Konjugat Dendrimer–tesaglitazar Menginduksi Pergeseran Fenotipe Mikroglia Dan Meningkatkan Fagositosis -amiloid† Bagian 2

Tes biologis in vitro

Kultur sel. Garis sel mikroglial murine BV2 diperoleh dari Fasilitas Kultur Sel Rumah Sakit Anak Michigan.

Dalam beberapa tahun terakhir, para ilmuwan telah menemukan bahwa kultur sel berkaitan erat dengan memori manusia. Penelitian telah menunjukkan bahwa melalui studi kultur sel, mekanisme molekuler dalam memori dan proses pembelajaran dapat ditemukan, sehingga meningkatkan kemampuan kognitif dan memori manusia.

Kultur sel mengacu pada proses penempatan sel biologis dalam media kultur yang mengandung nutrisi penting untuk tumbuh dan berkembang biak dalam kondisi in vitro. Sel adalah unit dasar kehidupan, dan kultur sel memberi para ilmuwan landasan untuk mempelajari perilaku sel dan aktivitas kehidupan. Melalui studi tentang sel, para ilmuwan telah menemukan banyak informasi tentang pertumbuhan neuron dan koneksi sinaptik. Temuan ini tidak hanya membantu manusia lebih memahami cara kerja otak tetapi juga membantu mengembangkan pengobatan dan obat-obatan baru.

Penelitian dalam beberapa tahun terakhir menunjukkan bahwa kultur sel juga berkaitan erat dengan memori manusia. Para ilmuwan telah menemukan bahwa pembentukan dan pemeliharaan memori manusia memerlukan banyak regulasi molekuler dan pengiriman sinyal. Mekanisme pengiriman dan pengaturan sinyal ini memiliki banyak kesamaan dengan mekanisme dalam kultur sel. Dengan mempelajari mekanisme pengiriman dan pengaturan sinyal dalam kultur sel, para ilmuwan dapat lebih memahami memori manusia dan mekanisme pembelajaran.

Selain itu, beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa kultur sel dapat meningkatkan daya ingat dan kemampuan belajar manusia dengan cara tertentu. Misalnya, dengan menggunakan metode yang disebut "stimulasi listrik", aktivitas sel dan hubungan antar neuron dapat distimulasi, sehingga meningkatkan kemampuan kognitif dan efek pembelajaran manusia. Meskipun metode ini masih dalam tahap penelitian laboratorium, namun diharapkan dapat menjadi metode pelatihan kognitif baru di masa depan.

Singkatnya, ada hubungan erat antara kultur sel dan memori manusia. Melalui studi tentang sel, kita dapat lebih memahami mekanisme kognitif manusia dan mekanisme memori serta membantu mengembangkan metode pengobatan baru dan metode pelatihan kognitif. Mari kita nantikan kontribusi teknologi kultur sel bagi umat manusia di masa depan! Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche memiliki efek antioksidan, anti inflamasi, dan anti penuaan, yang dapat membantu mengurangi reaksi oksidasi dan inflamasi di otak, sehingga melindungi kesehatan otak. sistem saraf. Selain itu, Cistanche juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf. Efek tersebut dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar, dan kecepatan berpikir, serta dapat mencegah terjadinya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik suplemen tahu untuk meningkatkan daya ingat

Sel BV2 dikultur dalam media Dulbecco's Modified EaglesMedium (DMEM) dengan 10% serum janin sapi yang dilemahkan dengan panas (HI FBS) dan 1% penisilin/streptomisin (P/S) pada suhu 37 derajat dan 5% CO2.

Setelah sel mencapai pertemuan dalam labu kultur, sel dimasukkan ke dalam labu baru menggunakan 00,05% trypsin–ethylenediamine tetra-acetic acid (EDTA). Untuk percobaan, sel BV2 diunggulkan dalam DMEM dengan 5% HIFBS dan 1% P/S. 24-48 jam kemudian, sel-sel distimulasi dengan 100 ng ml−1 (300 EU ml−1) LPS selama 3 jam untuk memungkinkan sel memasuki fenotip pro-inflamasi (M1) untuk mensimulasikan lingkungan inflamasi saraf yang terdapat pada banyak penyakit neurologis.

Sel-sel tersebut kemudian diolah bersama dengan LPS dan Tesa atau D-Tesa bebas pada konsentrasi yang bervariasi selama 48 tangan kemudian supernatan dan sel dikumpulkan untuk diproses. Sel yang tidak pernah diberi LPS (Tanpa LPS) dan sel yang hanya diberi LPS sepanjang waktu (khusus LPS) berfungsi sebagai kelompok kontrol. Larutan stok Tesa dan D-Tesa gratis disterilkan menggunakan filter poli(eter sulfon) 0.2 µm.

D-Tesa larut dalam media sel. Tesa dilarutkan dengan menggunakan dimetilsulfoksida (DMSO) pada konsentrasi akhir kurang dari 0,1% (v/v). Sitotoksisitas, uji oksida nitrat, dan TNF-ELISA. Untuk uji sitotoksisitas, sel diperlakukan seperti dijelaskan di atas dalam pelat sumur, dan kemudian sitotoksisitas Tesa dan D-Tesa bebas dinilai dengan uji MTT mengikuti instruksi dari pabriknya.

Untuk pengujian oksida nitrat, sel diperlakukan seperti dijelaskan di atas dalam 12-pelat sumur, lalu supernatan dari sel yang diberi perlakuan dikumpulkan dan kadar oksida nitrat segera diukur dengan mengikuti protokol pabrikan untuk Reagen Griess.

Untuk TNF-ELISA, sel diperlakukan seperti dijelaskan di atas dalam 12-pelat sumur, lalu supernatan dari sel yang diberi perlakuan dikumpulkan dan disimpan pada suhu −80 derajat hingga siap untuk diproses lebih lanjut.

Kemudian sampel dicairkan di atas es dan TNF-ELISA dijalankan dengan mengikuti protokol pabrikan. Untuk penelitian ini, baik D-Tesa maupun Tesa bebas disonikasi dan divorteks hingga keduanya larut sempurna. Untuk melarutkan Tesa bebas terlebih dahulu dilarutkan dalam DMSO sebelum diencerkan, dimana konsentrasi akhir DMSO dibawah 0.1%(v/v) untuk seluruh sampel Tesa bebas.

Karena D-Tesa larut dalam media kultur sel, DMSO tidak ditambahkan ke sampel tersebut. Untuk semua penelitian in vitro, jumlah obat bebas atau terkonjugasi yang setara diterapkan pada sel dalam kelompok Tesa bebas dan D-Tesa.

PCR waktu nyata kuantitatif (qRT-PCR). Sel diperlakukan seperti dijelaskan di atas dalam 12-pelat sumur, dan setelah mengumpulkan supernatan, sel dikumpulkan dalam Reagen Invitrogen™ TRIzol™ (dari Fisher Scientific) dan RNA diekstraksi dengan mengikuti protokol pabrikan. Konsentrasi dan kemurnian RNA yang dihasilkan dianalisis menggunakan Nanodrop.

Jumlah RNA yang setara dari masing-masing sampel dikonversi menjadi cDNA dengan mengikuti protokol pabrikan untuk Kit Transkripsi Terbalik cDNA Berkapasitas Tinggi (dari Applied Biosystems oleh Thermo Fisher Scientific).

CDNA yang dihasilkan digunakan untuk analisis qRT-PCR menggunakan reagen hijau FAST-SYBR dan dengan mengikuti protokol pabrikan. Nilai Ct dihitung oleh mesin dan data dianalisis menggunakan metode 2−ΔΔCt.

Untuk setiap penanda yang berbeda, nilai ΔΔCt dihitung dengan mengurangkan ΔCt untuk kelompok Tanpa LPS dari ΔCt untuk setiap sampel. Nilai ΔCt adalah nilai Ct untuk gen yang diinginkan dikurangi Ct untuk GAPDH untuk setiap sampel yang diberikan.

Setelah 2−ΔΔCt dihitung untuk semua kelompok, semuanya kemudian dinormalisasi ke kelompok Tanpa LPS, sehingga memberikan tingkat ekspresi relatif kelompok Tanpa LPS sebesar 1.0 untuk semua penanda. Urutan primer maju dan mundur digunakan untuk qRT -PCR ditunjukkan pada tabel di bawah ini. Semua urutan ditulis dari 5′→3′.

Selain itu, primer yang tersedia secara komersial dibeli dari BIORAD untuk iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452),SOCS1 (qmmuced0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid0006 404), dan PPAR (qmmucid0018821). Uji fagositosis.

Dampak Tesa dan D-Tesa bebas terhadap fagositosis -amiloid ditentukan menggunakan metode yang dilaporkan sebelumnya.47 Secara singkat, Tepung HiLyte™ 488-berlabel -amyloid1–42 (dari Anaspec Inc.) dilarutkan dalam DMSO (konsentrasi akhir DMSO di bawah 0.5% (v/v)) dan diencerkan hingga 5 µg ml−1 dalam PBS.

Setelah merawat sel dengan Tesa dan D-Tesa dengan skema pengobatan yang diuraikan di atas, larutan -amiloid dioleskan ke sel selama 2 jam. Kemudian, sel-sel dicuci tiga kali dengan Hank's Balanced Salt Solution dengan kation divalen (kalsium dan magnesium), dikeluarkan dari sumur menggunakan trypsin, dan diresuspensi dalam buffer FACS (dari Invitrogen).

Sampel disimpan di dalam es, dan segera dijalankan pada mesin sitometri aliran Sony Cell Sorter SH800, dan data dianalisis dengan perangkat lunak terkait.

Gerbangnya diatur menggunakan sel yang tidak diberi fluoresensi -amiloid, dan hasil yang ditunjukkan adalah persentase sel dari masing-masing kelompok yang menunjukkan fluoresensi di atas fluoresensi latar belakang.

Intensitas fluoresen rata-rata (MFA) HiLyte™ 488-berlabel -amiloid juga dilaporkan untuk setiap kelompok. Pengujian ini dilakukan dalam rangkap dua. Statistik. Semua data yang ditampilkan adalah hasil dari tiga percobaan terpisah, masing-masing dilakukan dalam rangkap tiga kecuali dinyatakan lain. GraphPad Prism 5 dan Microsoft Excel digunakan untuk melakukan statistik.

Uji-t Student berpasangan dua sisi, dengan BonferroniCorrection, dilakukan. Tes Grubbs digunakan untuk menentukan outlier. GraphPad Prism 5 untuk Windows digunakan untuk memplot data (San Diego, CA). Data yang ditampilkan adalah rata-rata + SEM.

Hasil dan diskusi

Sintesis dan karakterisasi D-Tesa

Untuk memungkinkan pengiriman intraseluler yang ditargetkan ke sel mikroglial teraktivasi di otak, Tesa dikonjugasikan secara kovalen pada permukaan G4-PAMAM-OH dengan ikatan ester yang dapat dibelah antara obat dan penghubung dendrimer (Gbr. 1).

Pada langkah pertama, Tesa (1) direaksikan dengan tetrametilen glikol azida (TEG-azide)(2) untuk menghasilkan Tesa-TEG-azide (3), yang memiliki ikatan ester antara obat dan penghubung (Gbr. 1A).

HPLC senyawa (3) menunjukkan waktu retensi 13,4 menit dengan kemurnian lebih besar dari 99% (Gbr. S1B†). Spektrum massa (3) menunjukkan puncak pada 610,13 [M + 1]+ sesuai dengan berat molekul Tesa-TEG-azida yang selanjutnya mengkonfirmasi pembentukan produk (Gbr. S2†). Secara terpisah, dendrimer G4-PAMAM-OH (4) direaksikan dengan asam 5-heksinoat menggunakan reaksi esterifikasi untuk menghasilkan D-YNE (5) (Gbr. 1B).

Terakhir, Tesa-TEG-azide (3) dan D-YNE (5) direaksikan dengan reaksi klik sikloadisi tembaga-katalisazida-alkuna (CuAAC) yang sangat efisien untuk menghasilkan D-Tesa (6) (Gbr. 1B).48 NMR 1H mengkonfirmasi keberhasilan sintesis semua zat antara dan produk akhir; D-Tesa (6) berisi puncak karakteristik proton dendrimer dan penghubung obat yang menunjukkan keberhasilan sintesis D-Tesa (Gbr. 2A).

NMR konjugat D-Tesa akhir menunjukkan bahwa rata-rata sepuluh molekul Tesa terikat pada setiap dendrimer. HPLC mengkonfirmasi keberhasilan konjugasi kovalen, karena D-Tesa menunjukkan pergeseran dari D-YNE dan TesaTEG-azide (Gambar 2B dan S1†).

Tesa memiliki kelarutan dalam air yang buruk, diperkirakan sebesar 0,0035 mg mL−1,49 Konjugasi dendrimer onhidroksil Tesa meningkatkan kelarutan dalam air beberapa kali lipat dari perkiraan ini. D-Tesa memiliki kelarutan dalam air pada 22 mg mL−1, dan karena Tesa terdiri dari ∼19% massa D-Tesa, 4,2 mg ml−1 yang setara dengan Tesa dilarutkan (Gbr. 3A).

Peningkatan kelarutan yang diberikan oleh dendrimer meningkatkan kemudahan formulasi dan menghilangkan kebutuhan akan eksipien yang berpotensi toksik.50 Semua manfaat ini merupakan tambahan dari kemampuan unggul dendrimer dalam mengantarkan obat bebas melintasi BBB ke mikroglia in vivo, dan berpotensi mengurangi dosis diperlukan untuk mencapai efek terapeutik.18–28 Terakhir, D-Tesa memiliki ukuran rata-rata 7,75 ± 0,29 nm (Gbr. S3†), dan potensi zeta sebesar 2.86 ± 0,38 mV (N=5 dan N=3 pengukuran masing-masing).

Pelepasan obat

Kami merancang D-Tesa untuk melepaskan Tesa secara intraseluler dalam lingkungan pH rendah dan konsentrasi esterase tinggi di endosom/lisosom mikroglia teraktivasi. Kami sebelumnya telah melaporkan bahwa dendrimer PAMAM terutama memasuki sel melalui endositosis fase cairan, dan vesikel yang mengandung konjugat berubah menjadi lisosom.51

Kami menginkubasi D-Tesa pada suhu 37 derajat dalam buffer natrium sitrat (pH 5,5) dengan adanya esterase untuk meniru kondisi lisosom, seperti yang dilakukan sebelumnya.52–54 Kami juga menyelidiki pelepasan dalam kondisi yang meniru kondisi plasma (phosphate-buffered saline [PBS] ] penyangga, pH 7,4).

Dalam kondisi plasma, hanya sekitar 1,5% Tesa dilepaskan setelah 48 jam, dan kurang dari 20% Tesa dilepaskan pada hari ke 25 menunjukkan stabilitas plasma konjugat (Gambar 3B).

Dalam kondisi lisosom, sekitar 60% Tesa dilepaskan dari D-Tesa dalam 48 jam pertama, dan dalam waktu 19 hari, hampir 100% Tesa dilepaskan. Hasil ini menunjukkan bahwa D-Tesa memberikan pelepasan obat bebas yang berkelanjutan dan terpicu selama dua minggu pertama yang diinkubasi dalam kondisi lisosom yang relevan secara fisiologis.

Selain itu, pelepasan minimal Tesa dalam kondisi plasma simulasi (kelompok pH 7,4) selama 48 jam pertama adalah signifikan, karena ini adalah waktu sirkulasi G4-PAMAM-OH yang khas sebelum pembersihan ginjal, sehingga Tesa yang sangat minimal kemungkinan akan dilepaskan dari konjugasi sebelum mereka mencapai mikroglia.24

D-Tesa menurunkan ekspresi penanda M1 dan meningkatkan penanda M2

Untuk mengevaluasi kemampuan D-Tesa dalam menginduksi pergeseran fenotip M1 ke M2, kami mengevaluasi kemampuan D-Tesa untuk mengubah ekspresi penanda M1 dan M2 secara in vitro menggunakan garis sel mikroglial murine (BV2).

Sel BV2 diciptakan dengan mengabadikan sel mikroglial murine dan terbukti menjadi alternatif yang cocok untuk sel mikroglia primer untuk mempelajari respons peradangan mikroglial.55,56 Dalam percobaan kami, untuk meniru lingkungan peradangan saraf yang ada pada beberapa penyakit saraf, kami melakukan pra-perawatan pada mikroglia dengan 100 ng ml−1 (300 unit endotoksin (EU) per ml) LPS selama 3 jam.

Kemudian, kami melakukan perlakuan bersama terhadap sel tersebut dengan LPS dan membebaskan Tesa atau D-Tesa selama 48 jam, lalu mengumpulkan sampelnya. Kami memperlakukan sel pada konsentrasi Tesa atau D-Tesa bebas 1,5, 15, dan 150 µM, dengan basis obat yang setara.

Uji MTT menunjukkan bahwa Tesaor D-Tesa bebas pada konsentrasi ini tidak menyebabkan sitotoksisitas (Gbr. S4†). Studi pencarian dosis awal dilakukan dengan Tesa dan D-Tesa untuk menentukan dosis Tesa dan D-Tesa yang paling efektif.

Pengobatan dengan Tesa dan D-Tesad bebas 1,5 dan 15 µM tidak mengubah sekresi oksida nitrat atau TNF-, sebagaimana ditentukan masing-masing oleh Reagen Griess dan TNF-ELISA (Gbr. S5†). Berdasarkan hasil ini, kami tidak menganalisis konsentrasi yang lebih rendah ini dalam pengujian qRT-PCR kami.

Pada banyak penyakit neurodegeneratif, salah satu fungsi neurotoksik utama dari mikroglia M1 proinflamasi adalah sekresi spesies oksigen reaktif (misalnya oksida nitrat) yang secara langsung membunuh neuron.57,58 Selanjutnya, telah dipostulasikan bahwa salah satu strategi terapi potensial adalah dengan mengurangi sekresi molekul-molekul ini.

Kami mengevaluasi kemampuan D-Tesa untuk mencapai efek ini. Setelah stimulasi LPS, D-Tesa menurunkan kadar oksida nitrat yang disekresi dan nitric oxide synthase (iNOS) yang dapat diinduksi (iNOS) tingkat mRNA 3.7-lipat (p < 0.0001) dan 2-lipat (p {{ 7}}.011), masing-masing, dibandingkan dengan sel yang hanya diobati dengan LPS (hanya LPS) (Gambar 4A dan B).

Di sisi lain, Tesa bebas menurunkan oksida nitrat yang disekresikan secara lebih moderat (1.4-kali lipat, p=0.004) dan tidak menyebabkan penurunan signifikan pada ekspresi mRNA iNOS (Gbr. 4A dan B ).

D-Tesa jauh lebih efektif daripada Tesin bebas dalam menekan sekresi oksida nitrat. Selanjutnya, tergantung pada apakah mikroglia berada dalam fenotipe M1 atau M2, mikroglia meningkatkan regulasi iNOS atau Arginase 1 (Arg1) untuk memetabolisme L-arginin untuk menghasilkan oksida nitrat untuk respons pembunuhan patogen M1, orornitin dan urea untuk respons penyembuhan luka M2. 59

Konsisten dengan downregulasi iNOS, D-Tesain meningkatkan level mRNA Arg1 2-kali lipat (p=0.011) dibandingkan dengan kontrol khusus LPS, sedangkan Tesa gratis tidak meningkatkan ekspresi secara signifikan (p=0 .40) (Gbr. 4C).

D-Tesa, dan pada tingkat lebih rendah Tesa bebas, mengubah mikroglia dari melepaskan nitrikoksida sitotoksik menjadi memetabolisme L-arginin untuk penyembuhan luka, yang memiliki implikasi dalam mengurangi dan berpotensi membalikkan, neurotoksisitas yang disebabkan oleh mikroglia dalam degenerasi saraf.5–7,10

Penurunan regulasi iNOS dan kadar oksida nitrat yang disekresikan dengan pengobatan D-Tesa adalah berdasarkan penelitian sebelumnya yang menunjukkan ligan alami PPAR (15-deoksi-Δ12,14-prostaglandin J2) menurunkan ekspresi dan sekresi iNOS dan oksida nitrat pada LPS yang diberi perlakuan mikroglia primer.60

IL-10, IL-4, dan TGF- 1 semuanya merupakan sitokin yang disekresikan oleh mikroglia M2 yang diaktifkan secara alternatif yang dapat menginduksi lingkungan neuroprotektif dan antiinflamasi di otak.58,61,62Menuju Untuk tujuan ini, D-Tesa meningkatkan ekspresi IL-105.5-fold (p=0.011) dan IL-4 8.2-fold (p { {15}}.013) dibandingkan dengan kontrol hanya LPS (Gbr. 4D dan E).

Tesa gratis tidak meningkatkan kadar IL-10 atau IL-4 secara signifikan, meskipun rata-ratanya sebesar 1.7-kali lipat (p=0.066) dan 2.{{7} } lipat (p=0.11) masing-masing lebih tinggi untuk mikroglia yang diberi perlakuan Tesa dibandingkan dengan kontrol yang hanya menggunakan LPS (Gbr. 4D dan E). Selain itu, D-Tesain meningkatkan ekspresi TGF- 1 2.3-fold (p=0.015) dan Tesa bebas tidak mengubah ekspresi secara signifikan (Gbr. 4F).

Dengan demikian, D-Tesa menginduksi sekresi sitokin anti-inflamasi setelah pengobatan mikroglia dengan LPS, yang dapat mengurangi lingkungan pro-inflamasi neurotoksik yang terdapat pada penyakit neurodegeneratif.5–7,10

Ekspresi penanda subtipe M2-yang diinduksi D-Tesa

CD206, Ccl1, dan TLR8 masing-masing merupakan penanda khusus untuk subtipe mikroglia M2a, M2b, dan M2c.58 D-Tesa meningkatkan ekspresi CD206 4.{{10 }}fold (p < 0.001), Ccl1 3.5-fold (p < 0.005), dan TLR8 5-fold (p < 0.01), sedangkan Tesa gratis tidak meningkatkan ekspresi of salah satu dari tiga penanda ini (Gbr. 5A – C).

Data ini menunjukkan bahwa mikroglia yang diobati dengan D-Tesa menunjukkan peningkatan regulasi penanda ketiga subtipe M2 yang signifikan, yang sesuai dengan pemahaman bahwa fenotipe mikroglia adalah plastis dan bukan biner.63–65

Tata nama M1/M2 terlalu menyederhanakan kompleksitas mikroglia dalam spektrum keadaan aktivasi; sepanjang kontinum ini, tiga fenotipe M2 yang berbeda (M2a, M2b, dan M2c) telah dikarakterisasi, dan D-Tesa menginduksi ekspresi penanda yang konsisten dengan masing-masing keadaan ini.58,61,63,66,67 Mikroglia M2a terlibat dalam peningkatan fagositosis patogen protein dengan meningkatkan regulasi reseptor pemulung, perbaikan jaringan, dan tindakan anti-inflamasi.

Mikroglia M2b seperti mikroglia M1 yang mengekspresikan IL-1 , TNF- , dan IL-6; namun, M2b berbeda dari mikroglia M1 karena mereka mengekspresikan IL-10 pada tingkat tinggi dan menurunkan regulasi ekspresi iNOS. Makrofag M2b dan mikroglia menstimulasi sel T Th2, yang menunjukkan salah satu peran M2b dalam menginduksi respons anti-inflamasi.

Mikroglia M2c terlibat dalam penyembuhan luka, remodeling jaringan, penyerapan zat besi, dan aktivasi STAT3 yang mengurangi sinyal proinflamasi.58,61,63,66Aktivitas PPAR Tesa menstimulasi loop feedforward yang menghasilkan peningkatan ekspresi PPAR dan protein sinyal hulunya (STAT6), yang keduanya merupakan penanda M2a.58D-Tesa meningkatkan ekspresi PPAR 2.3-fold (p=0.0036)dan STAT6 3.4- kali lipat (p < 0,001), sedangkan Tesa gratis meningkatkanSTAT6 1.8-kali lipat (p=0.011) tanpa peningkatan ekspresi PPAR yang signifikan (1.58-peningkatan kali lipat, p=0.17) (Gbr. 5D dan E).

Peningkatan ekspresi STAT6 dan PPAR menghasilkan produksi gen antiinflamasi dan penghambatan sinyal proinflamasi dengan menghambat aktivitas NF-κB. Karena mikroglia M2a dapat diinduksi dengan memperlakukan mikroglia dengan IL-4, yang memberi sinyal melalui STAT6 dan PPAR, peningkatan regulasi kedua protein pemberi sinyal hilir ini dapat menghasilkan polarisasi M2a yang meneruskan umpan.68

Dalam pengujian kami, aktivasi LPS meningkatkan kadar IL-6, TNF-, dan IL-1, dan pengobatan dengan D-Tesa semakin meningkatkan regulasi ekspresi sitokin ini (Gambar S6A–D†), yang kemungkinan besar karena D-Tesa menginduksi fenotip M2b (Gbr. 5B).

Tes Gratis meningkatkan ekspresi IL-6 dan tidak mengubah ekspresi TNF- dan IL-1 secara signifikan (Gbr. S6A–D†). Meskipun sitokin ini disekresi oleh mikroglia M1, mikroglia M2b juga mengekspresikan sitokin ini.58,61 CD86 merupakan penanda mikroglia M1 dan M2b, dan meningkat dengan pengobatan D-Tesa (Gbr. S6E†).

Selain itu, penekan pensinyalan sitokin (SOCS) adalah keluarga protein intraseluler yang mengatur polarisasi fenotipik mikroglia dengan menekan beberapa jalur pensinyalan yang diaktifkan oleh sitokin.69 SOCS1 adalah salah satu anggota keluarga ini, dan telah terbukti menghambat LPS/TLR4 memediasi pensinyalan NF-κB dan JAK2, sehingga mengurangi jumlah TNF-, IL-1, dan IL-6 yang dilepaskan oleh mikroglia M1 melalui jalur LPS/TLR4.

D-Tesa meningkatkan regulasi ekspresi SOCS1 dibandingkan dengan kontrol hanya LPS (Gbr. S6F†), menunjukkan bahwa peningkatan IL-6, TNF- dan IL-1 yang ditunjukkan oleh D-Tesa mungkin disebabkan oleh induksi Fenotip M2b dan bukan melalui peningkatan fenotip penginduksi LPS/TLR4, M1-.

Selain itu, sinyal LPS melalui TLR4 dan untuk mencegah aktivasi seluler yang berlebihan, mikroglia memiliki mekanisme umpan balik negatif dimana aktivasi TLR4 menyebabkan penurunan ekspresi TLR4.70

Pengobatan dengan Tesa dan D-Tesa gratis meningkatkan level TLR4 masing-masing 3.6-kali lipat (p < 0.001) dan 3.7-kali lipat (p < 0,001) (Gbr. 5F), menunjukkan bahwa Tesa dan D-Tesa mengubah jalur sinyal umpan balik negatif LPS/TRL4 yang khas.

For more information:1950477648nn@gmail.com