Curcumin Mengurangi Penuaan Sel Punca Mesenchymal Sumsum Tulang Anjing Selama Ekspansi In Vitro Bagian 2

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

2.5.Autophagy Inovoloes dalam Mengerahkan Efek Protektif Cur di cBMSC Senescence

Untuk mengeksplorasi efek autophagy yang diinduksi Cur pada penuaan cBMSC, level autophagy dimodulasi melalui penggunaan RAP(200 nM) atau 3-MA(5 mM).3-MA memberikan tindakan penghambatan yang signifikan pada aktivitas autophagic, dimanifestasikan oleh penurunan regulasi yang signifikan dari ekspresi mRNA dari protein terkait mikrotubulus 1 rantai ringan 3(LC3), gen terkait autophagy (ATG)7, ATG12, dan unc51-seperti autophagy-activating kinase{ {14}}(ULK1); penurunan rasio ekspresi protein terkait mikrotubulus 1 rantai ringan 3 tipe /I (LC3-I/I); dan peningkatan ekspresi p62 dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 5A, B). Oleh karena itu, dibandingkan dengan kelompok Cur, penurunan aktivitas autophagic diamati pada kelompok 3-MA plus Cur (Gambar 5A, B). Sebaliknya, peningkatan aktivitas autophagic diamati pada kelompok RAP, sebagaimana dibuktikan oleh ekspresi mRNA yang diregulasi dari LC3, ATG12, dan ATG7; peningkatan konversi LC3-I menjadi LC3-II; dan degradasi p62 (Gambar 5A, B).

Pertama, aktivitas autophagic diselidiki secara sistematis. Pembentukan vakuola autophagic (juga disebut autophagosomes) dinilai dengan pengamatan morfologi, dan hasilnya menunjukkan bahwa ada lebih banyak vakuola autophagic dan titik LC3 pada kelompok Cur dan kelompok RAP dibandingkan dengan kelompok kontrol, sementara jumlah vakuola autophagic berkurang dan lebih sedikit titik LC3 yang diamati pada 3-MA dan 3-MA ditambah kelompok Cur (Gambar 5C, E). Selain itu, pewarnaan LysoTracker menunjukkan bahwa pengasaman lisosom ditingkatkan oleh RAP dan Cur pada cBMSC dan menurun pada 3-MA dan 3-MA plus grup Cur (Gambar 5D). Hasilnya menunjukkan bahwa Cur dan RAP memberikan efek positif yang serupa pada aktivasi autophagy dan bahwa aktivitas autophagic ditekan oleh 3-MA.ukuran penis cistanche,Namun, efek penghambatan 3-MA pada autophagy sebagian dapat diselamatkan dengan penggunaan Cur.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Untuk mengkonfirmasi apakah autophagy berpartisipasi dalam regulasi penuaan CB MSc, kami lebih lanjut memeriksa fenotipe terkait penuaan setelah mempromosikan atau menekan autophagy melalui pengobatan farmakologis. Hasilnya menunjukkan bahwa pengurangan jumlah sel SA- -gal-positif terdapat pada kelompok Cur dan RAP, sementara peningkatan jumlah sel SA- -gal-positif diamati pada {{5} }Kelompok MA dibandingkan dengan kelompok kontrol. Perlu dicatat bahwa jumlah sel SA- -gal-positif meningkat secara signifikan pada kelompok 3-MA plus Cur dibandingkan dengan kelompok Cur (Gambar). Hasil analisis RT-qPCR menunjukkan bahwa perlakuan dengan RAP dan Cur meningkatkan tingkat ekspresi SOX-2 dan Nanog dan menurunkan tingkat ekspresi IL-6, TNF-a, p21, dan p16 dibandingkan dengan kelompok kontrol. Namun, penghambatan autophagy oleh 3-MA meningkatkan regulasi ekspresi p16, p21, TNF- , dan IL-6(Gambar 6C-E). Selanjutnya, dibandingkan dengan kelompok kontrol, efisiensi pembentukan koloni cBMSC meningkat pada kelompok Cur dan RAP, sedangkan jumlah dan ukuran CFU-F menurun secara signifikan pada kelompok 3-MA. Selain itu, ditunjukkan bahwa peningkatan efek Cur pada jumlah cBMSC pembentuk koloni dapat dihilangkan melalui pengkondisian awal dengan 3-MA (Gambar 6B).bubuk cistancheBukti ini menunjukkan bahwa RAP dan Cur dapat memperbaiki penuaan cBMSC, sementara 3-MA memperburuk penuaan cBMSC dan melemahkan efek menguntungkan yang diberikan oleh Cur.

Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa penghambatan autophagy dengan 3-MA mempercepat penuaan cBMSC, sedangkan aktivasi autophagy dengan Cur dan RAP mengurangi penuaan cBMSC (Gambar 6F). Khususnya, efek perlindungan yang diberikan oleh Cur dilemahkan oleh pretreatment dengan 3-MA (Gambar 6F), menunjukkan bahwa autophagy yang diinduksi Cur adalah mekanisme molekuler potensial untuk memperbaiki penuaan cBMSC.

3. Diskusi

Organisme terus menerus memperbaiki jaringan yang terluka dan menghambat proses terkait penuaan karena karakteristik fungsional khas MSC yang secara ekstensif berada di dalam berbagai jaringan dan organ [15]. Sayangnya, usia dan penyakit adalah faktor kunci untuk penuaan MSC in vivo, dan perbedaan internal dan eksternal dalam lingkungan seluler mempercepat penuaan MSC dalam kultur in vitro, yang keduanya secara negatif mempengaruhi kapasitas mereka untuk imunosupresi, diferensiasi, dan migrasi, yang pada akhirnya mengurangi efikasi diri. -perbaikan dan transplantasi di MSC [7,14,49-51].ekstrak cistanche salsaOja dan rekan menunjukkan bahwa BMSC manusia menghentikan proliferasi pada bagian kelima hingga kesembilan dari kultur tingkat klinis dan menunjukkan fenotipe penuaan yang khas, seperti morfologi hipertrofik dan datar, aktivasi penghambat siklus sel kinase p16 dan p21, penurunan tingkat proliferasi , dan peningkatan aktivitas SA- -gal [52]. Terbukti, ekspansi in vitro tak terhindarkan menimbulkan penampilan penuaan dini pada MSC, yang dianggap sebagai sistem model penting untuk penelitian penuaan seluler in vitro [42, A4, A5]. Penelitian kami saat ini menemukan bahwa cBMSC sebelum bagian ke-3 menunjukkan morfologi yang seragam tetapi telah diamati mengalami serangkaian perubahan dalam hal morfologi seluler, fisiologi, dan ekspresi gen setelah bagian ke-6 (Gambar 2 dan 7), konsisten dengan penuaan dini. .

Cistanche dapat anti-penuaan

Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa stimulasi farmakologis adalah pendekatan yang menjanjikan untuk menyelamatkan MSC dari penuaan [53,54]. Dengan pemikiran ini, sejumlah senyawa alami dan sintetis telah diselidiki secara ekstensif untuk menentukan potensi anti-inflamasi, antioksidan, dan anti-penuaan mereka secara in vivo dan in vitro [15,55]. Sebagai senyawa fenolik alami, Cur telah menarik perhatian besar karena efek menguntungkannya pada biologi MSC [36,37,56,57]. Namun, efek kompleks dari paparan Cur pada MSC harus dipertimbangkan dengan cermat sebelum pelaksanaan penelitian biomedis yang berbeda. Yang dan rekan melaporkan bahwa konsentrasi Cur yang tinggi (50 dan 100 uM) dapat menginduksi efek toksik akut pada BMSC manusia secara in vitro, sementara paparan terus menerus (7 hari) hingga 10uM Cur menghambat proliferasi BMSC manusia dan menginduksi apoptosis sel [58]. Menariknya, penelitian lain menunjukkan bahwa pengobatan dengan Cur(<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Baru-baru ini, aktivitas biologis Cur telah banyak dilaporkan pada berbagai model in vitro atau in vivo, khususnya mengenai modulasi karakteristik biologis MSC. Aktivitas anti-penuaan Cur telah sering dibahas, dan Cur telah ditemukan menunjukkan efek menguntungkan pada penuaan dan penyakit terkait usia pada tingkat organisme dan seluler. Namun, mekanisme yang mendasari pengaturannya rumit karena dosis dan bentuk Cur yang berbeda, serta mekanisme penuaan [19]. Sebagai mekanisme intraseluler utama degradasi molekul dan pergantian organel, autophagy memainkan peran utama dalam melindungi MSC terhadap kondisi stres dan mempertahankan homeostasis seluler. Modulasi autophagy dianggap sebagai strategi baru untuk perbaikan fungsi MSC [59]. Menurut data yang dikumpulkan dari studi substansial, promosi atau penekanan autophagy oleh Cur dalam berbagai model sel memberikan efek sitoprotektif yang memuaskan [38-40].batang cistancheData kami menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas autophagic diamati setelah terpapar Cur, seperti yang diidentifikasi oleh peningkatan regulasi gen terkait autophagy (LC3, ULK1, Atg7, dan Atg12), generasi LC3-II, peningkatan jumlah vakuola autophagic dan organel vesikular asam, dan penurunan yang signifikan pada tingkat protein p62 (Gambar 4). Selain itu, lisosom dianggap sebagai organel yang sangat diperlukan untuk autophagy, sementara disregulasi pH lisosom dan perubahan aktivitas vacuolar H plus -ATPase (v-ATPase) diamati dalam proses penuaan MSC, sehingga mendorong pengasaman lisosom dan autophagy dan berkontribusi untuk menunda penuaan MSC [60]. Yan dan rekan menunjukkan bahwa Cur dapat mengaktifkan fungsi lisosom fibroblas embrionik tikus (MEFs) dan menginduksi autophagy, yang berfungsi sebagai sinyal kelangsungan hidup yang penting [38]. Demikian pula, kami mengamati bahwa pengobatan Cur meningkatkan pengasaman lisosom dalam cBMSC (Gambar 4), menunjukkan bahwa Cur mungkin terlibat dalam mengaktifkan fungsi lisosom, yang sangat diperlukan untuk meningkatkan aktivitas autophagic.

Autophagy sebagian besar merupakan mekanisme sitoprotektif, dan semakin banyak bukti yang menunjukkan bahwa sifat anti-penuaan dari senyawa alami dan sintetis berkorelasi dengan modulasi autophagy [29,54,61,62]. Namun, efek modulasi autophagy pada penuaan MSC dan mekanisme yang sesuai belum sepenuhnya dievaluasi dan dieksplorasi. Laporan awal menunjukkan bahwa autophagy adalah mekanisme sitoprotektif yang dominan dan bahwa peningkatan level autophagy dapat menunda penuaan seluler dengan mengurangi akumulasi metabolit toksik dan memulihkan fungsi organel [63]. Menariknya, penyelidikan baru-baru ini juga menunjukkan bahwa peningkatan jumlah vakuola autophagic dan protein terkait autophagy (LC3-II, ATG7, dan ATG12) diamati selama penuaan MSC, sementara penghambatan autophagy dengan bafilomycin A1 dan {{11 }}MA terbukti mengurangi persentase SA- -sel gal-positif dan ekspresi p16 dan p21 [35]. Untuk lebih menjelaskan hubungan antara autophagy yang diinduksi Cur dan efeknya pada cBMSCsenescence, autophagy dimodulasi oleh pretreatment dengan rapamycin atau 3-MA. Jelas, aktivitas autophagic ditemukan dilemahkan oleh 3-MA, sedangkan RAP dan Cur (1 uM) terbukti secara signifikan meningkatkan autophagy (Gambar 5). Konsisten dengan laporan sebelumnya [5], temuan kami juga menunjukkan bahwa penghambatan autophagy oleh 3-MA mempercepat penuaan seluler di cBMSCs. Efek yang hampir konsisten pada aktivasi autophagy diberikan oleh Cur (1uMand RAP sementara efek sitoprotektif analog di cBMSC ditampilkan Oleh karena itu, ketika autophagy dihambat oleh 3-MA, efek perlindungan yang diberikan oleh Cur berkurang (Gambar ), menunjukkan bahwa autophagy yang diinduksi Cur adalah mekanisme molekuler potensial untuk memperbaiki penuaan cBMSC (Gambar 7).

Dalam kondisi fisiologis, autophagy terjadi pada tingkat basal di semua sel eukariotik untuk mempertahankan homeostasis seluler. Namun, berbagai kondisi stres dapat menyebabkan autophagy abnormal, yang memiliki pengaruh pada nasib sel kecuali autophagy dikembalikan ke tingkat optimal [41,44,64]. Bukti kami mengkonfirmasi bahwa autophagy yang diinduksi Cur menunjukkan efek menguntungkan pada regulasi penuaan cBMSC. Dalam skenario ini, beragam rangsangan penghasil stres dan pengaturan ekstraseluler harus dipertimbangkan dengan cermat sebelum pengobatan Cur, dan akan menarik untuk menyelidiki apakah autophagy yang diinduksi Cur dapat secara selektif meningkatkan fungsi MSC pada dosis dan durasi yang telah ditentukan. Selain itu, sistem pengiriman kurkumin berbasis nanoteknologi telah menunjukkan kelarutan fase air dan tingkat bioavailabilitas yang lebih baik [65,66]; itu bisa menjadi alat yang menjanjikan untuk menunda dan melawan penuaan MSC. Jawaban atas pertanyaan apakah autophagy adalah mekanisme dasar utama dalam menunda penuaan MSC masih membutuhkan lebih banyak detail yang akan diberikan oleh penelitian di masa depan.

4. Bahan dan Metode

4.1.Hewan

Sampel sumsum tulang dikumpulkan dari 6 anjing pedesaan Cina betina dewasa yang sehat (12-berusia satu bulan). Semua penelitian telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Fakultas Universitas Pertanian Sichuan (no. persetujuan 2020-0608) dan dilakukan sesuai dengan standar etika undang-undang perlindungan hewan di Republik Rakyat Tiongkok.

4.2. Persiapan Larutan Kurkumin

Cur(HPLC Lebih besar dari atau sama dengan 98 persen, nomor CAS:458-37-7; Solar Science& Technology Co., Ltd., Beijing, China) dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasi stok 20 mmol/ L disaring melalui membran filter mikropori organik 0,22 m dan disimpan pada derajat -80 . Solusi Cur yang berbeda disiapkan dalam media untuk studi in vitro.

4.3. Kultur dan Ekspansi Sel

cBMSC diperoleh dari sumsum tulang. Sel-sel dikultur dalam media lengkap yang terdiri dari Medium Elang Modifikasi Dulbecco rendah glukosa (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), serum janin sapi 10 persen (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, Cina ), dan 1 persen penisilin/streptomisin. Pada pertemuan 80-90 persen, sel-sel yang melekat dilepaskan dengan Solusi Pencernaan Tripsin (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) dan selanjutnya diperluas pada rasio 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Curie Pertumbuhan Sel

Untuk menentukan kemampuan proliferatif cBMSC dalam lintasan (P)3,6, dan 9, sel-sel diunggulkan dalam tiga 48-pelat sumur (2500 sel/sumur). Setelah inkubasi 48 jam, sel-sel dilepaskan dengan Trypsin Digestion Solution dan dihitung dengan hemositometer. Prosedur penghitungan sel diulang setiap 48 jam dan dipertahankan selama 14 hari.

4.5.Deteksi Immunophenotype cBMSCs dengan Flow Cytometry

Pada bagian ke-3, cBMSC dicuci dengan PBS dan ditripsinisasi. Sel-sel (3 × 105 sel/mL) disuspensikan kembali dalam buffer pewarnaan, dan suspensi sel 100 L） diinkubasi dengan antibodi monoklonal berlabel FITC, PE, atau APC terhadap antigen permukaan CD45, CD34, dan ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) dan CD31 berlabel nonfluorescent, CD90, dan CD105 (Biosintesis bioteknologi Co.Ltd. Beijing, China) selama 15 menit pada 4 derajat. Sel-sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi FITC selama 15 menit pada 4 derajat. Antigen permukaan dideteksi dengan flow cytometry (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Analisis data dilakukan dengan perangkat lunak CytExpert.

4.6. Uji Diferensiasi In Vitro

cBMSC dilapisi dengan kepadatan 5 × 104 sel/mL di 6-pelat sumur. Pada pertemuan 70-80 persen, media lengkap diganti dengan media induksi diferensiasi osteogenik atau adipogenik dan diganti setiap 3 hari (Cvagen, Suzhou, Cina). Deposisi kalsium dideteksi dengan pewarnaan Alizarin Red S (Solarbio, Beijing, Cina) setelah 3 minggu induksi osteogenik dan akumulasi tetesan lipid diamati menggunakan pewarnaan Oil Red O (Solarbio, Beijing, Cina) setelah 2 minggu induksi adipogenik.

4.7.Pengaruh Cur pada Viabilitas Seluler

Viabilitas seluler cBMSC ditentukan menggunakan CCK-8kit (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China).manfaat dan efek samping cistanche tubulosacBMSC dikultur sebelumnya dalam 96-piring sumur selama 24 jam.cBMSC diperlakukan dengan Cur pada konsentrasi yang berbeda (0.1, 0.5, 1, 5, dan 1{ {14}} umol/L) selama 12 jam, 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Sel diperlakukan dengan 0,1 persen DMSO, yang digunakan sebagai kontrol Setelah diinkubasi dengan 10 L larutan CCK-8 per sumur selama 2 jam, densitas optik diukur dengan pembaca pelat mikro pada 450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, AS). Viabilitas sel relatif dihitung sesuai dengan instruksi pabrik.

4.8. Uji Pembentukan Koloni

Efisiensi pembaruan diri cBMSC terdeteksi menggunakan unit pembentuk koloni-fibroblas CFU-F） assay. cBMSC diunggulkan 3 × 10² sel/sumur） di 6-pelat sumur. Setelah dua minggu kultur, sel-sel difiksasi dengan 4 persen paraformaldehyde selama 30 menit dan diamati di bawah mikroskop terbalik (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Jepang) setelah pewarnaan dengan 1 persen kristal violet selama 10 menit. Untuk CFU-F, lebih dari 50 sel dihitung. Efisiensi CFU-F dihitung sebagai berikut:

Efisiensi CFU-F=jumlah CFU-F/jumlah benih (300 sel)[68].

4.9. Uji Pewarnaan Beta-Galaktosidase

Aktivitas senescence-associated -galactosidase (SA- -gal) dalam cBMSC diperkirakan menggunakan kit pewarnaan SA- -gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) sesuai dengan instruksi pabriknya . Setelah pewarnaan, sel-sel diperiksa di bawah mikroskop terbalik. Sel-sel yang diwarnai secara positif dihitung untuk menilai penuaan seluler.

4.10.Transkripsi Terbalik PCR Kuantitatif Waktu Nyata (RT-qPCR)

Total RNA diekstraksi dari pelet sel menggunakan metode reagen Trizol. cDNA disintesis menggunakan kit reagen PrimeScriptTM RT dengan Penghapus gDNA (Takara, Shiga, Jepang). Primer PCR (Tabel 2) selain GAPDH mengacu pada penelitian sebelumnya [67] dirancang menggunakan perangkat lunak Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) berdasarkan urutan cDNA. qPCR dilakukan menggunakan TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Jepang) pada Sistem Deteksi PCR Waktu Nyata Sentuh CFX96 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Kondisi reaksi adalah sebagai berikut:95 derajat selama 30 s dan kemudian 39 siklus 95 derajat selama 5 detik dan 60 derajat selama 30 detik. Analisis kurva leleh dilakukan mulai dari 95 derajat selama 10 detik, kemudian mulai dari 65 hingga 95 derajat , meningkat 0,5 derajat setiap siklus. GAPDH digunakan sebagai kontrol internal untuk menormalkan semua data dan ekspresi relatif dihitung melalui metode Cycle Threshold (Ct) komparatif.

4.11. Pelacakan Lusosomal UIsing LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) digunakan untuk melacak lisosom, yang dapat menunjukkan peningkatan intensitas fluoresensi pada pengasaman lisosom. Kami menyemai cBMSC di 12-piring sumur dan memperlakukannya dengan Cur selama 24 jam, kemudian sel diperlakukan dengan Lyso-Tracker (60 nM) dan Hoechst 33.342 (2 ug / mL) selama 20 menit. Fluoresensi diamati menggunakan mikroskop fluoresensi terbalik setelah dicuci dengan PBS.

4.12. Imunofluoresensi

CBMSC (2x104 sel/slide) diunggulkan ke slide dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 30 menit. Setelah co-inkubasi dengan 0,5 persen Triton X-100 selama 5 menit (Solarbio, Beijing, Cina), bagian direndam dalam larutan pemblokiran selama 30 menit. Cairan terlampir dikeluarkan, dan sel diinkubasi dengan antibodi anti-LC3B (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) semalaman pada suhu 4 derajat , kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi fluorokrom (Abcam, Cambridge, MA, USA) selama 50 menit pada 37 derajat C. Akhirnya, sel-sel itu diwarnai dengan DAPI (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) dan dipantau di bawah mikroskop confocal.

4.13.Analisis Western Blotting

Sampel sel dilisiskan dengan jaringan dan lisat sel (Solarbio, Beijing, Cina) yang mengandung protease inhibitor setelah dicuci dengan PBS dingin. Lisis sel yang mengandung 15 ug protein per sampel dimasukkan ke dalam gel natrium-dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PA) (Solarbio, Beijing, Cina) dan dipisahkan dengan elektroforesis. Setelah mentransfer protein ke membran polivinilidena fluorida (PVDF), yang terakhir diblokir secara nonspesifik dengan 5 persen susu kering tanpa lemak (Solarbio, Beijing, Cina) selama 1 jam pada suhu kamar. Membran diinkubasi semalaman dengan antibodi primer anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62/SQSTM1(1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA ), dan anti- -aktin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) pada 4 derajat , dan noda dicuci dengan TBST (Solarbio, Beijing, China) sebelum diinkubasi dengan antibodi sekunder (1 :2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) pada 37 derajat selama 1 jam. Selanjutnya, membran dikembangkan dengan paparan reagen chemiluminescence (Millipore, Billerica, MA, USA) dan divisualisasikan dengan Sistem Pencitraan ChemiDocTM (Tanon-5200, Shanghai, Cina). Kepadatan pita diukur menggunakan perangkat lunak Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) untuk setiap kelompok dan dinormalisasi dengan -aktin.

4.14. Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)

Pelet sel dicerna dan dikumpulkan ke dalam tabung sentrifus 1,5 mL, kemudian difiksasi dengan 2,5 persen glutaraldehid (Solarbio, Beijing, Cina) selama 2 jam pada suhu kamar. Sampel dipasca-fiksasi dengan 1 persen osmium tetroksida selama 1 jam setelah dicuci dengan PBS, kemudian kami meningkatkan dehidrasi secara bertahap dalam larutan aseton dan memasukkannya ke dalam resin epoksi 812 (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Bejing, Cina). Selanjutnya, bagian 50 nm diperoleh dari ultra-mikrotom (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, Jerman). Bagian diwarnai dengan uranil asetat (Zhongjingkevi, Beijing, China) selama 10-15 menit dan timbal sitrat (Zhongjingkei, Beijing, China) selama 2 menit. Semua spesimen dilihat pada TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Jepang).

4.15. Analisis statistik

Hasil diperoleh dari tiga percobaan independen dan semua data ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Nilai statistik dianalisis menggunakan IBM SPS Statistics 25 dan diilustrasikan menggunakan GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Perbedaan yang signifikan secara statistik ditentukan dengan menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) dan uji-t Student. nilai p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Kesimpulan

Temuan kami menjelaskan hubungan antara Cur, penuaan cBMSC, dan autophagy. Data dari penelitian kami menunjukkan bahwa Cur dapat meringankan keadaan penuaan cBMSC sambil mengaktifkan autophagy dan mempromosikan pengasaman lisosom. Selain itu, bukti lebih lanjut menunjukkan bahwa autophagy yang diinduksi Cur adalah mekanisme potensial untuk memperbaiki penuaan cBMSC. Cur bisa menjadi aktivator dan konservator yang menjanjikan untuk meningkatkan fungsi MSC. Menurut pendapat kami, efek positif Cur pada penuaan tidak dapat diabaikan. Studi masa depan harus fokus pada efek regulasi Cur pada nasib MSC untuk meningkatkan potensi terapeutik MSC dalam berbagai penyakit, seperti kerusakan jaringan dan penyakit degeneratif dan inflamasi.

Artikel ini diambil dari Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms