Perakitan Transkriptome De Novo Dan Penemuan Gen Batang Berdaging Cistanche Deserticola-Ⅱ

Klasifikasi Fungsional Semua Transkrip Yang Dinyatakan Berdasarkan Ontologi Gen Dan Database KEGG

Anotasi Gene Ontology (GO) diperoleh dari anotasi UniProt dan file asosiasi identitas. Secara total, 20.907 transkrip, terhitung 32,69% dari total rangkaian yang diungkapkan, ditugaskan ke 1.745 istilah fungsional. Dari total istilah GO fungsional, penugasan pada proses biologis merupakan mayoritas (1.116, 63,95%) diikuti oleh komponen seluler (329, 18,85%) dan fungsi molekuler (300, 17,20%). Fungsi yang ditugaskan dari transkrip yang diungkapkan mencakup berbagai kategori GO, dan 10 istilah GO teratas dengan transkrip yang paling banyak dianotasi tercantum pada Tabel 3. Kami menyediakan semua distribusi transkrip yang diungkapkan dalam tiga kategori Ontologi Gen (Fungsi Molekuler, Komponen Seluler, dan Komponen Seluler). proses biologis) dalam file tambahan (Dataset S3). Istilah GO yang terkait dengan fungsi pengikatan dan aktivitas transferase sebagian besar terwakili dalam kategori fungsi molekuler. Mengenai fungsi pengikatan, pengikatan kation (4.394 transkrip) mewakili yang paling melimpah, diikuti oleh pengikatan nukleotida/nukleosida (rata-rata 3.404 transkrip) dan pengikatan protein (2.422 transkrip). Sedangkan pada kelompok aktivitas transferase terbanyak adalah kelompok dengan kelompok transfer yang mengandung fosfor (2.256 transkrip, 65,77%). Di antara kategori komponen seluler, transkrip lebih banyak berada di intraseluler (rata-rata 10.581 transkrip), sedangkan di antara kategori proses biologis, transkrip lebih banyak terlibat dalam proses metabolisme biopolimer (rata-rata 6.683 transkrip), diikuti oleh regulasi proses seluler (4.841 transkrip). ), ekspresi gen (4.678 transkrip) dan transportasi (3.512 transkrip).

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENCEGAH PENYAKIT ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Untuk menambang gen yang terlibat dalam biosintesis lignin dan PhG, 21.358 rangkaian protein potensial non-redundan dicari berdasarkan rangkaian gen dari 13 organisme tanaman di database KEGG, dan mereka ditugaskan ke 275 jalur KEGG dengan setidaknya 5 penemuan. 10 jalur teratas dengan urutan paling selaras tercantum pada Tabel 4. Sebagian besar jalur terlibat dalam proses metabolisme primer, seperti metabolisme asam amino atau protein (ko01230, ko04141, dan ko04120), metabolisme karbohidrat (ko01200 dan ko00500), dan nukleotida atau metabolisme nukleosida (ko03018, ko00230, dan ko00240). Selain itu, terdapat 27 jalur terkait metabolisme sekunder (Gambar 2), seperti biosintesis tulang punggung terpenoid, biosintesis fenilpropanoid, biosintesis karotenoid, biosintesis alkaloid isoquinoline, dan biosintesis alkaloid tropana, piperidin, dan piridin. Hasil ini memberikan indikasi lebih lanjut bahwa proses metabolisme aktif sedang berlangsung di dalam tubuhC.deserticolajaringan batang. Semua transkrip yang diungkapkan terkait dengan jalur KEGG dicantumkan dalam file tambahan (Dataset S4). Meskipun ada beberapa jalur yang berubah secara signifikan antara C. deserticola dan tanaman lain, seperti padi (Dataset S5), tujuan utama kami dalam penelitian ini adalah untuk mengungkap keseluruhan profil transkriptome batang C. deserticola dan untuk menggambarkan jalur terkait biosintesis PhGs. yang dapat berguna untuk membimbing budidaya.

Kandidat Gen Pengkode Enzim Yang Terlibat Dalam Biosintesis Lignin

Lignin adalah polimer terestrial alami kedua yang paling melimpah di dunia tumbuhan, menyusun sepertiga bahan yang ditemukan di dinding sel tumbuhan. Sebagai komponen penting dinding sel, lignin membantu transportasi air, memberikan dukungan mekanis dan integritas struktural, serta bertahan melawan patogen dan herbivora. Peran lignin tersebut sangat berharga dalam mendukung pertumbuhan tegak bawah tanah C. deserticola di gurun. Dalam penelitian ini, kami menyajikan gambaran lengkap jalur biosintesis lignin pada C. deserticola (Gambar 3), di mana monomer lignin dibiosintesis dari fenilalanin melalui serangkaian reaksi enzimatik, termasuk hidroksilasi, metilasi, reduksi, dan proses polimerisasi oksidatif. Enzim terkait biosintesis lignin terdeteksi untuk tiga bentuk sintesis utama dalam jaringan pembuluh darah (p-hidroksil-fenil (H), guaiacyl (G) dan syringyl (S) lignin) dan 5-hydroxyl-guaiacyl lignin yang hanya diidentifikasi pada tanaman yang kekurangan COMT (asam caffeic 3-O-methyltransferase, EC 2.1.1.68) (seperti knock-down).

Fenilalanin amonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) adalah enzim kunci pertama dalam jalur biosintesis lignin (Gambar 3) yang mengubah fenilalanin menjadi asam sinamat melalui deaminasi non-oksidatif. Sebanyak 6.297 pembacaan PAL diurutkan dan 7 transkrip PAL dikumpulkan di C. deserticola (Tabel 5). Berdasarkan perbandingan kesamaan urutan, kami menemukan bahwa 4 di antaranya (comp28550_c1_seq1/2/3/5) memiliki lebih dari 95% kemiripan dengan urutan mRNA yang diketahui dari C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), sedangkan comp28550_c1_seq4 dan comp25940_c0_seq1 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 77% dan 82%. Prediksi ORF mengungkapkan 5 transkrip berpotensi mengkode protein dan dibawa dengan domain asam amino lyase aromatik (PF00221.14). Di antara mereka, hanya transkrip comp28550_c1_seq4 yang dapat mengkodekan rangkaian protein lengkap dari 718 residu asam amino. Telah dilaporkan bahwa PAL dikodekan oleh keluarga multigene kecil di sebagian besar spesies tanaman, seperti 4 di Arabidopsis thaliana, 5 di Populus trichocarpa, 3 di Scutellaria baicalensis, dan 7 Cucumis sativus, dll. Analisis filogenetik kami menunjukkan bahwa ada 4 Gen penyandi PAL pada C.

deserticola dan kami menamakannya masing-masing CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 dan CdPAL4 (Gambar S2). 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) dan trans-cinnamate 4-monooxygenase (CYP73A, EC 1.14.13.11) adalah dua enzim yang bertanggung jawab untuk mengubah asam sinamat menjadi dicoumarol-CoA secara terbalik pesanan. Mereka juga berada di tulang punggung, dan nilai FPKM ekspresi mereka masing-masing adalah 39,57 dan 51,93.

Keempat jenis lignin tersebut dibiosintesis melalui jalur berbeda yang dikendalikan oleh tiga enzim utama, cinnamoyl-CoA reductase (CCR, EC 1.2.1.44), shikimate o-hydroxycinnamoyltransferase (HCT, EC 2.3.1.133), dan ferulate{{1{ {56}}}}hidroksilase (F5H, EC 1.14.-.-). CCR dilaporkan sebagai titik kontrol jalur lignin [50, 51] yang mengkatalisis X-CoA (X termasuk dicoumarol, caffeoyl, feruloyl, 5-hydroxyl-feruloyl, dan sinapoyl) menjadi Y-aldehyde (Y termasuk p -cougar, caffeoyl, coniferyl, 5-hydroxyl-coniferyl, dan snap), sedangkan HCT mengkatalisis p-coumaroyl-CoA menjadi p-coumaroyl shikimic acid/p-coumaroyl quinic acid. Kedua enzim tersebut, seperti saklar, mengatur biosintesis P-hidroksil-fenil lignin atau tiga jenis lignin lainnya. F5H adalah saklar cabang lain yang mengatur syringyl lignin dan 5-hydroxyl-guaiacyl lignin. Enzim penting lainnya termasuk asam caffeic 3-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.68), caffeoyl-CoA O-methyltransferase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104), dan cinnamyl-alcohol dehydrogenase (CAD, EC 1.1.1.195 ) juga terdeteksi dinyatakan. Informasi ekspresi rinci tercantum pada Tabel 6. Gen enzim yang diidentifikasi dalam penelitian ini akan memberikan sumber daya berharga untuk studi genom fungsional pada tanaman obat penting ini. 10 gen yang terkait dengan jalur biosintesis lignin pada Tabel 6 dipilih untuk verifikasi RT-qPCR untuk mengkonfirmasi hasil RNAseq kami (Gambar 4), dan korelasinya yang tinggi (koefisien korelasi Pearson: 0,90343) menunjukkan akurasi tinggi dan reproduktifitas analisis transkriptome kami. Kumpulan Data S1 mencantumkan urutan primer yang digunakan dalam analisis ini.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kandidat Gen Pengkode Enzim yang Terlibat Dalam Biosintesis PhGs

Glikosida feniletanoid (PhGs) diketahui sebagai bahan aktif utama dalam C. deserticola dengan aktivitas meningkatkan potensi seksual, menangkal radikal bebas, dan anti penuaan. Tiga komponen kimia PhGs adalah asam organik, sakarida, dan aglikon feniletanol (Gambar 3). Asam organik termasuk asam caffeic, asam ferulic, dan asam coumalic adalah produk dari jalur biosintesis fenilpropanoid. Komponen sakarida termasuk glukosa dan rhamnosa merupakan produk jalur metabolisme karbohidrat, seperti metabolisme pati dan sukrosa, metabolisme gula amino dan gula nukleotida, metabolisme fruktosa dan manosa, dll. Namun jalur biosintesis bagian feniletanol belum jelas. Di sini, kami mengusulkan dua kemungkinan jalur biosintesis feniletanol berdasarkan data urutan kami. Salah satunya adalah jalur asam caffeic atau asam ferulic yang dilaporkan, juga dikenal sebagai jalur asam sinamat yang mirip dengan jalur tulang punggung biosintesis lignin. Jalur lainnya didasarkan pada jalur metabolisme fenilalanin (Gambar 3), di mana fenilalanin menjadi feniletanol dicapai melalui 'jalur Enrlich' yang pertama kali ditemukan pada ragi satu abad yang lalu dan divalidasi pada bunga petunia, tomat, dan mawar. Empat gen enzim yang mengkode aspartat/tirosin aminotransferase, histidin-fosfat aminotransferase, dan oksidase amina primer yang bertanggung jawab untuk konversi fenilalanin menjadi feniletanol terdeteksi diekspresikan dalam batang C. deserticola. Produk fenil etanol selanjutnya dapat dioksidasi oleh monooksigenase atau dimetilasi oleh metiltransferase menjadi turunannya (fenil etanol aglikon) yang berperan dalam biosintesis PhG. Singkatnya, dua jalur biosintesis diduga dari feniletanol aglikon telah diusulkanC.deserticolanamun masih memerlukan kajian lebih lanjut.

Diskusi

Dalam beberapa tahun terakhir, genomik tanaman telah berkembang pesat dengan penerapan teknologi pengurutan generasi berikutnya, sementara hanya sedikit penelitian yang berfokus pada genomik tanaman obat gurun. Penelitian genomik atau transkriptomik sangat diperlukan untuk memahami adaptasinya terhadap lingkungan kekeringan dan salinitas serta jalur biosintesis komponen bioaktif utama. Penemuan transkriptome de novo untuk beberapa tanaman medis,

seperti Panax ginseng, Ginkgo biloba, dan Glycyrrhiza uralensis telah pertama kali dieksploitasi menggunakan platform Roche 454 karena panjangnya bacaan. Karena kemampuan perakitan yang efektif dengan pembacaan singkat, terutama pembacaan berpasangan yang diuntungkan, pengurutan dan perakitan transkriptom berbasis Illumina juga telah banyak digunakan untuk organisme model dan non-model. Dalam penelitian ini, kami menghasilkan sekitar 8G dari pembacaan berpasangan 101 bp dan menghasilkan urutan unigene yang lebih panjang dengan panjang rata-rata 725 bp. Data transkriptom spesifik batang skala besar dapat memberikan data referensi yang berguna dan digunakan untuk menambang metabolisme sekunder komponen bioaktif C. deserticola. Ada 81,62% dari total pembacaan mentah yang melewati filter kualitas yang ketat (termasuk pemangkasan adaptor dan pembuangan pembacaan berkualitas rendah) sebelum perakitan, menunjukkan kualitas tinggi dari data pengurutan kami, dan 82,08% dari pembacaan berkualitas tinggi berguna untuk perakitan. Bacaan lain yang gagal digunakan untuk perakitan mungkin berasal dari kesalahan pengurutan, parameter perakitan, dan lain-lain. Bacaan berkualitas tinggi yang tidak terpakai tersebut tetap membantu dalam meningkatkan perakitan de novo dikombinasikan dengan bacaan yang lebih panjang dari platform lain (seperti Roche 454) di masa depan.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sejumlah besar transkrip yang dikumpulkan (30.098) menunjukkan kemiripan urutan tinggi dengan gen yang diketahui di database publik, menunjukkan bahwa data berpasangan berbasis Illumina kami mencakup sebagian besar transkrip C. deserticola. Transkrip tanpa hasil BLAST mungkin disebabkan oleh daerah 3' atau 5' yang tidak diterjemahkan, RNA yang tidak mengkode, atau rangkaian gen baru C. deserticola. Transkrip yang diungkapkan dijelaskan pada berbagai kategori GO dan jalur KEGG (Tabel 3 dan 4), di mana banyak transkrip ditugaskan ke jalur terkait metabolisme sekunder. Seperti yang kita ketahui, fenilpropanoid dapat berfungsi sebagai senyawa antimikroba yang dapat diinduksi dan sangat bermanfaat bagi gaya hidup bawah tanah [1], dan juga bertindak sebagai molekul sinyal dalam interaksi mikroba tanaman selain kegunaan obatnya [68, 69]. Terpenoid digunakan untuk biosintesis komponen bioaktif (seperti 6- deoxycatalpol) [70]. Kami menemukan gen yang terlibat dalam jalur biosintesis tulang punggung fenilpropanoid dan terpenoid sangat melimpah di C. deserticola. Lebih penting lagi, penemuan jalur biosintesis lignin yang terwakili dengan baik (Gambar 3) menunjukkan proses metabolisme aktif lignin di batang C. deserticola. Semua gen enzim yang diketahui terlibat dalam biosintesis lignin (Gambar 3) terdeteksi diekspresikan, dan empat enzim kunci termasuk PAL, CCR, HCT, dan F5H memiliki kelimpahan ekspresi yang lebih rendah (FPKM 26.47, 3.89, 3.4, dan 3.83, masing-masing) dibandingkan dengan gen enzim lainnya (Tabel 6). Apakah perubahan ekspresi ketiga gen tersebut dapat mempengaruhi produksi lignin pada C. deserticola perlu dipelajari lebih lanjut. PAL adalah enzim kunci dalam biosintesis lignin dan juga terlibat dalam biosintesis fenilpropanoid, resveratrol, flavonoid, dan kumarin [71-74]. Kami mendeteksi empat gen PAL yang berbeda dalam genom C. deserticola (Gambar S2) yang bertepatan dengan PAL yang dikodekan oleh keluarga multigene kecil [39, 43, 45-49] dan selanjutnya membuktikan bahwa gen tersebut mungkin memainkan peran penting dalam fluks karbon metabolik. .

PhG adalah bahan aktif utama dalam C. deserticola. Gen yang terlibat dalam biosintesis feniletanol penting untuk kualitas C. deserticola. Kami menyimpulkan dua jalur biosintesis berbeda dari fenil etanol dan 17 gen enzim yang terlibat dalam biosintesis PhG di batang C. deserticola. Kemungkinan proses pasca-kafeat/asam ferulat (Gambar 3) juga disimpulkan untuk pertama kalinya berdasarkan rumus struktur zat antara dan sifat katalitik dari enzim yang bersangkutan, di mana asam caffeat/ferulat akan dioksidasi terlebih dahulu menjadi turunan fenilpiruvat; kemudian, gugus karboksil dihilangkan dengan dekarboksilase; akhirnya, gugus aldehida diubah kembali menjadi gugus alkohol oleh dehidrogenase. Ini adalah aplikasi pertama teknologi pengurutan berpasangan Illumina untuk menyelidiki seluruh transkriptom C. deserticola dan untuk merakit pembacaan RNA-seq tanpa genom referensi. Studi ini akan menyediakan sumber daya dan urutan gen yang berguna untuk penelitian genomik fungsional dan proteomik pada C. deserticola di masa depan.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami membuat profil transkriptom batang C. deserticola berdasarkan data pengurutan throughput tinggi, mengidentifikasi gen yang terlibat dalam jalur biosintesis lignin, dan juga menyimpulkan jalur biosintesis potensial PhG untuk pertama kalinya, yang tentunya akan mempercepat pemahaman. dari proses fisiologis yang ambigu dan nilai obat yang luar biasa pada tingkat molekuler. Hingga saat ini, ini adalah upaya pertama untuk merakit seluruh transkriptom batang C. deserticola secara de novo dan mendeteksi jalur biosintesis komponen obat menggunakan kumpulan data pengurutan berbasis Illumina. Penelitian kami dapat mendorong pengembangan obat-obatan alami dan pemilihan kultivar yang memiliki sifat obat.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%