Ekstrak Cistanche Deserticola Meningkatkan Pembentukan Tulang di Osteoblas--Bagian I
Mar 15, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
Te-Mao Liaet a
Abstrak
Tujuan Kami menyelidiki efek dariBentengdeserticolaBu (CD) aktiftulangpembentukanoleh osteoblas yang dikultur. Metode Uji pembentukan nodul termineralisasi digunakan untuk menguji efek in-vitro CD(Bentenggurun pasir)padatulangpembentukan. Ekspresi mRNA alkalin fosfatase (ALP), protein morfogenetik tulang (BMP)-2, dan osteopontin (OPN) dianalisis dengan reaksi berantai polimerase waktu nyata kuantitatif. Mekanisme kerja CD(Bentenggurun pasir)ekstrak diselidiki menggunakan Western blotting. Efek anti-osteoporosis in-vivo dari CD(Bentenggurun pasir)ekstrak dinilai pada tikus ovariektomi.
Temuan Utama
CD(Bentenggurun pasir)ekstrak tidak berpengaruh pada proliferasi, migrasi, atau penyembuhan luka dari kultur osteoblas, tetapi meningkatkan ALP, BMP-2, dan OPN mRNA dan mineralisasi tulang. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) atau inhibitor faktor nuklir (NF)-kB mengurangi CD(Bentenggurun pasir)ekstrak-diinduksipembentukan tulangdan ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN. Namun, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak tidak mempengaruhi osteoklastogenesis. Selain itu, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak mencegah keropos tulang yang disebabkan oleh ovariektomi in vivo.
Kesimpulan
CD(Bentenggurun pasir)mungkin novelpembentukan tulangagen untuk pengobatan osteoporosis.
Kata kuncipembentukan tulang; Bentengdeserticola; ramuan Cina; osteoblas
Deserticola Cistanchebaik untukpembentukan tulang
pengantar
Tulang adalah jaringan kompleks yang terdiri dari beberapa jenis sel yang mengalami proses pembaruan dan perbaikan terus-menerus yang disebut 'remodeling tulang'. Dua jenis sel utama yang bertanggung jawab untuk remodeling tulang adalah osteoklas, yang menyerap tulang, dan osteoblas, yang membentuk tulang baru. Remodeling tulang diatur oleh beberapa hormon sistemik (misalnya hormon paratiroid, 1, 25-dihidroksi vitamin D3, hormon seks, dan kalsitonin) dan faktor lokal (misalnya oksida nitrat, prostaglandin, faktor pertumbuhan, dan sitokin).[1] Osteoporosis terjadi ketika resorpsi dan pembentukan tulang tidak terkoordinasi dan kerusakan tulang yang berlebihan melebihi pembentukan tulang.[2] Perawatan terkini untuk osteoporosis termasuk bifosfonat, kalsitonin, dan estrogen, yang merupakan penghambat resorpsi tulang yang mempertahankan massa tulang dengan menghambat aktivitas osteoklas.[3] Namun, efek obat ini dalam meningkatkan atau memulihkan massa tulang relatif kecil, tentu tidak lebih dari 2 persen per tahun.[3] Oleh karena itu, ada kebutuhan akan zat pembentuk tulang, seperti teriparatide, yang merangsangtulangpembentukandan memperbaiki perubahan mikroarsitektur trabekular yang merupakan karakteristik dari osteoporosis yang sudah mapan.[4,5] Karena barutulangpembentukanterutama merupakan fungsi osteoblas, agen yang bekerja dengan meningkatkan proliferasi sel-sel garis keturunan osteoblastik atau menginduksi diferensiasi osteoblas dapat meningkatkan pembentukan tulang.[5,6]
Meskipun mekanisme osteoporosis masih belum jelas, mereka kemungkinan terkait dengan penurunan ketersediaan atau efek faktor pertumbuhan tulang, seperti protein morfogenetik tulang (BMP).[7] BMP, yang secara struktural terkait dengan superfamili faktor pertumbuhan-b yang berubah, awalnya diidentifikasi oleh kapasitasnya untuk menginduksi ektopiktulang pembentukanpada hewan pengerat.[8] BMP memainkan peran penting dalamtulangpembentukandan diferensiasi sel tulang dengan merangsang aktivitas alkaline phosphatase (ALP) serta sintesis proteoglikan, kolagen, dan osteopontin (OPN).[9] Sebuah studi baru-baru ini menemukan hubungan antara osteoporosis dan polimorfisme spesifik pada gen BMP-2, ALP, dan OPN, yang menunjukkan bahwa mereka terkait dengan perkembangan osteoporosis.[10]
BentengdeserticolaBu (Orobanchaceae; disingkat CD)(Bentenggurun pasir)adalah ramuan asli di Cina dan banyak digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai agen terapi karena sifat sedatif, analgesik, dan imunostimulan. Studi farmakologi modern telah menunjukkan bahwa CD(Bentenggurun pasir)ekstrak dapat merangsang kekebalan,[12] mengais radikal bebas[13], dan meningkatkan aktivitas superoksida dismutase.[14] Agen anti-inflamasi dan antioksidan memiliki potensi untuk mengobati osteoporosis dengan meningkatkantulang pembentukandan/atau menekan resorpsi tulang.[15,16] Namun, efek CD(Bentenggurun pasir)pada fungsi sel tulang belum ditentukan. Di sini, kami melaporkan bahwa CD(Bentenggurun pasir)ekstrak tidak mempengaruhi proliferasi, migrasi, atau aktivitas penyembuhan luka dari osteoblas yang dikultur, tetapi meningkatkan ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN dan mineralisasi tulang. Selain itu, kami menunjukkan bahwa jalur pensinyalan protein kinase yang diaktifkan mitogen (MAPK) dan faktor nuklir (NF) -kB mungkin terlibat dalam peningkatan ekspresi gen dan mineralisasi tulang yang dimediasi CD. Sebaliknya, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak tidak menekan osteoklastogenesis in vitro. Khususnya, pengobatan tikus dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak mencegah keropos tulang yang disebabkan oleh ovariektomi in vivo. Data kami, oleh karena itu, menyarankan bahwa CD(Bentenggurun pasir)dapat digunakan untuk merangsangtulangpembentukanuntuk pengobatan osteoporosis.
Deserticola Cistanchemeningkatkan kekebalan
Bahan dan metode
Ekstrak dan bahan Cistanche deserticola
CD(Bentenggurun pasir)ekstrak dibeli dari Perusahaan Farmasi Chuang Song-Zong (Kaohsiung, Taiwan). Ekstraksi dan isolasi CD(Bentenggurun pasir)diikuti seperti yang dijelaskan sebelumnya (berdasarkan data spektral mereka telah mengidentifikasi komposisi kimia termasuk beta-sitosterol, daucosterol, asam suksinat, triacontanol, acteoside, betaine, dan polisakarida).[17] Antibodi poliklonal kelinci yang spesifik untuk p-extracellular signal-regulated kinases (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminal kinases (JNK), JNK, p-p65, dan p65 dibeli dari Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, AS). Kit ELISA osteocalcin dibeli dari Biosource Technology (Nivelles, Belgia). Telopeptida terminal-C dari kit ELISA kolagen tipe-I diperoleh dari Cross Laps (Herlev, Denmark). Mutan dominan-negatif p38 disediakan oleh Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Mutan dominan-negatif JNK disediakan oleh Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Mutan dominan-negatif ERK2 disediakan oleh Dr. M. Cobb (Pusat Medis Barat Daya). Semua reagen lainnya diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Budaya sel
Garis sel osteoblas murine MC3T3-E1 dibeli dari American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Sel dikultur dalam 95 persen udara, 5 persen CO2 dengan a-MEM yang dilengkapi dengan 20 mm HEPES dan 10 persen serum janin anak sapi yang tidak diaktifkan panas, 2 mm-glutamin, penisilin (100 U/ml), dan streptomisin (100 mg /ml).
Pengukuran pembentukan nodul termineralisasi
Pembentukan nodul termineralisasi dievaluasi seperti yang dijelaskan. Singkatnya, osteoblas dikultur dalam media yang mengandung vitamin C (50 mg/ml) dan b-gliserofosfat (10 mm) selama dua minggu, dan media diganti setiap tiga hari. Setelah inkubasi dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak selama 12 hari, sel-sel dicuci dua kali dengan 2 0 mm Tris-buffered saline yang mengandung 0,15 m NaCl (pH 7,4), difiksasi dalam etanol 75 persen (v/v) dingin selama 30 menit, dan udara- kering. Deposisi kalsium ditentukan dengan pewarnaan alizarin red-S. Secara singkat, sel dan matriks yang difiksasi etanol diwarnai selama 1 jam dengan alizarin red-S 40 mm (pH 4.2) dan dibilas secara ekstensif dengan air. Noda terikat dielusi dengan 10 persen (b/v) setilpiridinium klorida dan alizarin red-S dalam sampel diukur dengan mengukur absorbansi pada 550 nm dan dibandingkan dengan kurva standar. Satu mol alizarin red-S secara selektif mengikat sekitar dua mol kalsium.
Deserticola Cistanchebaik untukpembentukan tulang
Reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif
Total RNA diekstraksi dari osteoblas menggunakan kit TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Transkripsi terbalik dilakukan menggunakan 2 mg total RNA dan primer oligo(dT). [19,20] Reaksi berantai polimerase real-time kuantitatif (qPCR) dilakukan menggunakan TaqMan® satu langkah PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, AMERIKA SERIKAT). Total cDNA ditambahkan (100 ng per 25-ml reaksi) dengan primer urutan-spesifik dan probe Taqman®. Semua primer dan probe gen target dibeli secara komersial, termasuk b-aktin sebagai kontrol internal (Biosistem Terapan). uji qPCR dilakukan dalam rangkap tiga pada sistem deteksi urutan StepOnePlus (Biosistem Terapan). Kondisi bersepeda adalah 10-min aktivasi polimerase pada 95 derajat diikuti oleh 40 siklus 95 derajat selama 15 detik dan 60 derajat selama 60 detik. Ambang ditetapkan di atas latar belakang kontrol non-templat dan dalam fase linier amplifikasi gen target untuk menghitung nomor siklus di mana transkrip terdeteksi (dilambangkan CT).
Analisis Western blot
Lysates sel disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. [21,22] Protein diselesaikan dengan SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran Immobilon polivinil difluorida (Millipore, Billerica, USA). Bercak diblokir dengan 4 persen albumin serum sapi selama 1 jam pada suhu kamar dan kemudian diperiksa dengan antibodi anti-manusia kelinci terhadap p-65, atau p-p65 (1: 1000) selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah tiga kali pencucian, noda diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-kelinci keledai terkonjugasi peroksidase (1: 1000) selama 1 jam pada suhu kamar. Bercak divisualisasikan dengan peningkatan chemiluminescence menggunakan film X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Ovariektomi yang diinduksi osteoporosis
Tikus ICR betina, berumur empat minggu, 22~28 g, digunakan untuk penelitian ini. Tikus diovariektomi bilateral di bawah anestesi trikloroasetaldehida (100 mg/kg) dan tikus kontrol dioperasi palsu (Sham) untuk perbandingan. Kepadatan mineral tulang dan kandungan mineral tulang diukur setelah pemberian oral berbagai konsentrasi CD(Bentenggurun pasir)ekstrak setiap dua hari selama empat minggu. Kepadatan mineral tulang tubuh total dan kandungan mineral tulang ditentukan oleh absorptiometer sinar-X energi ganda (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) menggunakan mode untuk subjek kecil seperti yang dijelaskan sebelumnya.[18, 23] Semua protokol mematuhi pedoman kelembagaan dan disetujui oleh Komite Perawatan Hewan Universitas Kedokteran China.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Prism 4.01. (GraphPad Software Inc., San Diego, AS). Nilai yang diberikan adalah mean SEM. Analisis statistik antara dua sampel dilakukan dengan menggunakan uji-t Student. Perbandingan statistik lebih dari dua kelompok dilakukan dengan menggunakan analisis varians satu arah dengan uji posthoc Bonferroni. Dalam semua kasus, P <0,05 dianggap="">
Deserticola Cistanchebaik untukpembentukan tulang
Hasil
Benteng deserticolaekstrak meningkatkan mineralisasi tulang oleh osteoblas Penambahan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak selama 24 atau 48 jam tidak mempengaruhi proliferasi sel osteoblas tikus MC3T3-E1 dalam uji MTT (data tidak ditampilkan). Karena diferensiasi osteoblas adalah proses kompleks yang melibatkan proliferasi dan migrasi sel, kami juga menguji kemampuan migrasi sel MC3T3-E1 setelah pengobatan dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak. Menggunakan Transwell dan tes penyembuhan luka, kami menemukan bahwa CD(Bentenggurun pasir)ekstrak tidak mempengaruhi migrasi osteoblas (data tidak ditampilkan). Pembentukan nodul termineralisasi adalah salah satu penanda pematangan osteoblas. Pewarnaan Alizarin red S menunjukkan bahwa nodul termineralisasi terbentuk ketika osteoblas dikultur selama dua minggu dalam media yang mengandung vitamin C (50 ug/ml) dan -gliserofosfat (10 mm), cara yang bergantung pada konsentrasi dengan penambahan CD(Bentenggurun pasir)(Gambar 1a). Oleh karena itu, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak menginduksi pembentukan nodul tulang oleh osteoblas yang dikultur, tetapi bukan proliferasi atau migrasinya. Kami juga memeriksa peran CD(Bentenggurun pasir)ekstrak dalam osteoklastogenesis yang diinduksi RANKL tetapi tidak menemukan efek (data tidak ditampilkan).
Ekstrak Cistanche deserticola meningkatkan alkaline phosphatase, protein morfogenetik tulang-2, dan ekspresi osteopontin dalam osteoblas yang dikultur
Osteoblas yang berdiferensiasi menunjukkan aktivitas ALP yang meningkat, yang berkorelasi dengan tingkat ekspresi enzim yang tinggi.[18] Kami menemukan bahwa pengobatan dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak selama 72 jam secara signifikan meningkatkan aktivitas ALP osteoblas (Gambar 1b). Mengingat peran penting BMP-2, ALP, dan OPN dalam diferensiasi osteoblas, kami menguji apakah CD(Bentenggurun pasir)ekstrak memberikan efeknya pada diferensiasi osteoblas dengan mengatur ekspresi BMP-2, ALP, dan OPN. Perawatan sel dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak meningkatkan ekspresi mRNA ALP, BMP-2, dan OPN dengan cara yang bergantung pada konsentrasi (Gambar 1c), menunjukkan bahwa CD(Bentenggurun pasir)ekstrak menginduksi diferensiasi osteoblas dengan meregulasi ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN.
Ekstrak Cistanche deserticola meningkatkan pembentukan nodul tulang melalui jalur protein kinase yang diaktifkan mitogen
Telah dilaporkan bahwa MAPK memainkan peran penting dalamtulangpembentukan[24,25] jadi kami selanjutnya memeriksa apakah jalur pensinyalan ini terlibat dalam CD(Bentenggurun pasir)mineralisasi tulang yang diinduksi ekstrak. Pretreatment sel dengan ERK inhibitor U0126, p38 inhibitor SB203580, atau JNK inhibitor SP600125 mengurangi CD(Bentenggurun pasir)ekstrak-meningkatkan mineralisasi tulang (Gambar 2a, 3a, dan 4a). Selanjutnya, inhibitor juga memblokir CD(Bentenggurun pasir)ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN yang diinduksi ekstrak (Gambar 2b–4c). Transfeksi sel dengan ERK2, p38, atau JNK mutan tereduksi CD(Bentenggurun pasir)ekstrak-peningkatan ekspresi mRNA ALP, BMP-2, dan OPN (Gambar 2c, 3c, dan 4c). Selanjutnya, kami langsung memeriksa aktivasi ERK, p38, dan JNK setelah CD(Bentenggurun pasir)ekstrak pengobatan. Inkubasi sel dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak menginduksi fosforilasi ERK, p38, dan JNK (Gambar 2d, 3d, dan 4d). Oleh karena itu, ERK, p38, dan JNK memediasi peningkatantulangpembentukandiinduksi oleh CD(Bentenggurun pasir)pengobatan osteoblas.
Ekstrak Cistanche deserticola meningkatkan pembentukan nodul tulang melalui jalur faktor-kB nuklir
Seperti disebutkan sebelumnya, aktivasi NF-kB diperlukan untuktulangpembentukan[26,27] Kami selanjutnya merawat osteoblas dengan penghambat NF-kB pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) dan N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) dibeli dari Calbiochem (Darmstadt, Jerman) untuk menentukan apakah aktivasi NF-kB adalah terlibat dalam CD(Bentenggurun pasir)mineralisasi tulang yang diinduksi ekstrak. Gambar 5a menunjukkan bahwa pretreatment osteoblas dengan PDTC atau TPCK menghambat CD(Bentenggurun pasir)pembentukan nodul tulang yang diinduksi ekstrak, dan juga mengurangi peningkatan ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN (Gambar 5b dan 5c). Fosforilasi subunit NF-kB p65 merupakan indikator aktivasi NF-kB;[28] konsisten dengan ini, kami menemukan bahwa CD(Bentenggurun pasir)ekstrak meningkatkan fosforilasi p65 dalam osteoblas (Gambar 5d). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi NF-kB penting untuk ekspresi ALP, BMP-2, dan OPN yang diinduksi ekstrak CD dan pembentukan nodul tulang.
Gambar 4 Keterlibatan c-Jun N-terminal kinase (JNK) dalamBentengdeserticola(CD) ekstrak mineralisasi tulang yang diinduksi dalam osteoblas. (a) Sel disepuh dalam 24-piring sumur dan dikultur dalam media yang mengandung vitamin C (50 mg/ml) dan b-gliserofosfat (10 mM) selama dua minggu. Sel-sel secara bersamaan diobati dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak (26 mg/ml) ditambah SP600125 (3 mM). Pembentukan nodul termineralisasi dinilai dengan pewarnaan alizarin red-S (n=5). (b, c) Sel diberi perlakuan awal dengan SP600125 selama 30 menit atau ditransfeksi dengan mutan JNK atau 24 jam diikuti dengan stimulasi dengan ekstrak CD, dan aktivitas alkaline phosphatase (ALP) dan ALP, protein morfogenetik tulang (BMP)-2 dan Ekspresi mRNA osteopontin (OPN) diukur dengan kit ALP dan reaksi berantai polimerase waktu nyata kuantitatif. ( d ) Sel diperlakukan dengan ekstrak CD untuk interval waktu yang ditunjukkan, dan ekspresi p-JNK diperiksa dengan Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Bentenggurun pasir)kelompok yang diberi ekstrak.
Penghambatan pengeroposan tulang oleh ekstrak Cistanche deserticola pada tikus yang diovariektomi
Untuk menguji efek CD(Bentenggurun pasir)ekstrak pada pengeroposan tulang, osteoporosis diinduksi pada tikus betina dengan ovariektomi. Seperti yang diharapkan, tikus yang diovariektomi menunjukkan penurunan kepadatan mineral tulang tubuh total dan kandungan mineral tulang (Gambar 6a dan 6b). Perawatan dengan CD(Bentenggurun pasir)ekstrak selama empat minggu menghambat hilangnya kepadatan mineral tulang dan kandungan mineral tulang dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 6a dan 6b). Konsentrasi darah ALP dapat mencerminkan aktivitas osteoblastik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6c, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak menghambat penurunan aktivitas ALP serum yang disebabkan oleh ovariektomi. Selain itu, CD(Bentenggurun pasir)ekstrak juga meningkatkan tingkat osteocalcin, penandatulangpembentukan, dan mengurangi tingkat telopeptida terminal-C dari kolagen tipe-I, penanda resorpsi tulang (Gambar 6d dan 6e). Temuan ini dengan demikian mendukung potensi dan kemanjuran CD(Bentenggurun pasir)ekstrak dalam mencegah keropos tulang in vivo.
Gambar 6 Penghambatan ovariektomi-menginduksi penurunan kepadatan mineral tulang dan kandungan mineral tulang olehBentengdeserticola(CD) ekstrak. Tikus ICR betina diberi operasi palsu atau diovariektomi. Tikus ovariektomi diobati dengan konsentrasi CD . yang ditunjukkan(Bentenggurun pasir)ekstrak dengan makan oral. Kepadatan mineral tulang tubuh total (a), kandungan mineral tulang (b), aktivitas serum alkaline phosphatase (ALP) (c), serum osteocalcin (d), dan telopeptida terminal-C serum dari kolagen tipe I (e), ditentukan empat minggu setelah operasi. Data disajikan sebagai rata-rata SE, n=8–10 tikus/kelompok. *P < 0.05,="" dibandingkan="" dengan="" palsu;="" #p="">< 0,05,="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" yang="">
DISKUSI
Klik di sini untuk informasi tentang Bagian II (Diskusi dan Kesimpulan) artikel ini.
Dari: 'Bentengdeserticolaekstrak meningkattulangpembentukandalam osteoblas olehTe-Mao Liadkk
---© 2012 Penulis. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Jurnal Farmasi dan Farmakologi, 64, hlm. 897–907
