Pengaruh Cistanche Pada Apoptosis Neuron Dopaminergik yang Diinduksi Oleh Neurotoxin 1-Metil-4 -Phenylpyridinium (MPP)

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Pusat Penelitian Pengobatan Tradisional Tiongkok dan Materia Medica Tiongkok di Rumah Sakit Xijing, FMMU, Xi'an 710032)

Abstrak

Objektif: Untuk menyelidiki efek dariCistanche pada sel apoptosis neuron dopaminergik kultur primer yang diinduksi oleh 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP plus ). metode: Untuk mempersiapkan serum kelinci terdiri dariBentengmenggunakan metode farmakologi serum. Kemudian uji efek Cistanche pada sel apoptosis neuron DA dariMPP plusmodel yang diinduksi menggunakan morfologi, flow cytometry, pewarnaan TUNEL.Hasil: Perlakuan 200μmol/LMPP plusselama 24 jam atau lebih lama menginduksi apoptosis pada neuron DA. SetelahMPP plusdiperlakukan, rasio apoptosis kelompok yang mengandung dosis setara serum Cistanche adalah 6,3 persen, kelompokMPP plusdiobati sendiri adalah 30,2 persen. Jumlah sel apoptosis kelompok B dan C lebih sedikit dibandingkan kelompok E secara signifikan (P<0.05).>Kesimpulan: Serum mengandungBentengneuron DA apoptosis yang dilindungi yang diinduksi olehMPP plus.

Kata kunci: Benteng;1-metil-4-fenilpiridinium(MPP ditambah ); neuron dopaminergik; apoptosis

Saat ini, terapi utama untukpenyakit Parkinsonadalah terapi pengganti sediaan senyawa levodopa (L-dopa), yang tidak dapat mengendalikan perkembangan penyakit. Seiring perkembangan penyakit, dosis ditingkatkan, dan secara umum, dalam waktu 3 sampai 5 tahun, efek kuratif menurun, gejala motorik berfluktuasi, dan diskinesia yang diinduksi obat muncul. Studi terbaru menemukan bahwa L-dopa memiliki efek menginduksi apoptosis pada neuron yang dikultur secara in vitro [1, 2], dan kemudian telah diusulkan bahwa efek neurotoksik dopamin endogen menyebabkan hilangnya neuron dopaminergik dipenyakit Parkinson. Salah satu alasannya [3]. Dalam praktik klinis jangka panjang, kami telah menggunakan pengobatan Tiongkok untuk:menyehatkan hati dan ginjaldikombinasikan dengan persiapan levodopa untuk mengobati PD dan mencapai hasil yang baik [4-6]. Eksperimen ini mengeksplorasi efek perlindungan pengobatan tradisional Tiongkok pada apoptosis neuron dopaminergik dan mekanismenya dari tingkat molekuler dan seluler.

1. Bahan dan metode

1.1 Bahan

media DMEM,1-metil-4-fenilpiridini um, MPP plus, serum janin sapi yang dibeli dari perusahaan Gibco.Sitarabin, poli-l-lisin, PLLdibeli dari Sigma Company. {0}{}piring kultur sumur, 25cm2

Botol kultur plastikdibeli dari Perusahaan NUNC.obat cinakami digunakan dibeli dari Xi'an Decoction Piece Factory. Hewan yang kami gunakan disediakan oleh pusat hewan sekolah.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Persiapan dan pengelompokan eksperimental serum obat

Cistanche disiapkan sebagai bubuk beku-kering untuk pengawetan dan diencerkan dengan air suling saat digunakan. Serum hewan dibuat dari kelinci putih bertelinga besar Selandia Baruserum, yang semuanya laki-laki sehat, dengan berat 2,5-3.0 kg. Dosis setara hewan diubah sesuai dengan luas permukaan tubuh dan secara acak dibagi menjadi serum kelompok kontrol kosong; 1/2 serum kelompok dosis setara (dosis gavage bahan obat mentah Cistanche 0.8g/kg); kelompok dosis ekivalenserum(Dosis gavage adalah bahan obat asli Cistanche cistanche 1.6g/kg); 2 kali dosis ekivalenserum(dosis gavage adalah bahan obat asli Cistanche 3.2g/kg). Gavage dua kali sehari selama total 3 hari, 1 jam setelah gavage terakhir, pertumpahan darah karotis, semalaman pada 4 derajat , sentrifugasi pada 2500 putaran/menit selama 25 menit, pemisahan serum dengan hati-hati, inaktivasi pada 56 derajat selama 30 menit, dan hisap melalui membran filter 0,22μm Saring bakteri dan simpan pada -20 derajat . Di bawah kondisi yang sama, serum kontrol kelinci kosong disiapkan dengan gavage dengan volume normal saline yang sama. Percobaan dibagi menjadi 5 kelompok. Grup A adalah kelinci kosongserumkelompok kontrol budaya; Grup B adalahkultur serum ditambah MPPkelompok perlakuan yang mengandung 2 kali dosis ekivalen; Grup C adalahkultur serum ditambah MPPkelompok perlakuan yang mengandung dosis ekivalen; Kelompok D adalah kelompok kontrol kultur serum yang mengandung 1/2 dosis setara kultur serum ditambah kelompok perlakuan MPP; Kelompok E adalah kultur serum kelinci kosong ditambah kelompok perlakuan MPP.

Manfaat Cistanche

1.3 Budidaya neuron dopaminergik otak tengah

Tiga tikus SD dari 14 hari kehamilan dipilih dan dibunuh dengan injeksi langsung emboli udara ke dalam jantung; embrio tikus dikeluarkan dalam kondisi aseptik dan ditempatkan dalam cawan petri berisi larutan es D-Hanks. Jaringan otak tikus janin dibedah dan dipisahkan di bawah mikroskop stereo. Metode referensi [7] sedikit ditingkatkan. Meningen dan jaringan vaskular terkelupas, dan jaringan di area A8, A9, dan A10 dari otak tengah ventral dipisahkan. Tambahkan 1mL 0,125 persen pankreatin dan letakkan dalam inkubator 37 derajat selama sekitar 20 menit, tambahkan jumlah yang sesuai dari media kultur yang mengandung 10 persen serum janin sapi untuk menghentikan pencernaan, dan gunakan aspirasi

Pipet tabung ke dalam suspensi sel seragam, sentrifus pada 1500r/menit selama 5 menit pada suhu kamar, keluarkan supernatan dengan hati-hati, pipet 15 kali dengan pipet leher tipis, dan diamkan selama 5 menit. Dalam 24-piring kultur sumur lisin, tambahkan media kultur ke setiap sumur untuk menyesuaikan kepadatan sel menjadi 2 × 105 sel/mL, tambahkan media kultur hingga 0,5mL per sumur, dan tambahkan sitarabin setelah 3 hari kultur ( konsentrasi akhir adalah 10μmol/L), menghambat pertumbuhan non-neuron.

1.4 Pewarnaan imunositokimia tirosin hidroksilase (TH)

Menggunakan metode SABC, pengencer antibodi mengandung albumin serum sapi 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 persen Triton-100 (Sigma, AS), NaN3 80mg/ 100mL, diencerkan dengan PBS hingga 100mL, sesuaikan pH menjadi 7,6. Kultur dihentikan pada hari ke-7, dicuci dengan D-PBS selama 5 menit 3 kali, paraformaldehida 4 persen yang baru disiapkan difiksasi pada suhu kamar selama 30 menit dan dicuci dengan D-PBS selama 5 menit 3 kali; dengan 1:1:8 hidrogen peroksida, metanol dan larutan PBS Inkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, bilas dengan D-PBS selama 5 menit, tambahkan 5 persen serum kambing blocking selama 30 menit pada suhu kamar, bilas dengan D-PBS selama 5 menit, dan tambahkan antibodi TH anti-tikus kambing yang diencerkan dengan pengencer antibodi (pengenceran 1:1000, Calbiochem) ), semalaman pada suhu 4 derajat , bilas dengan D-PBS selama 3 menit 3 kali, tambahkan IgG anti-tikus tikus biotinilasi yang diencerkan dengan antibodi pengencer (diencerkan 1:200, Sigma USA), bekerja pada suhu kamar selama 4 jam, bilas dengan D-PBS selama 3 menit 3 kali, Tambahkan kompleks HRP yang diencerkan dengan pengencer antibodi selama 2 jam pada suhu kamar, dan bilas dengan D-PBS selama 3 menit 3 kali. Bilas pengencer DAB selama 3 menit, tambahkan reagen kromogenik DAB siap pakai (Wuhan Boster Company) ke dalam sel, dan amati warnanya di bawah mikroskop terbalik.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Penanganan obat

Pengamatan morfologi neuron yang dikultur dilakukan di bawah mikroskop fase-kontras setiap hari dan perubahannya dicatat dengan foto. Setelah kultur selama 12 jam, sel-sel diamati di bawah mikroskop terbalik dan obat-obatan ditambahkan sebelum pertemuan. Kandungan serum masing-masing kelompok adalah 10 persen. Setelah dikultur selama 3 hari, MPP plus ditambahkan hingga konsentrasi akhir 200 mol/L. Setelah inkubasi dalam inkubator 37 derajat, 5 persen CO2 selama 24 jam, lakukan berbagai inspeksi.

Benteng

1.6 Deteksi aliran cytometry

Perawatan obatnya sama seperti sebelumnya. Setelah setiap kelompok diperlakukan, sel-sel PC12 yang melekat dicerna dengan 0,125 persen tripsin, dan sel-sel diambil sekitar 1x106 PBS. Sel-sel dicuci dua kali, dan 490 L buffer pengikat ditambahkan, dan sel-sel dicampur secara menyeluruh, dan 5 L annexin V ditambahkan. FITC dan 10μL PI terlarut dalam suspensi sel, aduk perlahan, masukkan tabung reaksi pada suhu 4 derajat , inkubasi selama 10 menit dalam gelap, dan uji pada flow cytometer COULTER EPICS (Beckman Coulter, USA).

1.7 Pelabelan ujung in situ (TUNEL) untuk mendeteksi apoptosis sel

Pelabelan ujung DNA in situ dari neuron yang dikultur menggunakan kit deteksi apoptosis Boster (MK1022), dan langkah-langkahnya adalah sebagai berikut: Ambil sel neuron dopaminergik dari setiap kelompok setelah perlakuan MPP plus (slide sebelum kultur primer dikultur dengan perlakuan polimer Lysine), difiksasi dengan 4{{30}}g/L paraformaldehyde selama 1 jam, asam asetat 3 persen segar (pH2.5) pada suhu kamar selama 10 menit, menetralkan alkali fosfatase, tambahkan 0,1mol/L TBS (pH7,5 ) 1:200 pencernaan proteinase K yang baru diencerkan pada 37 derajat selama 20 detik, tambahkan 1μL TdT dan DIG-d-UTP ke setiap slide dan 18μL larutan buffer selama 2 jam pada 37 derajat ; tambahkan 50μL larutan penghambat ke setiap slide, pada suhu kamar selama 30 menit; Tambahkan 50μL antibodi anti-digoksigenin terbiotinilasi yang diencerkan dengan larutan penghambat; bereaksi selama 30 menit dalam kotak basah pada 37 derajat; tambahkan 50μL SABC-AP yang diencerkan dengan 0,1mol/L TBS ke setiap slide; BCIP/NBT (0,1 mol pH9.5 /L TBS diencerkan 1:20) ditambahkan ke spesimen untuk mengembangkan warna selama 30 menit; pada saat yang sama, kontrol alternatif (buffer TdT digunakan sebagai pengganti campuran TdT/biotin-dUTP) untuk fotomikrografi dan mikroskop kontras fase terbalik (200×) Amati sel-sel apoptosis. Hitung sel positif di bawah mikroskop fase kontras, hitung 5 bidang per sumur di setiap kelompok, dengan total 6 sumur.

2. Hasil percobaan

2.1 Pengamatan morfologis neuron berbudaya

Diamati dengan mikroskop fase kontras OlympusIX70: 5 jam setelah inokulasi, sebagian besar sel menempel pada dinding, sel tersebar, badan sel bulat, nukleus tidak terlihat, dan indeks bias kuat. Setelah dikultur selama 24 jam, tonjolan sel tumbuh dan memanjang secara bertahap. Pada 48 jam, sebagian besar sel menonjol dengan tonjolan filamen bercabang. Morfologi selnya beragam, yaitu bipolar, tripolar, dan multipolar, dan secara bertahap membentuk jaringan yang jarang. Badan sel membesar, bulat, dan elips. Setelah cedera MPP plus, sel-sel pertama membengkak, indeks bias meningkat, sel-sel dalam keadaan degeneratif, dan sel-sel akhirnya menyusut dan jatuh. Dosis yang berbeda dari serum yang mengandung obat Cina memiliki efek perlindungan pada MPP plus cedera. Setelah kultur diwarnai dengan sel imun TH, terlihat bahwa sel TH-positif berwarna coklat dengan pertumbuhan neurit. Setelah menambahkan dosis setara serum obat tradisional Tiongkok, proporsi TH-positifneuronbisa mencapai 55 persen -60 persen .

2.2 Analisis hasil uji flow cytometry (lihat Gambar 1)

Phosphatidylserine (PS) yang terletak di dalam membran sel pada tahap awal apoptosis bermigrasi ke luar membran sel. Protein pengikat fosfatidil V (Annexin V) adalah protein pengikat fosfolipid yang bergantung pada kalsium, yang memiliki afinitas tinggi untuk PS. Oleh karena itu, Annexin V dapat digunakan sebagai probe untuk mendeteksi PS yang terpapar pada permukaan membran sel. Pada saat yang sama, dikombinasikan dengan metode pengecualian PI untuk doublepewarnaansel apoptosis, sel apoptosis dapat dideteksi dengan flow cytometry. Di kuadran kanan bawah Gambar.1 (FITC plus / PI-), rincian apoptosis setiap kelompok ditampilkan. Proporsi sel, laju apoptosis masing-masing kelompok adalah 4,1 persen, 5,8 persen, 6,3 persen, 28,6 persen, 30,2 persen.

2.3 Analisis hasil pewarnaan TUNEL

Mereka dengan partikel biru-ungu dalam nukleus adalah sel positif, yaitu sel apoptosis. Proporsi sel apoptosis pada setiap kelompok dihitung di bawah mikroskop cahaya. Jumlah sel apoptosis per lapang pandang pada masing-masing kelompok adalah: Kelompok A 2.13±0.34; Grup B 4,92±0,67; Grup C 6.20±1.47; Grup D 10,33±1,51; Grup E 12,74±2,51. Setelahanalisis uji-t,kelompok B dan C dibandingkan dengan kelompok E (P<0.05). the="">hasilpada dasarnya konsisten denganhasil flow cytometry.

3. Diskusi

penyakit Parkinsontermasuk dalam kategori "sindrom tremor" dalam pengobatan Tiongkok. Pengobatan tradisional Tiongkok percaya bahwa timbulnya PD sebagian besar merupakan serangkaian manifestasi dari penipisan hati dan ginjal secara bertahap pada orang tua dan hilangnya nutrisi meridian sumsum otak. Perawatan utamanya adalahmenyehatkan hati dan ginjal, menenangkan hati dan menghilangkan masuk angin. Pengobatan tradisional Tiongkok dapat memainkan tujuan "mengurangi toksisitas dan meningkatkan kemanjuran" dalam pengobatanparkinson, tetapi mekanisme kerjanya tidak begitu jelas saat ini. Sejumlah besar bukti eksperimental dalam pengobatan modern menunjukkan bahwa stres oksidatif adalah salah satu faktor yang menyebabkan kematian sel saraf PD [3]. Studi telah menemukan bahwa total glikosida cistanche dapat secara efektif menghilangkan berbagai radikal bebas oksigen reaktif dan melindungi DNA dari oksidasi yang disebabkan oleh OH[8]. Ekstrak cistanche tubuloside B dapat melemahkan sitotoksisitas yang disebabkan olehMPP ditambah,melemahkan akumulasi spesies oksigen reaktif dalam sel, dan memiliki efek antagonis pada apoptosis dan stres oksidatif yang disebabkan olehMPP plus[9]. Pengobatan tradisional Tiongkok dapat mengaktifkan dan memperkuat jalur sinyal pelindungnya sendiri, menahan kerusakan eksternal, dan mengembalikan keseimbangannya. Inilah salah satu tujuan modernisasi pengobatan tradisional Tiongkok. Setelah terapi penggantian dopamin, orang sekarang umumnya menghargai terapi neuroprotektif, yang disebut revolusi kedua dalam pengobatanpenyakit Parkinson. Dalam percobaan ini, sel saraf dopaminergik otak tengah yang diisolasi dikultur dengan obat Cina yang mengandung serum, dan ditemukan bahwa Cistanche memiliki efek neuroprotektif tertentu. Dalam percobaan ini, dua metode deteksi flow cytometry dan pewarnaan TUNEL digunakan untuk secara bersamaan menemukan bahwa serum kelompok dosis ekivalen dan 2 kali serum kelompok dosis ekivalen dari kultur serum obat Cistanche dapat mengurangi kultur saraf dopamin otak tengah primer yang disebabkan olehMPP plusJumlah sel apoptosis memiliki efek perlindungan tertentu pada sel apoptosis. Pengobatan tradisional Tiongkok dapat melindungi neuron dopaminergik dari kerusakan pada tahap awal, yang merupakan ukuran yang lebih penting daripada terapi lainnya. Dalam pengertian ini, pengobatan holistik pengobatan Cina adalah obat untuk akar penyebabnya, dan dapat dianggap sebagai salah satu perawatan saraf yang dihargai orang saat ini.

Referensi

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, dkk. Levodopa menginduksi apoptosis pada sel saraf yang dikultur-kemungkinan akselerator degenerasi nigrostriatal pada penyakit Parkinson? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Neurotoksisitas Levodopa: studi eksperimental versus relevansi klinis. Neurologi, 1998,50 (6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Kematian sel pada penyakit Parkinson. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): ​​II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, dkk. Pengamatan klinis pada pengobatan penyakit Parkinson dengan fungsi hati dan ginjal: laporan 60 kasus. Jurnal Pengobatan Tradisional Tiongkok Universitas Chengdu, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, dll. Observasi Klinis Pada 40 Kasus Penyakit Parkinson yang Diobati dengan Metode Pemberian Nutrisi pada Hati dan Ginjal. Penelitian dalam Pengobatan Cina, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, dkk. Pingchan No. 1 cairan oral dalam pengobatan 40 kasus penyakit Parkinson. Jurnal Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, dkk. Hasil persentase yang tinggi dari sel-sel tirosin hidroksilase-positif dari kultur sel mesensefalik E14 tikus. Otak Res,1992,586 (2):319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, dkk. Pemulungan in vitro radikal bebas dan efek perlindungan pada kerusakan DNA yang diinduksi OH yang disebabkan oleh total glikosida cistanche. Jurnal Farmasi Cina, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, dkk. Tubuloside B dari Cistanche salsa Menyelamatkan sel saraf PC12 dari 1-Metil-4-apoptosis yang diinduksi ion fenilpiridinium dan oksidatif.Stress.Planta Med,2002,68(11):966