Kloning Gen, Identifikasi Fungsional, Analisis Struktural Dan Ekspresi Sukrosa Sintase Dari Cistanche Tubulosa Ⅱ

Hasil dan analisis

1 Penambangan dan kloning gen sukrosa sintase di Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>bagian udara.

Oleh karena itu, nilai tingkat ekspresi FPKM dari dua kandidat gen sukrosa sintase yang diperoleh pada penyaringan awal dalam data transkriptome dari berbagai bagian Cistanche tubulosa dinormalisasi dengan Z-Score dan analisis diferensial dilakukan (Gambar 1A). Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen CtSus memiliki tingkat ekspresi tertinggi di haustorium, dan tingkat ekspresi di bagian bawah tanah lebih tinggi dibandingkan di bagian udara, hal ini sesuai dengan pola akumulasi senyawa glikosida di berbagai bagian Cistanche tubulosa. sedangkan tingkat ekspresi gen CtSus1 di haustorium rendah. Oleh karena itu, berdasarkan hasil di atas, gen CtSus dipilih untuk amplifikasi sekuens selanjutnya, ekspresi eksogen dan identifikasi fungsional. Menggunakan cDNA Cistanche tubulosa sebagai templat, produk pita tunggal diperoleh pada ~2500 bp setelah amplifikasi PCR (Gambar 1B). Produk PCR diperoleh dari gel dan diikat ke vektor kloning, dan wilayah pengkodean lengkap dari gen target diperoleh dengan mengurutkannya. Panjang sekuens CtSus adalah 2418 bp.

Gambar 1 Eksplorasi gen dan kloning CtSus dari C. tubulosa dan analisis bioinformatik dari protein yang dikodekannya. A: Tingkat ekspresi gen CtSus dan CtSus1 di berbagai bagian C. tubulosa dinormalisasi sebagai Z-Scores berdasarkan nilai FPKM-nya; B: Amplifikasi gen CtSus; M: Penanda DNA; C: Domain konservatif protein CtSus yang diprediksi oleh SMART; D: Penyelarasan beberapa urutan CtSus dan sintase sukrosa diidentifikasi dari tanaman lain termasuk Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum dan Albuca bracteata. Domain sintesis sukrosa dan domain transfer gula masing-masing diwakili oleh kotak merah dan biru; E: Analisis filogenetik CtSus dan sucrosesynthases dari tanaman lain; F: Analisis SDS-PAGE ekspresi heterolog CtSus menggunakan vektor pCold™ I pada E. coli. Jalur 1: Penanda protein; Jalur 2: Fraksi supernatan; Jalur 3: Fraksi endapan. Panah merah menunjukkan protein CtSus. G: Koloni PCR dari satu klon yang mengandung kedua plasmid rekombinan. M: penanda DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

HETIAN DICHEN CISTANCHE BUDAYA BAESES BEKERJASAMA DENGAN UNIVERSITAS PEKING

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

KLIK UNTUK DETAIL LEBIH LANJUT

2 Analisis bioinformatika gen CtSus dan protein yang dikodekannya

2.1 Analisis sifat fisikokimia CtSus dan prediksi struktur domain transmembran

Sifat fisikokimia protein yang dikodekan CtSu dianalisis menggunakan perangkat lunak online ProtParam. Protein tersebut mengandung 805 asam amino, dengan rumus molekul C4189H6548N1104O1187S28 dan massa molekul relatif 92266,44; titik isoelektrik teoritis adalah 6.00; koefisien ketidakstabilan II sebesar 35,45 yang merupakan protein stabil; hidrofilisitas rata-rata keseluruhan (GRAVY) adalah −0,187, yang merupakan protein hidrofilik. MHMM 2.0 digunakan untuk memprediksi domain transmembran sukrosa sintase CtSus, dan hasilnya menunjukkan bahwa protein yang dikodekan oleh gen ini tidak memiliki domain transmembran.

HETIAN DICHEN CISTANCHE BUDAYA BAESES BEKERJASAMA DENGAN UNIVERSITAS PEKING

2.2 Prediksi struktur konservatif CtSu dan penyelarasan urutan

Perangkat lunak online SMART digunakan untuk memprediksi domain konservatif protein CtSus (Gambar 1C). Protein mengandungi dua domain konservatif. N-terminus (asam amino 8 hingga 553) adalah domain sukrosa sintase, yang dapat mengkatalisis reaksi reversibel UDP dan sukrosa untuk menghasilkan UDP-glukosa dan D-fruktosa; C-terminus (asam amino 557 hingga 739) termasuk dalam domain glikosiltransferase (Gambar 1D). Perangkat lunak DNAMAN digunakan untuk menyelaraskan urutan protein CtSus dengan urutan asam amino sukrosa sintase dalam database NCBI (Tabel 2). Hasil penelitian menunjukkan bahwa rangkaian asam amino CtSus menunjukkan kemiripan yang tinggi dengan rangkaian sukrosa sintase dari tumbuhan lain. Kemiripan tertinggi antara CtSus dengan rangkaian sukrosa sintase dari tanaman wijen (Sesamum indicum) sebesar 94,78%, dan kemiripan dengan rangkaian sukrosa sintase dari tanaman lain juga diatas 65%, hal ini menunjukkan bahwa tingkat kemiripan sukrosa sintase dari tanaman cukup tinggi. konservasi.

Tabel 2 Kemiripan urutan asam amino antara CtSus dan sukrosa sintase yang diidentifikasi dari tanaman lain

2.3 Analisis filogenetik

Pohon filogenetik yang dibangun oleh perangkat lunak MEGA digunakan untuk menganalisis hubungan filogenetik antara sukrosa sintase CtSus dari Cistanche tubulosa dan sukrosa sintase dari tanaman lain. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 1E. Sintase sukrosa dari tumbuhan menunjukkan cabang evolusi yang berbeda pada dikotil (wilayah I dan II) dan monokotil (wilayah III). CtSus berada pada cabang dikotil, dan sekuens yang berkerabat dekat dengan CtSus semuanya berasal dari tumbuhan Lamiaceae (Cistanche tubulosa merupakan tumbuhan Lamiaceae Orobanchaceae), sedangkan cabang lainnya sebagian besar terdiri dari tumbuhan Solanales, yang selanjutnya menunjukkan tingginya konservasi dan homologi. gen sukrosa sintase yang diturunkan dari tumbuhan dalam evolusi tumbuhan dalam urutan yang sama. Diantaranya, sukrosa sintase PrSus (AEN79500.1) dari Phelipanche ramosa tanaman Orobanchaceae adalah yang paling dekat dengan CtSus.

3 Ekspresi eksogen dan analisis aktivitas CtSus

3.1 Ekspresi eksogen gen CtSus

Plasmid pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus dan pCold™ I-CtSus yang diverifikasi melalui pengurutan ditransfer ke dalam ekspresi kompeten E. coli Transetta (DE3), dan klon positif disaring oleh PCR koloni untuk verifikasi pengurutan. Strain ekspresi rekombinan yang diperoleh diinduksi oleh IPTG suhu rendah untuk ekspresi protein, dan bakteri dikumpulkan dengan sentrifugasi. Buffer lisis ditambahkan untuk memecah bakteri untuk mendapatkan supernatan dan endapan, dan SDS-PAGE dilakukan untuk deteksi. Hasilnya menunjukkan bahwa ketika pET-28a dan pET-24b digunakan sebagai vektor ekspresi, CtSus tidak diekspresikan dalam E. coli, sedangkan ketika pCold™ I digunakan sebagai vektor ekspresi, CtSus jelas pita protein rekombinan terdeteksi di wilayah ~100 kDa, yang konsisten dengan perkiraan massa molekul relatif secara teoritis sebesar 92,2 kDa (Gambar 1F).

HETIAN DICHEN CISTANCHE BUDAYA BAESES BEKERJASAMA DENGAN UNIVERSITAS PEKING

3.2 Transformasi sel utuh

Untuk memverifikasi terlebih dahulu fungsi katalitik CtSus, strain koekspresi CtSus dan gen glikosiltransferase UGT71BD1 dibuat. UGT71BD1 diklon dan diidentifikasi dari Cistanche tubulosa dan merupakan UDP-glukosiltransferase yang dapat secara luas menerima senyawa aromatik seperti glikosida feniletanoid, berbagai jenis flavonoid, stilbene dan kumarin sebagai reseptor dan mengkatalisis reaksi glukosilasi substrat gugus hidroksil fenolik menggunakan UDP-glukosa sebagai donor gula[18]. Pengenalan CtSus secara teoritis dapat memberikan donor glikosil UDP-glukosa yang lebih cukup untuk reaksi glukosilasi yang dikatalisis oleh UGT71BD1, sehingga mendorong kesetimbangan reaksi menuju pembentukan produk glikosilasi, sehingga meningkatkan hasil produk glikosilasi. Plasmid pCold™ I-CtSus dan plasmid pET-28a-UGT71BD1 secara bersamaan diubah menjadi ekspresi kompeten E. coli Transetta (DE3). Klon tunggal yang mengandung kedua plasmid rekombinan disaring dengan PCR koloni, dan strain ekspresi rekombinan positif diperoleh dengan mengurutkan verifikasi (Gambar 1G). Koekspresi gen ganda diinduksi secara in vitro, dan strain ekspresi gen tunggal pET-28aUGT71BD1 digunakan sebagai kelompok kontrol. Aktivitas CtSus dalam mengkatalisis pembentukan donor UDP-glukosa pada awalnya diverifikasi oleh transformasi sel utuh. Hasil HPLC dan spektrometri massa resolusi tinggi menunjukkan bahwa ketika reaksi transformasi seluruh sel dilakukan dengan substrat aesculetin 1 dan resveratrol 2, pembentukan produk glikosilasi yang jelas terdeteksi setelah 24 jam transformasi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.

Gambar 2 Biotransformasi sel utuh substrat 1 atau 2 oleh strain rekombinan yang masing-masing mengandung UGT71BD1 atau strain rekombinan yang menampung UGT71BD1 yang digabungkan dengan CtSus. A: Kromatogram HPLC dari biotransformasi seluruh sel substrat 1. Panjang gelombang deteksi adalah 360nm; B: spektrum HRESI-MS dan MS2 produk 1a; C: Kromatogram HPLC dari biotransformasi seluruh sel substrat 2; Panjang gelombang deteksi adalah 330 nm. D: Spektrum HRESI-MS produk 2a dan 2b

Ketika 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, rumus molekul C9H6O4) digunakan sebagai substrat, puncak kromatografi produk 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, prediksi rumus molekul C15H16O9) terdeteksi pada menit 5,39, yang konsisten dengan serapan UV pada substrat dan produk kontrol. Pada saat yang sama, puncak fragmen m/z 179.033 4 [M+H]+ terdeteksi dalam spektrum MS2 1a, yang dihasilkan oleh 1a yang kehilangan molekul glukosa (162 Da), yang menunjukkan bahwa 1a adalah produk substrat 1 yang terhubung ke molekul glukosa. Tingkat konversi dihitung dengan mengintegrasikan area puncak. Ditemukan bahwa laju konversi seluruh sel UGT71BD1 yang mengkatalisis substrat 1 untuk menghasilkan produk glikosilasi 1a adalah 71,87%, sedangkan penambahan CtSus meningkatkan laju konversi reaksi menjadi 95,84%, yaitu 1,3 kali lipat dari kelompok kontrol. Jika substratnya adalah senyawa 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, rumus molekul C14H12O3), kromatografi produk mencapai puncak 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, prediksi molekuler formula C20H22O8) dan 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, prediksi rumus molekul 26H32O13) terdeteksi masing-masing pada 10,32 dan 6,52 menit, yang konsisten dengan karakteristik penyerapan UV pada substrat dan produk kontrol. Puncak fragmen terdeteksi pada 227.071 3 [MH]-, yang dihasilkan oleh hilangnya satu molekul glukosa (162 Da), menunjukkan bahwa 2a adalah produk substrat 2 yang terhubung ke satu molekul glukosa. Dengan membandingkan data dalam literatur [18] dan informasi prediksi spektrometri massa, ditentukan bahwa produk 2b adalah produk substrat 2 yang terhubung ke dua molekul glukosa. Tingkat konversi dihitung menggunakan area puncak terintegrasi. Diketahui penambahan CtSus dapat meningkatkan laju konversi reaksi glikosilasi substrat 2 dari 64,01% menjadi 78,51%, diantaranya rendemen produk monosakarida 2a meningkat dari 45,09% menjadi 63,58%, dan rendemen produk disakarida 2b berubah dari 18,92% menjadi 14,93%.

3

HETIAN DICHEN CISTANCHE BUDAYA BAESES BEKERJASAMA DENGAN UNIVERSITAS PEKING

3.3 Csus

Pemurnian protein rekombinan dan identifikasi aktivitas katalitik enzim in vitro Hasil percobaan konversi seluruh sel menunjukkan bahwa CtSus memiliki aktivitas mengkatalisis produksi donor glukosa aktif UDP-glukosa. Untuk memverifikasi lebih lanjut aktivitas katalitik melalui katalisis enzimatik in vitro, protein fusi gen CtSus dalam sistem ekspresi pCold™ dipisahkan dan dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Hasilnya menunjukkan bahwa ketika pCold™ I digunakan sebagai vektor ekspresi, protein rekombinan diekspresikan dalam jumlah besar, namun sebagian besar dalam endapan. Ketika pCold™ TF digunakan sebagai vektor ekspresi, gen CtSus diekspresikan dalam jumlah besar di E. coli (Gambar 3A). Protein fusi dimurnikan dengan kromatografi afinitas HisTrap FF untuk reaksi enzimatik in vitro. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 3B. Ketika sukrosa dan UDP digunakan sebagai substrat, dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif, puncak produk baru terdeteksi pada 10,32 menit. Waktu retensi dan penyerapan UV konsisten dengan UDP-glukosa. Produk tersebut terbukti merupakan UDP-glukosa jika dibandingkan dengan standar. Namun, karena protein fusi yang diekspresikan oleh vektor ekspresi pCold™ TF mengandung tag larut faktor pemicu yang besar (ukuran protein tag adalah 48 kDa), hal ini akan berdampak besar pada aktivitas katalitik protein. Oleh karena itu, tag protein fusi selanjutnya dipotong oleh enzim Faktor Xa, dan protein CtSus tanpa tag eksogen dimurnikan (Gambar 3A). Protein tersebut dikenai katalisis enzimatik in vitro, dan hasilnya menunjukkan bahwa hasil UDP-glukosa meningkat dari 3,53% menjadi 10,66% (Gambar 3B). Hasil di atas mengkonfirmasi aktivitas CtSus dalam mengkatalisis produksi UDP-glukosa melalui katalisis enzimatik in vitro, dan juga menunjukkan bahwa keberadaan tag afinitas yang besar kondusif untuk ekspresi larut CtSus, tetapi juga akan mempengaruhi secara signifikan dalam aktivitas katalitik enzim secara vitro.

Gambar 3 Ekspresi heterolog dan identifikasi fungsional CtSus. A: Analisis SDS-PAGE protein CtSus. Jalur 1: Penanda protein; Jalur 2: CtSus Rekombinan dengan faktor pemicu; Jalur 3: Pembelahan tag trigger13factor menggunakan protease Faktor Xa untuk menghasilkan protein CtSus yang diberi label panah merah. B: Uji enzimatik invitro menggunakan protein fusi dan memicu protein CtSus bebas faktor untuk mengkatalisis sintesis UDP-glukosa dengan adanya sukrosa dan UDP, masing-masing, dengan referensi standarUDP-glukosa. Protein rebus digunakan sebagai kelompok kontrol dalam kondisi yang sama. Panjang gelombang deteksi adalah 260 nm