Bagaimana Mempelajari Keanekaragaman Genetik Herba Cistanches?

Kajian Keanekaragaman Genetik Herba Cistanches oleh RAPD

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medicine, Beijing 100700)

Abstrak

Tujuan:Untuk mempelajari populasikeragaman genetikdariCistanche deserticoladanCistanche tubulosa.

Metode:Dua populasi liar dariCistanche deserticoladan empat populasi liar dariCistanche tubulosadianalisis dengan RAPD, dankeragaman genetikdari populasi dianalisis dengan perangkat lunak POPGENE versi 1.31.

Hasil:Persentase rata-rata lokus polimorfikCistanche deserticolaadalah 47,37 persen , lokus polimorfik dari dua populasi adalah 39,47 persen dan 35,53 persen , dan rata-rata keragaman gen Nei adalah 0.135 8. Shannon's lebih. Indeks informasi status adalah 0.207 2, dan koefisien diferensiasi gen Gst {{1{{20}}}}.254 6. Persentase rata-rata lokus polimorfik di Cistanche adalah 27,59 persen, dan persentase lokus polimorfik pada setiap populasi berkisar antara 19,54 persen hingga 25,29 persen, di mana populasi Andier paling tinggi 25,29 persen, dan rata-rata keragaman gen Nei adalah 0. { {21}}, indeks informasi polimorfisme Shannon adalah 0,1258, koefisien diferensiasi gen Gst =0.175 5.

Kesimpulan:Cistanche deserticoladanCistanche tubulosamemiliki diferensiasi tertentu di antara populasi. Itukeragaman genetikDesert Cistanche secara signifikan lebih tinggi daripada Cistanche tubulosa dan telah berdiferensiasi menjadi dua ekotipe.

Kata kunci: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; keragaman genetik

[Nomor Klasifikasi Perpustakaan China] S 567 [Kode Identifikasi Dokumen] A [Nomor Artikel] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche adalah tanaman parasit milik genus Cistanche dalam keluarga Lidanaceae, juga dikenal sebagai Dayun, yang merupakan bahan obat Cina yang berharga. Tanaman sumber utama Cistanche deserticola di negara saya adalahCistanche deserticolaYCMa dan C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Tanaman inang dari Cistanche deserticola adalah Haloxylon ammodendron dan Haloxylon ammodendron, yang terutama didistribusikan di Liga Alashan di Mongolia Dalam, Xinjiang utara, Qinghai, Gansu, dan tempat-tempat lain. Distribusi Cistanche deserticola sama dengan tanaman inangnya. Di negara saya, Cistanche cistanche hanya didistribusikan di kabupaten sekitar Gurun Taklimakan di selatan Pegunungan Tianshan di Xinjiang, dan distribusinya tidak sepenuhnya sinkron dengan host Tamarix. Daerah lain seperti Xinjiang utara, Gansu, Qinghai, Ningxia, Mongolia Dalam, Shaanxi, dan tempat lain Tanaman Tamarix bukanlah Cistanche Tubula parasit [2]. Karena peningkatan pesat dalam permintaan Cistanche dalam beberapa tahun terakhir, yang mengakibatkan kepunahan sumber dayanya, sumber daya cistanche liar telah menyusut menjadi hanya beberapa daerah penghasil utama. Keduanya telah terdaftar sebagai spesies tanaman dilindungi yang terancam punah di negara saya [3], di antaranyaCistanche deserticolatelah dimasukkan dalam CITES Appendix II [4].

Setelah beberapa tahun penelitian, penelitian tentang pemuliaan buatan Cistanche telah berhasil, dan sedang dalam tahap promosi dan penanaman skala besar. Namun, bagaimana mencegah penurunan spesies Cistanche selama produksi industri, bagaimana memulihkan populasi liar yang terbatas sesegera mungkin, dan melestarikan sumber daya plasma nutfah liar yang berharga, adalah kunci untuk mencapai pemanfaatan yang berkelanjutan. Adapun warisan yang dilindungi dari Cistanche [Tanggal Diterima], 2004-03-11 [Proyek Dana] Proyek Kesejahteraan Sosial Kementerian Sains dan Teknologi (2001.109); Proyek "Rencana Lima Tahun" Kementerian Sains dan Teknologi (2001BA701A09a) [Penulis koresponden] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net Studi tentang transmisi masih kosong. Penelitian ini menggunakan teknologi RAPD untuk mempelajari 2 populasi liarCistanche deserticoladan 4 populasi liarCistanche tubulosa, dan menganalisis keduanya Perbedaankeragaman genetikdiharapkan memberikan dasar genetik eksperimental yang penting untuk perlindungan Cistanche, obat Cina yang berharga.

cistanche

1. Bahan dan metode

1.1 Bahan

Cistanche deserticoladikumpulkan dari Kabupaten Jimsar di Xinjiang dan daerah Jilantai dari Liga Alxa Kuno di Mongolia Dalam. Populasi Cistanche dikumpulkan dari Kabupaten Minfeng dan Kabupaten Yutian, Xinjiang. Kabupaten Minfeng saat ini merupakan daerah dengan hasil terbesar dari Cistanche cistanche, dengan kepadatan tertinggi dan komunitas hutan alam yang relatif lengkap. Titik pengambilan sampel Andil, Sawuzek, Yatangguz, dan Daheyan Kabupaten Yutian merupakan daerah produksi utama, yang terletak di Sungai Andir, Sungai Yeyike, Sungai Yatangguzi, dan Kelaniya Di bagian hilir sungai, jarak antar populasi lebih dari 50 km. Setiap populasi mengambil sampel 19-30 individu secara acak. Sampel dikeringkan dengan cepat dalam silika gel dan digunakan untuk ekstraksi DNA (Tabel 1).

Tabel 1 Populasi sampel dan daerah penghasil Cistanche deserticola dan Cistanche tubulosa

1.2 ekstraksi DNA

Metode ekstraksi DNA total menggunakan metode garam tinggi, pH rendah [5]. Sampel DNA menjadi sasaran spektrofotometer untuk mendeteksi konsentrasi template DNA, kemudian elektroforesis gel agarosa 1 persen, pewarnaan EB, pengamatan dan fotografi di bawah sinar ultraviolet, DNA elektroforesis dengan pita yang jelas, dan sedikit tailing digunakan untuk analisis RAPD.

1.3 Penyaringan primer RAPD

Sejak percobaan menemukan bahwa primer yang sama memiliki efek yang tidak memuaskan pada amplifikasi simultan keduanyaCistanche deserticoladan Cistanche tubulosa, primer disaring secara independen. 150 primer acak (10 bp), sistem reaksi 25 L Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. digunakan untuk amplifikasi dan penyaringan; masing-masing primer menggunakan 2 template populasi dan 1 air suling ganda yang disterilkan sebagai kontrol kosong, dan diperoleh 10 primer untuk amplifikasi Cistanche deserticola dengan pita yang jelas, polimorfisme yang kuat, dan pengulangan yang baik: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 primer dariCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 amplifikasi PCR dan deteksi produk

Primer yang dipilih digunakan untuk mengamplifikasi DNA template dariCistanche deserticoladanCistanche tubulosaoleh PCR. DNA genom diencerkan menjadi 50 ng·μL -1 sesuai dengan konsentrasi yang diukur sebagai cetakan. Total volume reaksi adalah 25 L, dimana 10 × PCR Buffer 2.5 L, Mg2 plus 1.5 L, Taq (5 U·μL -1) 0.2 L, dNTP Mixture (masing-masing 2.5 mM) 1 L, 5 M Primer 1 L, template DNA 1 L, air suling ganda yang disterilkan 18,8 L, larutan amplifikasi PCR di atas adalah produk Shanghai Sangon. Amplifikasi dilakukan pada siklus termal PTC-100. Program amplifikasi adalah pra-denaturasi 94 derajat selama 5 menit dan kemudian 40 siklus. Setiap siklus termasuk 94 derajat 45 detik, 34 derajat 1 menit, 72 derajat 1 menit 30 detik, dan akhirnya Perpanjang pada 72 derajat selama 5 menit. Produk yang diperkuat dielektroforesis pada gel agarosa 2,0 persen (mengandung EB) dalam buffer 1 × TAE dan diamati dan difoto di bawah sistem pencitraan gel SYNGENE.

1.5 Statistik dan analisis data

Dalam spektrum elektroforesis, posisi yang sesuai dari produk reaksi pada gel dibandingkan menurut standar berat molekul, dan berat molekul produk yang diperkuat diperkirakan. Pita dengan pita dicatat sebagai 1, dan pita tanpa pita dicatat sebagai 0, membentuk grafik matriks 0/1 dan memasukkan ke komputer, menggunakan POPGENE32 untuk menghitung Persentase situs polimorfik (PPL) setiap populasi, indeks keragaman gen Nei (H), indeks informasi polimorfisme Shannon (I), koefisien diferensiasi gen (Gst), keragaman gen (Ht),Keanekaragaman genetik(Hs), identitas genetik Nei (1978) (I) dan jarak genetik (D) dalam suatu populasi, dan analisis klaster dilakukan dengan menggunakan metode UPGMA.

2. Hasil dan Analisis

2.1 Keragaman genetik Cistanche

Semua sampel diperoleh pita dengan berat molekul berkisar antara 200 hingga 2 200 bp (Gambar 1, 2). Sebanyak 76 lokus terdeteksi pada 60 sampel dari 2 populasiCistanche deserticola, 36 di antaranya adalah lokus polimorfik, terhitung 47,37 persen , H=0.135 8, I=0.207 2. Di antaranya, PPL Jimsar 39,47 persen, dan PPL Gilanty 35,53 persen. H adalah 0. 0 95 3 dan 0.1 070 berturut-turut, dan saya adalah 0.15 12 dan 0.163 7 masing-masing. Sebanyak 87 lokus terdeteksi pada {{20}} individu dari 4 populasi Cistanche, 24 di antaranya adalah lokus polimorfik, terhitung 27,59 persen , H=0.084 8, Saya=0.1278. PPL tertinggi adalah Andil sebesar 25,29 persen, sedangkan PPL terendah di Savuzek dan Yatungusi (keduanya 19,54 persen). H adalah 0.062 1 -0.080 0, saya adalah 0.095 0 -0.116. Ukuran H dan I konsisten dengan tren ukuran PPL masing-masing populasi, dan koefisien terbesar di Andier, diikuti oleh Dayan. Dalam kasus PPL yang sama, H Savuzek=0.{{40}} Jumlah I=0.097 0 sedikit lebih tinggi dari 0.{{44 }} dan 0.095 0 dari Yatunguska (Tabel 2).

Gambar 1 pita amplifikasi RAPD dari beberapa sampel gurunCistanche deserticola, primer S490 1-10. sampel jaminan; 11-20. Sampel Jimpster Penanda M-DNA (200 - 2 000 bp)

Gambar 2 Pita amplifikasi RAPD dari beberapa sampel Cistanche Tubulosa, primer S2 042 1-20. sampel Xinjiang Andier Penanda M-DNA (200 - 2 000 bp)

Tabel 2keragaman genetikdariCistanche deserticoladanCistanche tubulosapopulasi

2.2 Analisis variasi genetik Cistanche

Menurut tingkatkeragaman genetikdalam populasi (Hs), diferensiasi antar populasi (Dst), dan proporsi perbedaan genetik antar populasi dalam total perbedaan genetik (Gst), dapat dilihat bahwa keragaman genetik total Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, di mana Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, di antaranya Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabel 3). Hasil di atas menunjukkan bahwa ada tingkat variasi genetik tertentu di antara populasi. Variasi antara populasi gurun Cistanche deserticola menyumbang 25,46 persen dari total variasi, dan variasi populasi Cistanche tubulosa menyumbang 17,55 persen dari total variasi.

Tabel 3 Analisis variasi genetikCistanche deserticoladanCistanche tubulosa.

2.3 Jarak genetik dan analisis klaster di antara populasi Cistanche deserticola

Jarak genetik kedua populasiCistanche deserticolaadalah {{0}}.080 0, dan identitas genetiknya adalah 0.9231. Jarak genetik keempat populasi Cistanche adalah 0.012 0-0.031 5, dan identitas genetiknya adalah 0.9690-0.988 1 (Tabel 4) . Pengelompokan individu Cistanche deserticola dan cistanche tubulosa menunjukkan bahwa Cistanche deserticola dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok yang berbeda menurut populasi, sedangkan individu cistanche tubulosa yang berbeda tidak dapat dikelompokkan berdasarkan populasi, yang juga menunjukkan bahwa diferensiasi genetik antara Cistanche deserticola populasinya relatif tinggi. Besar, tetapi diferensiasi genetik di antara populasi Cistanche tubulosa kecil.

Tabel 4 Identitas genetik (kiri bawah) dan jarak genetik (kanan atas)cistanche tubulosa.

3. Diskusi

3.1 Keragaman genetik Cistanche

tingkatkeragaman genetikTumbuhan tidak terlepas dari sifat biologis, habitat, asal usul, dan evolusinya. Diantaranya, sistem pemuliaan, jangkauan distribusi, bentuk kehidupan, dan metode penyebaran serbuk sari dan biji memiliki pengaruh paling besar [6]. Menurut hasil statistik data alozim dari 499 spesies tanaman dalam 165 genera oleh Ge Song et al. [7], polimorfisme Cistanche pada tingkat spesies harus sekitar 50 persen , dan polimorfisme pada tingkat populasi harus sekitar 40 persen . Sekitar 0,17. Tingkat polimorfisme yang diperoleh dalam percobaan ini semuanya lebih rendah dari nilai rata-rata tersebut. Pada saat yang sama, dibandingkan dengan tingkat lokus polimorfik yang diperoleh dengan metode RAPD untuk beberapa tanaman langka yang umum, seperti 32 persen spesies yang terancam punah Silver Fir[18], 22,5 persen peoni kerdil, dan 27,6 persen peoni ungu. [9] ] Dapat dilihat bahwa keragaman genetikCistanche deserticola sedikit lebih rendah dari rata-rata, sedangkan keragaman genetik Cistanche tubulosa sudah sangat rendah.

3.2 Alasan rendahnya keragaman genetik Cistanche

Cistanche adalah tanaman parasit tertentu, didistribusikan di daerah gurun yang sempit pada waktu yang sama. Oleh karena itu, gaya hidup yang unik dan ruang tinggal yang relatif sempit mungkin menjadi alasan yang melekat mengapakeragaman genetikdari Cistanche umumnya lebih rendah dari tanaman biasa.

Perbedaannyakeragaman genetikantara Cistanche deserticola dan Cistanche tubulosa mungkin terkait dengan perbedaan rentang distribusi keduanya dan apakah mereka disinkronkan dengan distribusi inang. Area distribusi Cistanche tubulosa secara signifikan lebih kecil daripada Cistanche deserticola, dan distribusinya sangat tidak sinkron dengan tanaman inang. Penelitian telah menunjukkan bahwa ada kekayaan keanekaragaman di antara spesies Tamarix. Misalnya, Zhang Juan dkk. melaporkan bahwa keragaman genetik Tamarix sibiricus setinggi 98,7 persen [10], sedangkan keragaman genetik Cistanche sangat buruk, menunjukkan evolusi jangka panjang. Cistanche tubulosa mungkin telah mengalami kemacetan serius dalam sejarah, yang mengakibatkan hilangnya sejumlah besarkeragaman genetik.

Pada saat yang sama, menurut penyelidikan, ditemukan bahwa tidak satupun dariCistanche deserticoladalam jarak 20 km dari pemukiman manusia dapat digali dan mekar secara normal. Lubang besar dan kecil Cistanche digali, terutama di daerah penghasil utama bunga tabung Cistanche. Oleh karena itu, itu disebabkan oleh sejumlah besar penggalian. Kurangnya sumber dan perusakan habitat mungkin menjadi alasan utama buatan manusia untuk rendahnyakeragaman genetikdari Cistanche.

3.3 Diferensiasi genetik Cistanche

Karena jarak geografis antara Xinjiang dan Mongolia Dalam, isolasi geografis menyebabkan diferensiasi dan isolasi antaraCistanche deserticolapopulasi, dan kedua populasi tersebut membentuk ekotipe yang berbeda secara genetik karena adaptasi mereka terhadap kondisi habitat lokal. Karena jangkauan distribusinya yang sempit dan seringnya terjadi pertukaran gen antar populasi, diferensiasi genetik antar populasi kurang dari Cistanche deserticola.

3.4 Rekomendasi untuk perlindungan Cistanche

Keanekaragaman genetikadalah prasyarat untuk kelangsungan hidup jangka panjang spesies untuk menghindari kepunahan. pengurangan darikeragaman genetikakan mengurangi kemampuan populasi untuk beradaptasi dengan perubahan lingkungan baik dalam jangka pendek maupun jangka panjang [11]. Oleh karena itu, melindungi keragaman genetik Cistanche sangat penting untuk melindungi obat Cina yang langka dan berharga ini. Karena Cistanche adalah spesies dengan tipe ekologi khusus, ia harus dilindungi terutama di tempat, dan basis perlindungan alami Cistanche harus ditetapkan sesuai dengan keragaman genetiknya. Misalnya untukCistanche tubulosa, karena keragaman genetik terutama berasal dari dalam populasi, populasi dengan keragaman genetik yang besar akan menjadi objek perlindungan prioritas [12], seperti Angier Minfeng dan Daheyan Yutian dapat Ini terdaftar sebagai basis perlindungan alami untuk Cistanche. AdapunCistanche deserticola, populasi Mongolia Dalam dan Xinjiang telah mengalami perubahan yang signifikan, sehingga penelitian eksperimental harus lebih diperkuat untuk menentukan populasi yang diprioritaskan untuk dilindungi. Pada saat yang sama, melakukan penelitian dasar tentang biologi reproduksi dan ekologi penyerbukan Cistanche untuk memberikan informasi untuk perlindungan lebih lanjut.

Referensi

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, dkk. IdentifikasiBentengdan investigasi bahan obat komersial. Bahan Obat Cina, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Penelitian komprehensif dan aplikasi umum tanaman Tamarix. Lanzhou: Pers Universitas Lanzhou, 1995.

[3] Fu Guoli. Buku Merah Tanaman Cina. Beijing: Pers Sains, 1992.

[4] Kantor Manajemen Impor dan Ekspor Spesies Terancam Punah Republik Rakyat Tiongkok, Komite Ilmiah Spesies Terancam Punah Republik Rakyat Tiongkok. Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Plants (CITES), Lampiran II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, dkk. Ekstraksi dan identifikasi total DNA dari beberapa tumbuhan langka dan kerabatnya. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Sistem pemuliaan tanaman, struktur genetik, dan perlindungankeragaman genetik. Keanekaragaman Hayati, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Biologi Evolusi Tumbuhan. Wuhan: Pers Universitas Wuhan, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, dkk. Analisis RAPD keragaman genetik cemara perak. Ilmu Pengetahuan Cina (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, dkk. Sebuah laporan awal analisis RAPD peony kerdil dan peony ungu. Jurnal Taksonomi Tumbuhan Cina, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Studi Awal tentangKeanekaragaman GenetikPopulasi Alami Tamarix lanset. Penelitian Botani Yunnan, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Genetika populasi konsekuensi dari ukuran populasi kecil: Implikasi untuk konservasi tanaman. Tinjauan Tahunan Ekologi dan Sistematika, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Prinsip genetika populasi dan penerapannya dalam perlindungan tumbuhan langka dan terancam punah. Keanekaragaman Hayati, 1999, 7(4): 340.

Dari: China Journal of Chinese Materia Medica; Jil. 29, Edisi 8 Agustus 2004