Perbandingan Dua Uji Diagnostik Untuk Deteksi Antibodi Penetral Serum Terhadap Virus Diare Epidemi Babi

Abstrak:

Imunitas laktogenik penting untuk melindungi anak babi dari berbagai patogen termasuk virus diare epidemi babi. Sirkulasi tingkat antibodi penetral dalam serum babi dapat membantu menentukan apakah respon imun yang terdeteksi dapat memberikan perlindungan pada anak babi. Antibodi penetral dapat dideteksi melalui berbagai tes diagnostik. Penelitian ini mengevaluasi karakteristik diagnostik dari dua uji antibodi penetralisir antibodi penetral virus diare epidemi babi dalam serum babi yang ditantang. Empat kelompok perlakuan, kontrol, non-vaksinasi, vaksinasi sebelum tantangan, dan vaksinasi setelah tantangan, terdiri dari 20 anak ayam. Sampel serum dikumpulkan dari masing-masing emas sebelum dan sesudah tantangan terhadap virus diare epidemi babi. Sampel dievaluasi untuk mengetahui keberadaan antibodi penetral melalui uji netralisasi fokus fluoresen dan uji netralisasi throughput tinggi. Sensitivitas dan spesifisitas diagnostik untuk netralisasi fokus fluoresen dan uji netralisasi throughput tinggi untuk penelitian ini dioptimalkan pada batas pengenceran masing-masing pengurangan fluoresen 80 dan 80% dan menunjukkan persetujuan moderat berdasarkan statistik kappa. Uji netralisasi fluoresen fokus dan uji netralisasi throughput tinggi dapat digunakan untuk memantau status antibodi penetral dalam hewan atau populasi hewan. Uji throughput tinggi mempunyai keunggulan dibandingkan uji fluoresen fokus karena uji ini mempunyai spesifisitas yang lebih tinggi pada batas yang ditentukan dan sifat hasilnya memungkinkan diskriminasi yang lebih besar antar hasil individual.

manfaat suplemen cistanche-meningkatkan kekebalan tubuh

Kata Kunci: PEDV; antibodi penetralisir; uji diagnostik

1. Perkenalan

Virus diare epidemik babi (PEDV) adalah virus Alphacorona yang telah menjadi endemik di Amerika setelah kemunculannya di Amerika Serikat pada tahun 2013 [1–3]. Langkah-langkah biosekuriti difokuskan untuk menjauhkan patogen seperti PEDV dari kawanan babi untuk mengurangi dampak penyakit [4]. Pengujian serologi adalah alat yang berguna untuk menentukan apakah babi sebelumnya pernah terpapar dan terinfeksi oleh suatu patogen. Paparan dapat terjadi secara alami (misalnya, menelan bahan yang mengandung virus) atau disengaja (misalnya, bercampur dengan hewan yang mengeluarkan kotoran, inokulasi oral-nasal, atau bilas lambung). Untuk tujuan penelitian ini, paparan dicapai melalui tantangan yang disengaja dengan homogenat jaringan PEDV-positif dari wabah klinis PEDV yang dikonfirmasi. Lagu dkk. [5] menunjukkan titer antibodi penetral serum tidak berbeda antara babi yang diberikan vaksin PEDV DR13 yang dilemahkan secara oral atau intramuskular. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa babi yang diberi vaksinasi oral memiliki angka kematian babi yang lebih rendah dibandingkan dengan vaksinasi intramuskular. Selain itu, de Arriba dkk. [6] menunjukkan korelasi antara sel yang mensekresi antibodi (ASC) IgA dan IgG dalam darah dan jaringan limfoid terkait usus. Plasenta epiteliokorial babi yang menyebar mencegah sel-sel kekebalan dan antibodi ditransfer ke anak babi di dalam rahim sehingga membuat babi mengalami agammaglobulinemia saat lahir [7]. Imunitas ibu ditransfer dari induk babi ke anak babi melalui sekresi susu dan memainkan peran penting dalam perlindungan terhadap patogen enterik seperti PEDV, TGEV, dan rotavirus. Oleh karena itu, anak babi mengandalkan antibodi kolostrum dan susu untuk perlindungan dari patogen ini. Imunoglobulin serum merupakan kontributor besar terhadap kolostrum sedangkan imunoglobulin dalam susu diproduksi di dalam kelenjar susu [8]. Dengan demikian, uji antibodi penetral dapat membantu menentukan apakah respon imun yang terdeteksi pada serum babi sebelum melahirkan dapat memberikan perlindungan pada anak babi. Mekanisme penetralisir antibodi meliputi agregasi, penghambatan masuknya virus ke dalam sel target, dan penghambatan replikasi virus di dalam sel target [9]. Uji diagnostik telah dikembangkan untuk mendeteksi antibodi penetralisir PEDV termasuk netralisasi virus (VN), netralisasi fokus fluoresen (FFN), dan uji netralisasi throughput tinggi (HTNT) [2,10-13]. Seperti yang dijelaskan oleh Sarmento dkk. [2], uji FFN merupakan penyempurnaan dari uji VN karena uji ini lebih sensitif karena uji ini didasarkan pada deteksi antigen virus yang diekspresikan pada permukaan sel Vero yang terinfeksi sedangkan uji VN didasarkan pada efek sitopatik yang ditimbulkan. oleh virus. Selain itu, hasil FFN dapat diperoleh lebih cepat dibandingkan hasil VN karena efek sitopatik memerlukan waktu lebih lama untuk diamati dibandingkan dengan perlekatan virus dengan FFN. Uji HTNT merupakan penyempurnaan lebih lanjut dari uji FFN karena uji HTNT mengandalkan sitometri gambar digital dibandingkan interpretasi teknisi untuk mendapatkan hasilnya. Dengan demikian, memungkinkan seluruh pelat dibaca dalam waktu kurang dari 3 menit, menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam intensitas fluoresen, dan kemungkinan menyimpan gambar untuk ditinjau. Dengan demikian, HTNT tampaknya cocok untuk digunakan pada peternakan babi komersial. Penelitian ini membandingkan karakteristik diagnostik (sensitivitas dan spesifisitas) dan nilai prediksi positif dan negatif, dari dua tes antibodi penetral untuk tes PEDV, FFN, dan HTNT. Ini dibangun berdasarkan karya Sarmento dkk. [2] dengan menguji hewan yang naif, terinfeksi, dan divaksinasi untuk membantu memvalidasi pengujian untuk digunakan di laboratorium diagnostik dengan throughput tinggi. Berdasarkan hasil Sarmento dkk. [2], hipotesis nol kami adalah bahwa tidak ada perbedaan dalam karakteristik diagnostik kedua pengujian untuk mendeteksi antibodi penetralisir PEDV dalam serum gilt yang terjangkit PEDV.

manfaat suplemen cistanche-meningkatkan kekebalan tubuh

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Sumber dan Pemilihan Babi

Seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Brown et al. [14], penelitian ini menggunakan 4 kelompok perlakuan yang disebut sebagai Kontrol, NV (tidak divaksinasi), Pra (divaksinasi sebelum tantangan), dan Pasca (divaksinasi setelah tantangan). Setiap kelompok awalnya terdiri dari 20 ayam komersial, persilangan. Sebanyak 60 ekor babi dipilih dari peternakan babi komersial di Iowa tengah yang tidak memiliki riwayat PEDV. 20 gilt pada kelompok Kontrol digunakan kembali untuk kelompok NV. Kelompok NV hanya terdiri dari 18 ekor babi karena dua ekor babi dikeluarkan dari penelitian karena komplikasi yang tidak terkait dengan tantangan PEDV.

Sebagai bukti lebih lanjut status PEDV negatif, 12 mL darah dikumpulkan melalui pungsi vena jugularis menggunakan jarum pengukur 16-, jarum 1.5-inci, dan spuit 12 mL. Serum diambil dari sampel darah melalui sentrifugasi pada 1.500× g selama 8 menit (menit), dipecah menjadi 1 mL alikuot, dan disimpan pada suhu −80 ◦C. Sampel serum diuji dengan wv-ELISA di Laboratorium Diagnostik Hewan Iowa State University (ISU-VDL, Ames, IA, USA) [15].

2.2. Penugasan Hewan ke Kelompok Perawatan

Keenam puluh ekor induk tersebut dibagi rata menjadi 3 kelompok, masing-masing terdiri dari 20 ekor betina komersial hasil persilangan. Untuk membentuk empat kelompok perlakuan, 20 gilt digunakan secara berurutan untuk dua kelompok perlakuan, CONTROL dan NV. Penggunaan kembali 20 ekor babi memungkinkan pengembangan dan pengendalian sekelompok babi positif PEDV yang telah terpapar PEDV dan mengurangi jumlah total hewan yang digunakan dalam penelitian ini. 40 gilt sisanya terdiri dari grup PRE dan POST, dengan 20 gilt di setiap grup. Garis waktu kejadian berdasarkan kelompok perlakuan dijelaskan dalam Brown et al. [14]. Singkatnya, sampel darah individu dikumpulkan sekali seminggu di setiap kelompok perlakuan setelah tantangan tersebut. Penjelasan lebih lanjut dibahas pada Bagian 2.4 dan 2.5. Kelompok perlakuan "PRE" divaksinasi sebelum tiba di fasilitas luar lokasi. Kelompok perlakuan "POST" tidak divaksinasi sampai tantangan selesai.

2.3. Perumahan dan Perawatan Babi

Setibanya di fasilitas penelitian, induk babi ditempatkan secara berkelompok di dalam kelompok perlakuan: seluruh 20 ekor induk babi dalam satu kelompok perlakuan ditempatkan dalam satu kandang yang diberi pakan dan air ad libitum. Semua pena berada di ruangan yang sama. Satu pena dibiarkan kosong di antara kelompok NV PRE dan POST untuk meminimalkan kontaminasi. Pakan, air, tinggi dan rendahnya suhu ruangan, serta tinggi dan rendahnya kelembapan dipantau untuk memastikan konsistensi dengan standar produksi. Pengamatan kesehatan dilakukan dan dicatat sekali sehari untuk menilai ambulasi, kelesuan, konsistensi tinja, dan tanda-tanda klinis penyakit lainnya. Tag telinga (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) ditempatkan di telinga kanan setiap emas untuk identifikasi individu hewan.

2.4. Tantangan Lisan

Setelah periode aklimasi 4-hari, setiap emas di CONTROL dipaparkan secara oral ke PEDV menggunakan homogenat jaringan yang dikumpulkan dari wabah klinis PEDV yang dikonfirmasi di peternakan komersial. Homogenat tersebut diurutkan oleh Laboratorium Diagnostik Hewan Iowa State University dan ditemukan sebagai strain prototipe AS, genogroup G2b. Sepuluh mililiter homogenat dicampur dengan 590 mL larutan buffer fosfat dan 30 mL campuran tersebut diberikan secara ironis ke setiap emas. Inokulum dipastikan positif PEDV melalui reaksi berantai transkriptase polimerase terbalik secara real-time dengan nilai CT 19,6 dan 14,23 × 107 salinan genom per mL dan perkembangan diare pada gilt setelah tantangan. Sampel darah individu dikumpulkan setiap 7 hari setelah tantangan melalui pungsi vena jugularis seperti dijelaskan di atas hingga hari ke 42 pasca tantangan. Serum dipanen dan disimpan seperti dijelaskan di atas dan sampel diserahkan ke ISU VDL untuk mendeteksi antibodi penetralisir dengan uji netralisasi fluoresen fokus dan uji netralisasi virus throughput tinggi. Pada hari ke 60 setelah tantangan awal CONTROL, 40 gilt yang tersisa dibawa ke fasilitas penelitian dan 18 gilt CONTROL menjadi NV. Dua emas telah dikeluarkan dari CONTROL karena kondisi yang tidak berhubungan dengan penelitian. Setelah periode aklimasi 3-hari pasca kedatangan, 18 ekor babi ditantang ulang (NV) dan 40 ekor babi (PRE dan POST) ditantang, sampel darah dikumpulkan, serum diambil, dan sampel diserahkan untuk pengujian sebagaimana dijelaskan di sini .

2.5. Vaksinasi Gilts

Empat puluh ekor emas tetap berada di peternakan asal dan dibawa ke fasilitas penelitian 8,5 minggu setelah kedatangan CONTROL. Dua puluh ekor anak babi telah divaksinasi 5 dan 2 minggu sebelum tantangan, seperti yang direkomendasikan oleh perusahaan yang memproduksi vaksin tersebut, dengan vaksin PEDV mati yang tersedia secara komersial, genogroup G2b, (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ , AS) yang terdiri dari grup PRE. Dua puluh sisanya divaksinasi dengan vaksin yang sama, 1 dan 3 minggu setelah tantangan PEDV yang terdiri dari kelompok POST. Delapan belas dari dua puluh anak CONTROL yang asli tetap mengikuti penelitian dan termasuk dalam kelompok NV dan tidak menerima vaksinasi untuk PEDV.

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

2.6. Tes Antibodi Netral

2.6.1. Prosedur Netralisasi Fokus Fluoresen (FFN).

FFN dilakukan oleh Laboratorium Diagnostik Hewan Iowa State University, prosedur operasi standar 9.5324 [16]. Secara singkat, sel Vero 76 dibuat dengan membilas dan menginkubasi dengan asam Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) selama 5 menit pada suhu 37 ◦C. Pengenceran sel dan media perbanyakan sel dibuat dengan perbandingan 1:20 dan 200 µL ditambahkan ke setiap sumur pada pelat sumur dan diinkubasi selama 48 jam. Piring dibuang dan dibilas dengan media inokulasi virus. Sampel serum diinaktivasi dengan panas dalam penangas air pada suhu 56 ◦C selama 30 menit dan kemudian diencerkan dalam pengenceran serial 2-kali lipat yang dimulai pada 1:10 di dalam piring. Stok virus diencerkan menjadi 100-200 unit pembentuk fokus per 100 µL dan 100 µL ditambahkan ke masing-masing sumur dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ◦C dengan 5% karbon dioksida (CO2). Pelat uji dibuang, dibilas dan 150 µL campuran serum/virus ditambahkan ke sumur yang sesuai dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ◦C. Campuran serum/virus dibuang dan sumur dicuci dengan media inokulasi virus. 150 µL media inokulasi virus ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dan 5% CO2. Media dikeluarkan dari piring dan sel difiksasi dengan menambahkan 80% aseton, yang telah didinginkan dalam penangas es, selama 15 menit. Aseton dibuang dan piring dikeringkan di udara. Pengenceran 1:100 antibodi monoklonal PEDV NP terkonjugasi FITC yang diencerkan dalam PBS (pH 7,2) disiapkan dan 50 μL ditambahkan ke semua sumur dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 60 menit. Pelat dicuci dengan PBS dan kemudian dibaca menggunakan mikroskop fluoresensi (Olympus BX51, objektif 10X, filter FITC). Sumur positif tidak menunjukkan plak berfluoresensi dan sumur negatif menunjukkan plak hijau. Titer antibodi penetral dinyatakan sebagai pengenceran serum tertinggi dengan penurunan replikasi virus sebesar 90% dibandingkan dengan kontrol virus. Sampel dengan titer lebih besar dari atau sama dengan 20 diklasifikasikan sebagai positif antibodi penetral PEDV. Titer yang lebih tinggi menunjukkan konsentrasi antibodi penetralisir yang lebih tinggi dalam sampel. Contoh sampel serum positif dan negatif terdapat pada bahan pelengkap.

2.6.2. Prosedur Uji Netralisasi Fluoresen Throughput Tinggi (HTNT).

HTNT dilakukan oleh Laboratorium Diagnostik Hewan Iowa State University, prosedur operasi standar 9.5324 Versi 2 [17]. Sampel serum diinaktivasi dengan panas dalam penangas air pada suhu 56 ◦C selama 30 menit. Stok virus diencerkan secara serial 10-kali lipat dalam media inokulasi virus (DMEM dengan 2 µg/mL Trypsin-TPCK), dipindahkan ke sel Vero 81 (ATTC® CCL-81™), dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 5 hari. Pengenceran terakhir di mana efek sitopatik diamati digunakan untuk menentukan median dosis infeksi kultur jaringan (TCID50) menggunakan metode Spearman dan Karber [18]. Seratus mikroliter larutan sel (Media propagasi sel, sel Tripsin-EDTA, dan sel Vero 81), diencerkan dengan 100 μL media propagasi sel (DMEM dengan 10% FBS dan 1% penisilin-streptomisin) untuk membuat pengenceran 1:1 . Hemositometer digunakan untuk menghitung dan menghitung pengenceran untuk membuat 5 × 104 sel/sumur dan ditambahkan ke setiap sumur dari pelat sumur 96-hitam bening (pelat mikro CellBind sumur Coring 96, Sigma) dan diinkubasi selama 48 jam di 37 ◦C dengan 5% CO2 untuk membuat konfluen sel (konfluen 100%). Masing-masing lempeng mempunyai sumur kontrol positif, kontrol negatif, dan kontrol virus. Kemudian, lima mikroliter kontrol dan sampel yang dilemahkan dengan panas ditempatkan dalam lubang duplikat untuk membuat pengenceran 1:40 dengan terlebih dahulu 1:20 dengan menambahkan 95 µL media inokulasi virus, kemudian 100 µL virus PEDV yang diencerkan 1:10 (3,16 × 105 TCID50/mL). Campuran serum/virus diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2. Semua lubang sel pada pelat uji dicuci 3 kali dengan 150 µL media pencuci sel (DMEM dengan 1% penisilin-streptomisin), dan 150 µL campuran serum/virus dan kontrol virus dipindahkan ke pelat uji dan diinkubasi selama 90 menit. pada 37 ◦C. Campuran serum/virus dibuang dan piring dicuci satu kali dengan media pencuci sel, seperti dijelaskan di atas, diikuti satu kali dengan media inokulasi virus. Media inokulasi virus (150 µL) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2. Media inokulasi virus dibuang dan cawan dicuci dengan PBS pH 7,4. Sel difiksasi dengan menambahkan 4 ◦C, aseton 80% ke setiap sumur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Aseton kemudian dihilangkan dan pelat dikeringkan di udara selama 30 menit. Masing-masing sumur dibilas dengan PBS pH 7,4. 50 μL antibodi monoklonal PEDV NP terkonjugasi FITC (klon SD6-29, Medgene Labs) yang diencerkan 1:100 dalam PBS pH 7,4 ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 37 ◦C. Pelat dicuci sebanyak empat kali dengan PBS pH 7,4, sisa pencucian terakhir di dalam pelat selama 5 menit kemudian dibuang dan diganti dengan 100 µL PBS pH 7,4. Pelat kemudian dibaca dengan SpectraMax i3× menggunakan SoftMax Pro 6.5 (Perangkat Molekuler, San Jose, CA, USA) menggunakan waktu pencahayaan 30 ms dan penyesuaian fokus 20 um untuk 541 panjang gelombang. Sampel dengan Pengurangan Fluoresensi Total (%FR) lebih besar atau sama dengan 85% diklasifikasikan sebagai positif untuk antibodi penetralisir [2]. Pengurangan fluoresensi total dihitung sebagai 100 - ([Intensitas Fluoresensi Total sampel rata-rata / Intensitas Fluoresensi Total Kontrol Negatif Rata-rata]) × 100). Pengurangan fluoresensi total yang lebih tinggi menunjukkan konsentrasi antibodi penetral yang lebih tinggi dalam sampel. Contoh sampel serum positif dan negatif terdapat pada bahan pelengkap.

2.7. Karakteristik Diagnostik: Sensitivitas dan Spesifisitas serta Nilai Prediktif Positif dan Negatif

Sensitivitas dan spesifisitas diagnostik dihitung untuk HTNT menggunakan batas %FR 70, 75, 80, 85, dan 90 dan FFN menggunakan batas pengenceran sampel 20, 40, 80, dan 160 untuk menentukan batas optimal. Dioptimalkan didefinisikan sebagai batas di mana spesifisitas diagnostik dimaksimalkan dengan kehilangan spesifisitas diagnostik yang minimal. Subset dari tujuh puluh enam sampel PEDV-negatif yang diketahui dipilih dari dua titik pengambilan sampel pertama untuk kelompok CONTROL dan POST. 36 sampel yang diketahui positif PEDV dipilih dari dua titik pengambilan sampel terakhir untuk kelompok NV. Batasan yang lebih besar dari 85 digunakan untuk menentukan sampel positif, sesuai dengan prosedur operasi standar ISU VDL untuk pengujian tersebut [17]. Sensitivitas diagnostik diperkirakan dengan membagi jumlah sampel positif yang diketahui dan dites positif dengan total sampel positif yang diketahui. Spesifisitas diagnostik diperkirakan dengan membagi jumlah sampel negatif yang diketahui dan hasil tesnya negatif dengan jumlah sampel negatif yang diketahui. Batasan yang mengoptimalkan spesifisitas dan sensitivitas diagnostik dipilih untuk perbandingan pengujian. Untuk keperluan penelitian ini, spesifisitas diagnostik (DSp) dan sensitivitas (DSe) dimaksimalkan, dimana nilai absolut selisih antara nilai sensitivitas dan spesifisitas paling kecil. Nilai prediksi positif (PPV) diperkirakan dengan membagi jumlah sampel positif yang diketahui dan dites positif (TP) dengan total sampel tes positif (TP ditambah positif palsu [FP]). Nilai prediksi negatif (NPV) diperkirakan dengan membagi jumlah sampel negatif yang diketahui (TN) yang dites negatif dengan total sampel negatif uji (TN ditambah negatif palsu [FN]).

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Analisis statistik

Tidak ada hasil yang tidak menentu atau data yang hilang dalam penelitian ini. Seluruh data dianalisis menggunakan SAS Versi 9.4 (SAS Instit. Cary NC). 609 pengamatan dari 6{{10}} babi milik salah satu dari 4 kelompok digunakan. Dua kemungkinan nilai batas (40 dan 80) untuk uji FFN dipertimbangkan dan dibandingkan dengan batas 85 untuk HTNT. Untuk masing-masing model, model efek campuran linier cocok untuk menjelaskan pengaruh kelompok terhadap kesesuaian pengujian FFN dan HTNT, dengan efek acak khusus babi. Semua analisis perbandingan berpasangan kelompok dilakukan. Selanjutnya, untuk dua dari tiga nilai batas yang digunakan untuk pengujian FFN, koefisien Kappa Cohen dihitung untuk menentukan kesesuaian keseluruhan pengujian FFN dan HTNT. Koefisien Kappa diinterpretasikan sebagai berikut: kurang dari 0.0, persetujuan "buruk"; antara 0.0 dan 0.20, "sedikit setuju"; antara 0.21 dan {{30}}.40, perjanjian "adil"; antara 0,41 dan 0,60, kesepakatan "moderat"; antara 0,61 dan 0,80, kesepakatan "substansial"; dan antara 0,81 dan 1,0, kesepakatan "hampir sempurna" [19]. Signifikansi ditetapkan pada p Kurang dari atau sama dengan 0,05. Plot kotak dan kumis dikembangkan menggunakan perangkat lunak R.

3. Hasil

Tabel 1 menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas diagnostik untuk uji FFN dan HTNT pada batas waktu yang dipilih. Sensitivitas dan spesifisitas diagnostik untuk dua pengujian untuk penelitian ini dioptimalkan pada batas pengenceran masing-masing 80 dan 80% FR.

Tabel 1. Sensitivitas diagnostik (DSe), Spesifisitas diagnostik (DSp), Nilai Prediktif Positif (PPV), dan Nilai Prediktif Negatif (NPV) untuk uji HTNT dan FFN menggunakan berbagai batas yang tercantum pada baris kedua tabel. Misalnya, untuk pengujian HTNT pada batas 70, DSe=0.97 (97%), DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83%), dan NPV=0,95 (95%). kamu=tidak terdefinisi.

Gambar 1 menampilkan plot kotak dan garis hasil HTNT berdasarkan hari setelah tantangan menurut kelompok perlakuan studi. Sampel dari kelompok CONTROL dan POST (n=76) diklasifikasikan sebagai negatif pada hari −4, 0, dan 7 seperti yang diharapkan karena status babi sebelumnya. Kelompok NV mengembangkan respons anamnestik setelah tantangan tersebut. Penurunan variabilitas terjadi pada hasil HTNT yang ditunjukkan dengan penurunan kisaran nilai pada kedua kelompok yang divaksinasi (PRE dan POST) setelah diberikan tantangan dengan PEDV. Variasi yang menurun ini dapat diamati pada Gambar 1 karena garis-garis dan outlier dari plot POST dan PRE menjadi lebih pendek pada 14 hari pasca-tantangan. Gambar 2 menampilkan plot kotak dan garis dari hasil FFN transformasi log alami per hari pasca-tantangan menurut kelompok perlakuan, yang memiliki hasil serupa dengan uji HTNT. Hasil HTNT (Gambar 1) dan FFN (Gambar 2) menunjukkan respons terhadap tantangan dan vaksinasi seperti yang terlihat pada peningkatan %FR dan titer dari kedua pengujian. Meskipun besarnya serupa, variasi hasil masing-masing pengujian berkurang setelah tantangan homolog (NV). Penurunan variasi juga terjadi setelah vaksinasi (PRE dan POST). Variasi nilai antibodi penawar pada minggu pasca pajanan menurun setelah vaksinasi dan tantangan homolog dengan PEDV (Gambar 1 dan 2). Ada kecenderungan serupa dalam penurunan variasi antibodi penetral yang terlihat pada hasil pengujian pada kelompok perlakuan yang divaksinasi dan kelompok perlakuan yang diuji homolog. Tantangan homolog dari PEDV dan vaksinasi kedua menghasilkan respon anamnestik yang menghasilkan tingkat antibodi penetralisir yang lebih tinggi dengan variasi yang berkurang antar babi dibandingkan dengan nilai sebelum dan sesudah vaksinasi yang diukur dengan kedua pengujian (Gambar 1). Berdasarkan analisis sensitivitas dan spesifisitas diagnostik, batas 80 (titer) dan 85 (%FR) dipilih untuk menganalisis kesesuaian pengujian untuk pengujian FFN dan HTNT. Tes kappa menunjukkan persetujuan "sedang" sebesar 0.5257 dengan interval kepercayaan 95% sebesar 0.461, 0.5904 dari pengujian untuk batas 80 (titer) dan 85 (%FR) untuk tes FFN dan HTNT.

Gambar 1. Plot kotak-dan-kumis dari kurva respons antibodi HTNT pada hari-hari pasca-tantangan untuk setiap kelompok perlakuan. Bilah tengah mewakili nilai median hasil menurut minggu. Engsel (atas dan bawah kotak) mewakili kuartil pertama (Q1) dan ketiga (Q3). Daerah yang diarsir mewakili rentang antarkuartil (IQR). Kumisnya ditentukan sebagai berikut: Kumis atas=Q3 + 1.5∗IQR; Kumis bawah=Q1 + 1.5∗IQR. Jika tidak ada titik data pada nilai yang dihitung, titik data berikutnya yang paling dekat dengan Q1 atau Q3 adalah batas garis batasnya. Lingkaran terbuka (◦) menunjukkan outlier. Potongan 85 dilambangkan dengan garis putus-putus di 85 pada sumbu y.

Gambar 2. Plot kotak-dan-kumis dari kurva respons antibodi FFN pada hari-hari pasca-tantangan untuk setiap kelompok perlakuan. Bilah tengah mewakili nilai median hasil menurut minggu. Engsel (atas dan bawah kotak) mewakili kuartil pertama (Q1) dan ketiga (Q3). Daerah yang diarsir mewakili rentang antarkuartil (IQR). Kumisnya ditentukan sebagai berikut: Kumis atas=Q3 + 1.5∗IQR; Kumis bawah=Q1 + 1.5∗IQR. Jika tidak ada titik data pada nilai yang dihitung, titik data berikutnya yang paling dekat dengan Q1 atau Q3 adalah batas garis batasnya. Lingkaran terbuka (◦) menunjukkan outlier. Potongan 40 dilambangkan dengan garis putus-putus di ln(40) pada sumbu y.

4. Diskusi

Kami berhipotesis bahwa berkurangnya variasi dan respon anamnestik berhubungan dengan kekebalan kelompok yang homogen dan perlindungan dari penyakit, meskipun tanda-tanda klinis masih diamati pada kelompok PRE seperti yang dijelaskan sebelumnya [14]. Dampak klinis dan tingkat keparahan penyakit pada hewan-hewan ini tidak dievaluasi untuk tujuan penelitian ini. Penyakit ini bermanifestasi secara berbeda antara hewan dewasa dan neonatus dengan tanda-tanda klinis yang lebih parah dan kematian pada neonatus dibandingkan dengan hewan dewasa [1,20]. Meskipun tingkat antibodi penetralisir dalam sirkulasi saja tidak memberikan perlindungan [21], tingkat tersebut dapat digunakan untuk menilai respons antibodi setelah paparan yang disengaja atau pemberian vaksinasi dalam kelompok. Meskipun tidak adanya viremia merupakan karakteristik PEDV, viremia telah dilaporkan pada anak babi hingga usia 4 minggu [22,23]. Dengan demikian, antibodi penetralisir yang bersirkulasi dapat mempengaruhi perjalanan klinis penyakit [21]. Namun, imunitas laktogenik, khususnya IgA dalam sekresi susu akan menjadi pengukuran perlindungan yang lebih akurat pada anak babi [21]. Pengujian yang dijelaskan dalam penelitian ini dapat digunakan untuk memantau antibodi penetral serum setelah pemberian vaksinasi pada kelompok babi betina atau babi, selain mengumpulkan sekresi susu untuk menguji IgA laktogenik/sekretorik. Akan bermanfaat jika data yang dihasilkan dari pengujian ini dapat memprediksi kuantitas dan stabilitas imunitas laktogenik yang dihasilkan setelah vaksinasi. Namun hal tersebut tidak dianalisis dalam penelitian ini. Respon antibodi IgG serum setelah vaksinasi telah terbukti dapat memprediksi respons IgG kolostral, namun tidak ada korelasi antara antibodi penetral serum dan antibodi sekresi payudara [15]. Meskipun tidak ada korelasi antara antibodi penetral serum dan sekresi payudara, hewan yang divaksinasi terbukti memiliki antibodi penetralisir yang lebih tinggi dalam sekresi payudara dibandingkan dengan hewan kontrol [15]. Oleh karena itu, sebagaimana didukung oleh, Bjustrom-Kraft, dkk. [15], jika antibodi penetralisir serum tinggi, maka IgG dan IgA dalam sekresi payudara juga dapat meningkat. Dengan demikian, pengumpulan sampel serum sebelum pemindahan betina ke rumah bersalin akan meminimalkan stres dan rasa sakit yang disebabkan selama pengumpulan darah dan sekresi susu periparturien yang dapat berdampak negatif pada babi dan sampah [24]. Penting bagi pengguna untuk memahami bagaimana nilai batas dapat mempengaruhi sensitivitas diagnostik dan spesifisitas suatu pengujian. Meningkatkan nilai batas akan menurunkan jumlah hasil positif palsu dan meningkatkan jumlah hasil negatif palsu. Sebaliknya, penurunan nilai batas akan meningkatkan jumlah hasil positif palsu dan menurunkan jumlah hasil negatif palsu. Pengetahuan ini memungkinkan pengguna untuk memilih nilai batas mana yang akan digunakan untuk situasi spesifik mereka. Untuk penelitian ini, berdasarkan hasil penelitian ini dan hasil sebelumnya yang dipublikasikan oleh Sarmento et al. [2], kami memilih 80% FR untuk HTNT dan pengenceran 80 FFN. Pada batas waktu ini, spesifisitas diagnostik untuk HTNT (97%) lebih tinggi dibandingkan dengan FFN (76%) dan memberikan nilai prediksi positif yang lebih tinggi dari HTNT dibandingkan dengan FFN. Harus dipahami juga bahwa nilai prediksi bergantung pada prevalensi penyakit [25,26]. Pada penelitian ini berdasarkan sampel yang diklasifikasi prevalensinya adalah 32,1% (36 sampel positif dan 76 sampel negatif). Ketika prevalensi meningkat, PPV juga akan meningkat karena hewan yang diuji (sampel) lebih mungkin positif; ketika prevalensi menurun, NPV akan menurun. Gambar 3A dan B mengilustrasikan hal ini untuk pengujian HTNT dan FFN pada berbagai titik batas yang dievaluasi dalam penelitian ini mengikuti metode yang dijelaskan oleh Erb [25]. Oleh karena itu, ketika mempertimbangkan hasil diagnostik, seseorang harus mempertimbangkan sensitivitas diagnostik dan spesifisitas pemeriksaan serta memahami prevalensi dalam kelompok jika menggunakan nilai prediktif.

Gambar 3. (A). Nilai Prediktif Positif untuk pengujian HTNT (garis hitam) dan FFN (garis abu-abu) pada berbagai batas waktu. Batas 90 tidak terwakili untuk HTNT. (B). Nilai prediktif negatif atau pengujian HTNT (garis hitam) dan FFN (garis abu-abu) pada berbagai batas waktu. Batas 20 tidak terwakili untuk pengujian FFN.

he HTNT memiliki sensitivitas dan spesifisitas diagnostik yang unggul dibandingkan dengan FFN. Saat menganalisis hasil antibodi, cara ini ideal untuk meminimalkan jumlah hasil positif palsu dan negatif palsu. Misalnya, ketika menggunakan batas 80 untuk FFN, kami mengamati sensitivitas sebesar 97% dan spesifisitas sebesar 76%. Artinya, hanya terdapat sedikit hasil negatif palsu, namun terdapat banyak hasil positif palsu. Jika hasilnya salah dikategorikan sebagai positif, hal ini dapat menyebabkan salah tafsir bahwa suatu kelompok memiliki antibodi terhadap PEDV padahal sebenarnya tidak. Karena HTNT memiliki diagnostik dan spesifisitas yang lebih tinggi di berbagai titik batas, HTNT merupakan uji yang lebih disukai untuk mendeteksi antibodi PEDV. Hasil dari Sarmento dkk. [2] menunjukkan spesifisitas diagnostik yang jauh lebih tinggi untuk FFN dan sensitivitas serta spesifisitas yang sebanding untuk HTNT. Tes diagnostik ini menunjukkan kesesuaian yang moderat menurut statistik kappa (κ). Salah satu kelemahan κ adalah bahwa satu tes harus dianggap sebagai standar emas. Saat membandingkan dua pengujian yang tidak sempurna, hal ini dapat merusak interpretasi κ. Untuk penelitian ini, kami mengevaluasi kinerja diagnostik pengujian tersebut bersama dengan κ untuk menentukan bahwa pengujian tersebut sesuai tetapi mungkin memiliki kegunaan yang berbeda. Keuntungan tambahan HTNT dibandingkan pengujian FFN adalah hasil HTNT dihitung dari data kontinu dibandingkan dengan nilai kategorikal (titrasi) dari FFN. Sifat data HTNT yang berkesinambungan memungkinkan diskriminasi yang lebih besar terhadap hasil sampel untuk menggambarkan status antibodi penawar pada babi. Seperti dilansir Sarmento dkk. [2], HTNT memiliki waktu baca yang lebih singkat dari 96 pelat sumur hingga kurang dari 4 menit sehingga memungkinkan penyelesaian hasil yang lebih cepat. Antibodi sistemik yang bersirkulasi dapat berkontribusi terhadap perlindungan babi terhadap infeksi PEDV [21]. Namun, tidak ada literatur mengenai jumlah antibodi penetralisir yang bersirkulasi pada babi yang dapat memberikan perlindungan PEDV pada anak babi. Tingkat antibodi yang tinggi dalam sirkulasi menyebabkan konsentrasi yang lebih tinggi dalam kolostrum dan meningkatkan perlindungan. Evaluasi lebih lanjut diperlukan untuk menentukan hubungan antara, kapan pengambilan sampel selama masa kehamilan, dan perlindungan antibodi kolostral terhadap infeksi PEDV. Imunitas laktogenik dan mukosa sangat penting untuk kelangsungan hidup babi yang terpapar PEDV. Antibodi dikumpulkan di dalam susu melalui sumbu usus-MG-sIGA dan diteruskan ke anak babi untuk memberikan perlindungan. Langel dkk. [27] menemukan bahwa babi yang terpapar selama trimester kedua memiliki tingkat sirkulasi IgA, IgG, dan antibodi penawar yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan babi pada trimester pertama dan ketiga. Selain itu, Langel dkk. [27] menemukan bahwa anak babi yang terpapar PEDV pada trimester kedua memiliki tingkat kelangsungan hidup 100% dibandingkan dengan kurang dari 87,2% pada trimester lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa serum IgA, IgG, dan antibodi penawar yang tinggi berhubungan dengan kelangsungan hidup anak babi dalam menghadapi PEDV. PEDV. Meskipun antibodi serum tidak memberikan perlindungan terhadap PEDV, hasil penelitian kami menunjukkan tingkat antibodi penetral serum berhubungan dengan perlindungan terhadap infeksi PEDV. Seperti yang dilaporkan sebelumnya oleh Brown dkk. [14], PEDV dikeluarkan melalui tinja setelah tantangan homolog dan vaksinasi gilt. Penelitian ini menggunakan sampel dari hewan yang sama seperti Brown et al. [14]. lebih lanjut menunjukkan bahwa peningkatan antibodi penetral serum setelah paparan tantangan atau vaksinasi tidak mempengaruhi pola pelepasan virus karena tingkat antibodi meningkat setelah tantangan dan vaksinasi. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi apakah jumlah virus yang keluar dalam tinja berhubungan dengan jumlah antibodi penetralisir yang ada dalam serum [21].

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

5. Kesimpulan

Hipotesis nol penelitian ini adalah tidak ada perbedaan karakteristik diagnostik dari dua tes antibodi penetralisir PEDV, FFN dan HTNT. Hasil menunjukkan bahwa pengujian ini cukup sesuai berdasarkan statistik kappa, sementara terdapat variasi dalam karakteristik diagnostik dan nilai prediktifnya berdasarkan batas waktu pengujian. Pengujian ini dapat digunakan untuk mengukur respons vaksinasi suatu kelompok. Kegagalan untuk menolak hipotesis nol menunjukkan bahwa HTNT adalah tes yang lebih disukai untuk mendeteksi antibodi penetral PEDV dalam serum. Setelah vaksinasi pada kelompok PRE dan POST, penelitian ini menemukan sebagian besar hasil positif. Pada kelompok PRE, penurunan variasi hasil juga mengikuti tantangan tersebut. Hasil ini menunjukkan bahwa praktisi babi dapat mengukur antibodi penetral serum untuk menentukan apakah vaksin PEDV diberikan dengan benar pada ternaknya.

Referensi

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Virus Corona. Dalam Penyakit Babi, edisi ke-11; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, AS, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​​​L.; Mora-Diaz, JC; Utama, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Deteksi antibodi penetral virus diare epidemik babi menggunakan sitometri pencitraan throughput tinggi. J.Dokter Hewan. Diagnosis. Selidiki. 2020, 32, 324–328. [Referensi Silang]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, UGD; Matahari, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Pengukur, P.; Schmitt, BJ; dkk. Munculnya virus diare epidemik babi di Amerika Serikat: Tanda-tanda klinis, lesi, dan urutan genom virus. J.Dokter Hewan. Diagnosis. Selidiki. 2013, 25, 649–654. [Referensi Silang]

4.Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Evaluasi langkah-langkah biosekuriti untuk mencegah penularan tidak langsung virus diare epidemi babi. Dokter Hewan BMC. Res. 2017, 13, 89. [Referensi Silang]

5. Lagu, DS; Oh, JS; Kang, BK; Yang, JS; Bulan, HJ; Yoo, HS; Jang, YS; Park, BK Kemanjuran oral sel Vero dilemahkan virus diare epidemi babi strain DR13. Res. Dokter hewan. Sains. 2007, 82, 134–140. [Ref Silang] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Respon dan perlindungan antibodi spesifik isotipe mukosa dan sistemik pada babi konvensional yang terpapar virus diare epidemik babi yang mematikan atau dilemahkan. Dokter hewan. imunol. Imunopatol. 2002, 85, 85–97. [Ref Silang] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Perbandingan struktur histologis plasenta pada hewan percobaan. J. Toksikol. jalan. 2014, 27, 11–18. [Ref Silang] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Pemindahan imunoglobin IgG, IgA, dan IgM dari serum ke kolostrum dan susu pada babi. Imunologi 1973, 24, 157–162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Aktivitas antivirus antibodi in vitro dan in vivo. Adv. imunol. 2001, 77, 195–262. [Referensi Silang]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Matahari, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Pengukur, P.; dkk. Deteksi virus diare epidemi babi (PEDV) dan respons antibodi pada babi yang dipelihara secara komersial. Dokter Hewan BMC. Res. 2016, 12, 99. [Referensi Silang]

11. Oh, JS; Lagu, DS; Yang, JS; Lagu, JY; Bulan, HJ; Kim, TI; Park, BK Perbandingan uji imunosorben terkait enzim dengan uji netralisasi serum untuk serodiagnosis infeksi virus diare epidemi babi. J.Dokter Hewan. Sains. 2005, 6, 349–352. [Referensi Silang]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Klemens, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Pengembangan ELISA tidak langsung, pemblokiran ELISA, immunoassay mikrosfer fluoresen, dan uji netralisasi fokus fluoresen untuk evaluasi serologis paparan terhadap virus Diare Epidemi Porcine strain Amerika Utara. Dokter Hewan BMC. Res. 2015, 11, 180. [Ref Silang] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Pengukur, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; dkk. Isolasi dan karakterisasi virus diare epidemi babi yang terkait dengan wabah penyakit tahun 2013 di kalangan babi di Amerika Serikat. J.Klin. Mikrobiol. 2014, 52, 234–243. [Referensi Silang]

14. Coklat, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Kemanjuran vaksin virus diare epidemi babi komersial dalam mengurangi durasi pelepasan virus pada emas. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Respon antibodi sekresi serum dan payudara pada hewan yang kebal diare epidemi babi setelah vaksinasi diare epidemi babi. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Universitas Negeri Iowa. Tata Cara Uji Fluorescent Focus Neutralization (FFN) Virus Diare Epidemi Babi (PEDV). Serologi 2017, 1–7.

17. Universitas Negeri Iowa. Prosedur Tes Netralisasi Virus High-Throughput Virus (PEDV) Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV). Serologi 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, Panduan Metode Virologi BWJ; Pers Akademik: London, Inggris, 1996; P. 21.

19. Thrusfield, M. Epidemiologi Hewan, edisi ke-2; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, AS, 1995; P. 479.

20. Lee, C. Virus diare epidemik babi: Virus babi epizootik yang muncul dan muncul kembali. virus. J. 2015, 12, 193. [Referensi Silang]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Bangkai, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; dkk. Apakah Antibodi yang Beredar Berperan dalam Perlindungan Anak Babi terhadap Virus Diare Epidemi Babi? PLoS SATU 2016, 11, e0153041. [Referensi Silang]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; Sebuah, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; dkk. Lokalisasi jaringan, pelepasan, pembawa virus, respons antibodi, dan transmisi aerosol virus diare epidemik pada babi setelah inokulasi pada babi bakalan berumur 4-minggu. J.Dokter Hewan. Diagnosis. Menginvestasikan. 2016, 28, 671–678. [Referensi Silang]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, UGD; Hoang, H.; Matahari, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Pengukur, PC; Stevenson, GW; dkk. Karakterisasi Virus Diare Epidemi Babi yang Diisolasi Infeksi AS/Iowa/18984/2013 pada Anak Babi yang Kurang Kolostrum Berasal dari Operasi Caesar Berusia Sehari. Dokter hewan. jalan. 2016, 53, 44–52. [Referensi Silang]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Nyeri dan ketidaknyamanan akibat proses melahirkan pada sapi dan babi. Aplikasi. animasi. Berperilaku. Sains. 2011, 135, 241–251. [Referensi Silang]

25. Erb, HN Prior probabilitas (tebakan terbaik pretest) mempengaruhi nilai prediktif tes diagnostik. Dokter hewan. Klinik. jalan. 2011, 40, 154–158. [Ref Silang] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Prevalensi. Di StatPearls; Penerbitan StatPearls: Treasure Island, FL, AS, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Bir, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Tahap Kehamilan pada Infeksi Virus Diare Epidemi Babi pada Babi Hamil Berdampak pada Imunitas Ibu dan Perlindungan Imun Laktogenik pada Anak Babi Menyusui Neonatal. Depan. imunol. 2019, 10, 727. [Referensi Silang] [PubMed]