklorometana (DCM) dan campuran reaksi kasar dipindahkan ke corong pemisah, dan lapisan organik selanjutnya dicuci tiga kali dengan larutan natrium bikarbonat jenuh, diikuti dengan larutan amonium klorida jenuh dan terakhir dengan air garam.

Lapisan organik kemudian dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat. Pelarut pada lapisan organik kemudian dihilangkan dengan menggunakan rotary evaporator, dan larutan dilarutkan kembali dalam 3 ml DCM dan diserap ke dalam silika gel untuk dimurnikan dengan sistem kromatografi CombiFlash® menggunakan metode gradien dengan etil asetat/heksana sebagai pelarut sehingga menghasilkan 3 sebening kristal. -minyak kuning.

Produk murni yang diinginkan dielusi pada sekitar 30–40% etil asetat. (Hasil: 70%.) 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.15(d, J=1.9 Hz, 2H), 7.08 (d, J=8.6 Hz, 2H), 6.73 (d, J=8.6 Hz,2H), 4.25–4.14 (m, 2H), 4.07 (t, J {{ 33}}.8 Hz, 2H), 3,94 (hh, J =7.8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (hh, J=8.7 , 3,8 Hz,2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6.7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H),1,08 (t, J=7 .0 Hz, 3H).ESI-MS: teoritis C28H39N3O10S: 609.24, diperoleh (M + 1):610.13.

Sintesis dan pemurnian D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmol) ditambahkan ke larutan aduk G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmol) dalam 20 ml DMF anhidrat. Ke dalam campuran ini, DMAP (430 mg, 3,52 mmol) dan EDC (1 g, 5,28 mmol) ditambahkan.

Campuran reaksi diaduk dengan pembersih nitrogen selama 24 jam pada suhu kamar. Setelah reaksi selesai, campuran reaksi dipindahkan ke tabung dialisis 1000 MWCO. Dialisis DMF dilakukan selama 24 jam, dan DMF diganti setiap enam jam.

Kemudian dialisis dengan air deionisasi (DI) dilakukan selama 24 jam, dan air diganti setiap enam jam. Terakhir, isi tabung dialisis yang dihasilkan diliofilisasi selama 48 jam, menghasilkan bubuk putih halus. (Hasil: 61%.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, dendrimerinternal amide H), 4,72 (s, permukaan dendrimer OH), 4,01 (t,ester –CH2), 3,32 (m, dendrimer –CH2), 3,06 (m, dendrimerand linker –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimer –CH2), 2,56–1,89(m, dendrimer dan linker –CH2), 1.78–1.61 (m, linker –CH2).Sintesis dan pemurnian D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azide (3,177.8 mg, 0.3{{10}}3 mmol) ditambahkan ke dalam campuran pengaduk D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) dalam 5 ml campuran tetrahidrofuran (THF) 1:1 dan air dengan 0,5 ml DMF dalam botol 20 ml yang aman untuk reaktor microwave. Untuk reaksi klik CuAAC, tembaga sulfat pentahidrat (11,6 mg, 0,0467 mmol) dan (+)-natrium-Laskorbat (9,3 mg, 0,0467 mmol) ditambahkan ke dalam campuran reaksi.

Botol ditutup rapat, dan bejana reaksi kemudian ditempatkan dalam reaktor gelombang mikro Biotage® Initiator dan direaksikan di bawah radiasi gelombang mikro 20 W sambil diaduk selama 8 jam pada suhu 50 derajat. Campuran reaksi dipindahkan ke tabung dialisis 1000 MWCO, dan dialisis DMF dilakukan selama 24 jam, dengan DMF diganti dengan pelarut segar kira-kira setiap 4 jam.

Kemudian, isi tabung dialisis dipindahkan ke tabung afalcon, dan ditambahkan air DI sejumlah setara. Selain itu, 200 μl larutan garam dinatrium asam etilendiamintetraasetat ditambahkan ke dalam isi tabung falcon.

Campuran ini kemudian dimasukkan ke dalam tabung dialisis 1000 MWCO yang baru, dan dilakukan dialisis selama 12 jam dalam 1000 ml air DI yang ditambah larutan EDTA dilanjutkan dengan dialisis air selama 12 jam.

Campuran tersebut kemudian diliofilisasi selama 48 jam dan menghasilkan bubuk berwarna putih halus. (Hasil: 64%.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrimer internalamide H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa dan linker H), 3,70 (m, Tesa dan linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimer –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimer–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimer dan linker –CH2), 2,25 (m, dendrimer –CH2) , 1,82–1,67 (m, penghubung –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Teknik karakterisasi

Resonansi magnetik nuklir (NMR). Spektrum NMR direkam pada spektrometer Bruker 500 MHz pada suhu kamar. Pergeseran kimia proton (δ) dilaporkan dalam ppm.

1H NMR digunakan untuk menentukan jumlah molekul Tesa yang menempel pada setiap molekul D-Tesa dengan metode integrasi proton, yaitu dengan membandingkan puncak proton tengah internal dendrimer pada δ 7,6–8,2 ppm dengan proton aromatik Tesa pada δ 7,36–6,76 ppm dan proton metil dari Tesa di wilayah alifatik. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) yang dilengkapi dengan pompa biner a1525, AF degasser In-Line, autosampler 717 plus, detektor susunan fotodioda 2998, dan detektor multifluoresensi 2475 yang dihubungkan dengan perangkat lunak Waters Empower digunakan.

Kolom fase terbalik Symmetry C18 (Tosoh, Jepang) yang memiliki ukuran partikel 5 μm, panjang 25 cm, dan diameter internal 4,6 mm digunakan. Senyawa dipantau pada 210 nm dan 254 nm menggunakan detektor PDA.

Pelarut A adalah air tingkat HPLC dengan 0.1% asam trifluoroasetat (TFA), dan pelarut B adalah asetonitril (ACN) dengan 5% air dan 0.1% TFA. Metode yang digunakan dimulai pada 1{ {7}}0 : 0 (ACN: air), turun menjadi 10:90 (air: ACN) dalam 5 menit, tetap pada polaritas tersebut selama 15 menit, dan kembali ke 100 : 0 (ACN: air) dalam 5 menit. Laju aliran dipertahankan pada 1 ml min−1. Spektroskopi massa.

ESI-MS dilakukan pada spektrometer massa BrukermicroTOF-II menggunakan asetonitril/air (9:1) sebagai sistem pelarut. Ion molekul sebagai puncak terprotonasi [M + nH]n+ atau hasil tambahan [M + nX]n+ (X=Na, K, atau NH4) digunakan untuk mengkonfirmasi rumus empiris.

Hamburan cahaya dinamis dan potensi ζ. Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, UK) yang dilengkapi dengan laser He–Ne 50 mW (633 nm) digunakan untuk menentukan ukuran partikel dan distribusi potensial ζ. D-Tesa dilarutkan dalam air DI hingga konsentrasi 0,2 mg ml−1 untuk DLS dan dalam 10 mM natrium klorida hingga konsentrasi 0,1 mg ml−1 untuk potensialζ.

Pengukuran dilakukan pada 25 derajat, menggunakan sudut hamburan 173 derajat seperti yang dijelaskan sebelumnya.27,46Studi pelepasan obat. D-Tesa dilarutkan pada konsentrasi 1 mg ml−1 dalam larutan buffer fosfat (pH 7,4) untuk meniru kondisi plasma atau larutan natrium sitrat (pH 5,5) untuk meniru kondisi lisosom.

Esterase dari hati babi (dari Sigma Aldrich) ditambahkan ke larutan natrium sitrat pada awal studi pelepasan dan diisi ulang kira-kira setiap 3 hari selama penelitian.

Setiap botol berisi 15 ml sampel dan terus dikocok pada suhu 37 derajat selama percobaan. Pada titik waktu yang berbeda, duplikat 200 μl sampel dari masing-masing pH dikumpulkan dan aktivitas esterase kemudian padam dengan menambahkan 200 μl metanol. Sampel titik waktu nol jam berfungsi sebagai kontrol.

Sampel disimpan pada suhu -80 derajat untuk menghindari hidrolisis lebih lanjut. Sampel dianalisis lebih lanjut dengan HPLC dan area di bawah kurva (pada 210 nm) untuk puncak obat bebas dihitung. Area di bawah kurva dikorelasikan dengan jumlah obat yang dilepaskan dengan memanfaatkan kurva kalibrasi dimana konsentrasi Tesa bebas yang diketahui dijalankan pada HPLC pada 210 nm.

For more information:1950477648nn@gmail.com