Abstrak
Latar belakang:Pemrosesan materia medica Cina adalah teknik farmasi yang unik dan unik dalam Pengobatan Tradisional Cina (TCM) yang digunakan untuk mengurangi efek samping, dan meningkatkan atau bahkan mengubah kemanjuran terapeutik herbal mentah. Perubahan komponen penting yang disebabkan oleh prosedur pengolahan yang dioptimalkan terutama bertanggung jawab atas peningkatan khasiat tanaman obat. Efek menyegarkan ginjal dari Cistancha deserticola (C. deserticola) yang dikukus dengan anggur beras lebih kuat daripada C. deserticola (CD) mentah.
Metode:Analisis perbandingan dilakukan menggunakan UPLC-Q-TOF-MSE dengan platform informatika UNIFI untuk menentukan pengaruh pemrosesan. Studi in vitro dilakukan untuk karakterisasi konstituen serta metabolit in vivo. Komponen kimia ditentukan dalam CD dan produk olahannya. Analisis statistik multivariat dilakukan untuk mengevaluasi variasi di antara mereka sementara OPLS-DA digunakan untuk perbandingan berpasangan.
Hasil:Hasil penelitian ini mengungkapkan variasi yang cukup besar dalam glikosida feniletanoid (PhGs) dan iridoid setelah diproses. Sebanyak 97 senyawa terdeteksi dalam ekstrak CD dan produk olahannya. PhGs yang memiliki gugus 4'-O-cafeoyl di bagian 8-O- -d-glucopyranosyl, seperti acteoside, cistanoside C, campneoside II, osmanthuside menurun setelah diproses, sedangkan PhGs dengan 6'- Gugus O-cafeoyl di bagian 8-O- -d-glukopiranosil, seperti isoacetoside, isocistanoside C, isocampneoside I, isomartynoside meningkat, terutama pada kelompok CD-NP. Intensitas echinacoside dan cistanoside B yang memiliki struktur 6'-O- -d-glucopyranosyl moiety juga meningkat. Dalam studi in vivo, 10 komponen prototipe dan 44 metabolit terdeteksi dalam plasma, feses, dan urin tikus. Hasil yang diperoleh mengungkapkan bahwa pemrosesan mengarah pada variasi yang cukup besar dalam konstituen kimia CD dan memengaruhi disposisi senyawa in vivo, dan proses metabolisme fase II adalah kaskade kunci dari setiap senyawa dan sebagian besar metabolit dikaitkan dengan echinacoside atau acetonide.
Untuk info lebih lanjut:
david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501
Kesimpulan:Ini adalah penelitian perbandingan global pertama CD mentah dan olahan. Temuan ini menambah pemahaman kami tentang dampak pemrosesan CD dan memberikan data penting untuk penyelidikan kemanjuran di masa mendatang.
Kata kunci:Cistanche deserticola, Pemrosesan, UPLC-Q-TOF-MSE, Profil kimiawi, Metabolit in vivo
Perkenalan
Pemrosesan materia medica Cina (CMM) telah menunjukkan penerapan yang signifikan dalam praktik klinis Pengobatan Tradisional Cina (TCM), dan telah dianggap sebagai pengobatan yang layak selama beberapa abad. Ini adalah teknologi farmasi unik yang berasal dari teori TCM. Pemrosesan berikut, perbedaan yang signifikan dalam penampilan, kandungan kimia, karakteristik, dan signifikansi obat dari semua jenis TCM telah diidentifikasi, mengarah pada asumsi bahwa pemrosesan dapat meningkatkan kemanjuran atau mengurangi efek toksik TCM.
Selama ratusan tahun, Cistanche deserticola (Roucongrong dalam bahasa Cina, CD) biasa digunakan dalam praktik klinis TCM untuk melengkapi fungsi ginjal. Ini juga membantu melembabkan usus yang menyebabkan relaksasi usus [1]. Cistanche pertama kali direkam di ShenNongBencaoJing. Ini umumnya ditemukan di habitat kering dan semi-kering di seluruh Eurasia dan Afrika Utara, termasuk Iran, China, India, dan Mongolia [2]. Pengolahan CD telah dilakukan dengan mengukus dengan anggur beras di bawah tekanan normal, yang merupakan metode persiapan yang didokumentasikan dalam farmakope Cina (Jiucongrong dalam bahasa Cina, selanjutnya disebut "CD-NP"). Dan CD mengukus dengan anggur beras di bawah tekanan tinggi adalah metode persiapan yang lebih efektif (selanjutnya disebut "CD-HP") [3, 4]. Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa efek farmakologi CD berbeda dengan produk olahannya [5]. CD dapat mengencangkan Yang ginjal dan mengendurkan usus, sementara setelah dikukus dengan anggur beras, efek pengisian Yang ginjal akan diperkuat. Dalam penelitian kami sebelumnya, telah ditemukan bahwa CD-NP dapat meningkatkan sonifikasi ginjal dan mendukung Yang, dan menghilangkan efek melembabkan usus dan buang air besar [6-8]. Dalam praktek klinis, produk olahan merupakan bentuk yang paling umum digunakan.
Hingga saat ini, beberapa penelitian telah menganalisis komponen kimia CD, diikuti dengan isolasi dan identifikasi lebih dari 100 senyawa [9-11], seperti glikosida feniletanoid (PhGs), iridoid, lignan, dan oligosakarida sebagai penyusun kimia utamanya. . Juga telah dilaporkan bahwa ada banyak aktivitas farmakologi PhG termasuk imunomodulator, neuroprotektif, hepatoprotektif, anti-inflamasi, anti-oksidatif, dll. [12-14]. Iridoid memiliki aktivitas anti-inflamasi [15, 16]. Juga telah diungkapkan oleh penelitian sebelumnya bahwa beberapa komponen kimia menunjukkan variasi selama pemrosesan [17-20]. Berdasarkan laporan tersebut, dapat diasumsikan bahwa pasca pengolahan, variasi komposisi kimia menyebabkan berbagai efek farmakologis yang perlu dieksplorasi lebih lanjut.
Dalam penelitian ini, metode yang sensitif dan efektif yaitu, kromatografi cair kinerja sangat tinggi digabungkan dengan TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) dilakukan untuk analisis komparatif, dan studi in-vitro dilakukan untuk menganalisis ekstrak secara kualitatif. CD, CD-NP, dan CD-HP untuk menjelaskan profil kimianya. Umumnya, bahan kimia eksogen dengan paparan tinggi pada organ target dianggap sebagai komponen yang efektif. Oleh karena itu, pada tikus, CD dan produk olahannya masing-masing diberikan secara oral, diikuti dengan karakterisasinya. Studi yang ada mengungkapkan studi perbandingan (baik in vitro dan in vivo) dari CD mentah dan olahan untuk pertama kalinya. Hasil yang diperoleh akan memperluas pemahaman kita tentang efek pemrosesan CD, yang mungkin berguna untuk studi lebih lanjut.
Bahan dan metode
Bahan
Senyawa standar ajugol (180120) dan 2'-actylacetoside (M0601AS) disediakan oleh Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, China). Cistanoside F (HARUS-17022620), echinacoside (D1105AS), cistanoside A (M0906AS), dan isoacteoside (M0106AS) disediakan oleh perusahaan Must (Sichuan China); acteoside (O0618AS), salidroside (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposide (A0407AS), dan asam geniposidic (MB6001-}S) diperoleh dari Dalian Meilun Bio.Co., Ltd (Dalian, China). 8-asam epideoxyloganic (B31123) diperoleh dari Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, China. Metanol dan asetonitril adalah kelas MS dan diperoleh dari Merck KGaA, Darmstadt, Jerman. Asam metanoat (CH2O2) kelas HPLC disediakan oleh Merck KGaA (Darmstadt, Jerman). Air yang digunakan dalam penelitian yang ada diproses melalui sistem Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, Ma, USA). Anggur beras disediakan oleh Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).
Cistanche deserticola dikumpulkan dari Neimenggu wangyedi cistanche Co. Ltd. Sampel te diidentifikasi oleh Prof. Yanjun Zhai (sekolah farmasi, Liaoning University of TCM). Spesimen diserahkan ke Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.
Hewan
Tikus jantan Sprague–Dawley (tingkat SPF) dengan berat total 180–220 g disediakan oleh Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource
Pusat Provinsi Liaoning, nomor lisensi: SCXK- 2015–0001). Tikus-tikus ini ditempatkan di ruang penangkaran dengan suhu dan kelembaban yang terjaga yaitu 20–26 derajat , 50–70 persen selama satu minggu. Tikus diberi makan dengan makanan dan air laboratorium biasa sebelum percobaan. Hewan dipuasakan semalaman, namun air ad libitum diberikan sebelum percobaan. Tikus-tikus itu dieksekusi dengan anestesi chloral hydrate 10 persen. Komite Etika Hewan Kelembagaan Rumah Sakit Pengobatan Tiongkok Provinsi Liaoning menyetujui semua protokol eksperimental (2019.3.25, 2019015).
Persiapan ekstrak CD, CD‑NP, dan CD‑HP
CD-NP dan CD-HP diproses dari batch yang sama dari Cistanch deserticola. Untuk menyiapkan CD-NP, potongan CD kering (ketebalan 5 mm, 100 g) dibasahi dengan anggur beras (30 mL) dan dikukus pada suhu 100 derajat selama 16 jam, dilanjutkan dengan pengeringan pada suhu 55 derajat melalui oven pengering. Sedangkan CD-HP dibuat melalui infiltrasi keping CD kering (tebal 5 mm, 100 g) dengan arak beras (30 mL), dilanjutkan dengan pengukusan pada tekanan 1,25 atmosfir selama 4 jam. dan kemudian dikeringkan dalam oven pengering pada suhu 55 derajat.
Dalam labu ukur 100 mL, satu gram serbuk diayak melalui saringan #4, diikuti dengan penambahan 50 persen metanol (50 mL) kemudian ditutup rapat dan dicampur. Campuran ini ditimbang, diikuti setengah jam. kelelahan. Setelah maserasi, campuran diultrasonikasi (daya 250 W, frekuensi 35 kHz) selama 40 menit, dilanjutkan dengan pendinginan, dan penimbangan kembali. Kehilangan berat diisi kembali dengan metanol 50 persen, dicampur dengan benar, dan didiamkan, dilanjutkan dengan menyaring supernatan dan kemudian menggunakan filtrat yang diperoleh sebagai larutan uji.
Analisis MSE komponen aktif
Persiapan zat standar: tableside-A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetylacteoside (2.34 mg), acetonide (2.45 mg), isoacteoside (0.61 mg), cistanoside-F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geniposide (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), katalog (2,39 mg), asam teniposide (2,56 mg), dan 8-asam epideoxyloganic (2,34 mg) ditambahkan ke dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan volume konstan metanol ke skala, dikonfigurasi ke dalam larutan referensi konsentrasi yang sesuai. Masing-masing dari 100 μL dikonfigurasi menjadi larutan referensi campuran.
Kondisi analisis MS: Nilai massa telah dikoreksi sebelum percobaan, dan mode ion negatif digunakan. Kisaran massa adalah 50–1200 Da, dan sampel disuntikkan melalui beberapa pompa injeksi. Kecepatan kerucut adalah 100 L/jam, laju aliran pelarut ditetapkan pada 800 L/jam. Tegangan kapiler dan kerucut ditetapkan pada 2500 dan 40 V. Suhu sumber ion dan gas terlarut masing-masing adalah 100 derajat dan 400 derajat, dan frekuensi perolehan sinyal adalah 0,5 S−1.
Analisis UPLC‑Q-TOF‑MSE dari ekstrak CD
Evaluasi kromatografi dilakukan dalam sistem UPLC ACQUITY I-CLASS Waters (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Termasuk kolom ACQUITY UPLC® BEH C18 (50×2,1 mm, 1,7 μm, Perairan). Fase gerak terdiri dari air yang memiliki 0,1 persen asam format (A) dan asetonitril yang mengandung 0,1 persen asam format (B), kondisi elusi adalah sebagai berikut: 97 persen hingga 85 persen A (0–5 mnt), 85 persen hingga 75 persen A (5–15 mnt), 75 persen hingga 65 persen A (15–16 mnt), 65 persen hingga 55 persen A (16–18 mnt) . Laju aliran adalah 0.3 mL min−1, sedangkan suhu ruang dan kolom autosampler adalah 30 derajat dan 8 derajat secara terpisah. Volume injeksi adalah 1,0 μL.
Evaluasi spektrometri massa dilakukan melalui Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), yang terdiri dari sumber ESI. Laju aliran gas nitrogen ditetapkan pada 800 L·jam−1 dengan suhu 400 derajat , suhu sumber ditetapkan pada 100 derajat , dan gas kerucut ditetapkan pada 50 L h−1. Tegangan kerucut dan kapiler disesuaikan pada 40 dan 2000 V. Energi tumbukan tanjakan digunakan dalam kisaran 20–30 V. Data terpusat dari semua sampel diperoleh dari 50 hingga 1200 Da, dengan 5-waktu pemindaian 0,5 detik selama waktu analisis 10 menit . LockSpray TM digunakan untuk validasi presisi massa. Ion [M–H]− dari leucine enkephalin (laju aliran infus 200 pg·μL−1 10 μL min−1) pada m/z 554.2615 digunakan sebagai massa kunci. Perangkat lunak MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) digunakan untuk massa yang akurat, komposisi ion prekursor, dan perhitungan ion fragmen.
Analisis data di platform Masslynx
Selanjutnya, perpustakaan internal yang terdiri dari nama senyawa, strukturnya, dan rumus molekul (dalam mol.) dibuat berdasarkan literatur. Semua senyawa dicatat dalam templat khusus, dibuat di Excel. Selain itu, file mol (ChemDraw Ultra 8.0, Cambridge soft, USA) dan file Excel dari semua struktur gabungan individual juga disimpan di PC lokal. Anda membuat lembar Excel yang memiliki data penting yang langsung diimpor ke perpustakaan ilmiah di UNIFI.
UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, UK digunakan untuk evaluasi karakteristik struktural, terutama untuk karakteristik fragmen dan fragmentasi MS. Area puncak minimum 500 ditetapkan untuk deteksi puncak 2D. Selama pengungkapan puncak 3D, dipilih intensitas puncak energi rendah lebih dari 300 hitungan dan intensitas puncak energi tinggi lebih dari 80 hitungan. Kesalahan massa ditemukan hingga ± 10 ppm untuk senyawa yang diketahui, dan toleransi waktu retensi ditetapkan dalam kisaran ± 0,1 menit. Kami memilih adisi negatif yang mengandung –H, ditambah HCOOH. Pemrosesan data mentah yang diperoleh dari MS dilakukan melalui perangkat lunak UNIFI yang disederhanakan untuk menentukan dengan cepat komponen kimia yang memenuhi standar dengan database buatan sendiri dan Perpustakaan Obat Tradisional internal.
Selanjutnya, untuk memverifikasi struktur kimia dari setiap senyawa target, isomer dibedakan dengan pola fragmentasi MS yang khas yang terungkap dalam studi yang dilaporkan, dan dengan membandingkan waktu retensi standar referensi.
Analisis metabolomik berdasarkan analisis statistik multivariat
Sebelum memproses data mentah, parameter ditetapkan, seperti rentang massa dari 150 hingga 1200 Da, rentang waktu retensi (0 hingga 20 menit), intensitas ambang ( 2000 hitungan), toleransi massa yaitu, 5 mDa, sedangkan jendela waktu massa dan retensi masing-masing adalah 0,20 menit dan 0,05 Da. Dalam daftar database berikutnya, pengidentifikasi ion adalah pasangan RT-m/z mengenai waktu elusinya. Nilai yang sama untuk RT dan m/z dalam berbagai kumpulan sampel dianggap sebagai senyawa yang sama.
Multivariate statistical analysis was conducted to evaluate effective biomarkers that considerably contributed to variations among different groups. During the analysis, principal component analysis (PCA) was employed to indicate the maximum differences and pattern recognition for obtaining an overview and classification. The OPLS-DA is a modeling tool that provides visualization of the OPLS-DA predictive component loading to assist model evaluation. Variable importance for the projection (VIP) was used for assessing the evaluation of various components, and the metabolites with VIP values>1.0 dan nilai-P<0.05 were regarded as effective markers. Furthermore, a permutation test was conducted for providing reference distributions for the R2/Q2 values that could show statistical significance.
Eksperimen hewan
Tikus secara acak dikategorikan ke dalam empat kelompok (n=6 untuk setiap kelompok), diikuti dengan pemberian berbagai ekstrak secara oral: (1) Kelompok kontrol kosong: tikus diberi normal saline (2 mL/100 g); (2) kelompok CD: tikus diberi ekstrak CD (2 mL/100 g); (3) kelompok CD-NP: tikus diberi ekstrak CD-NP (2 mL/100 g); (4) kelompok CD-HP: tikus diberi ekstrak CD-HP (2 mL/100 g). Kategorisasi lebih lanjut dari semua kelompok dilakukan menjadi tiga sub-kelompok untuk plasma, urin, dan feses. Dua jam kemudian, setiap tikus diberikan secara oral dengan jumlah ekstrak yang sama dan sama.
Pasca pemberian, pengambilan sampel darah dilakukan pada 1.0 jam, 2.0 jam, dan 4.0 jam dalam tabung plastik 1,5 mL heparin (dari vena orbital) , diikuti dengan sentrifugasi (pada 4500 rpm) dari semua sampel selama 15 menit.
Untuk sampel urin dan feses, tikus dipelihara dalam kandang metabolisme, kemudian dilakukan pengambilan sampel urin dan feses selama 24 jam setelah pemberian. Sentrifugasi sampel urine dilakukan dengan kecepatan 4500 rpm selama 15 menit, sedangkan sampel feses dikeringkan di tempat teduh, dihaluskan hingga menjadi bubuk, kemudian diambil 0,2 g, dan ditambahkan ke dalam 0,5 mL larutan garam, ultrasonografi selama 5 menit, dan disentrifugasi pada 12,000 rpm selama 15 menit. Semua biosampel disimpan pada suhu -80 derajat sampai analisis.
Persiapan sampel biologis
Penambahan sampel plasma, urin, dan feses dilakukan dengan 3 volume metanol, dilanjutkan dengan vorteks selama 3 menit. Selanjutnya, sentrifugasi (pada 12,000 rpm) campuran dilakukan selama 10 menit, diikuti dengan memindahkan supernatan ke dalam tabung EP dan kemudian dikeringkan dengan nitrogen pada suhu 37 derajat . Selanjutnya dilakukan penambahan 200 μL larutan HCN–H2O (50 persen ). Kemudian, vortex digunakan untuk pencampuran (1 menit), diikuti dengan sentrifugasi (pada 12,000 rpm) selama 5 menit. Supernatan (5 μL) dari sampel yang dirawat disuntikkan ke dalam sistem UPLC-Q-TOF-MSE.
Kromatografi cair dan kondisi spektrometri massa
Analisis metabolit juga dilakukan oleh instrumen Waters UPLC melalui antarmuka ESI. Pemisahan dilakukan menggunakan kolom Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 µm), fase gerak adalah 0.1 persen asam format (A): Asetonitril (B), kondisi elusi gradien adalah 0–3 menit (99,8 persen →98 persen A), 3–5 menit (98 persen →95 persen A), 5–8 menit (95 persen →90 persen A), 8 –12 mnt (90 persen →85 persen A), 12–17 mnt (85 persen →70 persen A), 17–22 mnt (70 persen →60 persen A), 22–23 mnt (60 persen →58 persen A) , 23–25 menit (58 persen A), 25–32 menit (58 persen →45 persen A), dan 32–37 menit (45 persen →35 persen A), 0,4 mL min−1 adalah laju alir. Suhu untuk kolom dan ruang sampel masing-masing diatur pada 40 derajat dan 8 derajat. Kondisi spektrometri massa yang disebutkan di atas digunakan.
Strategi untuk analisis sistematis metabolit dalam bio-sampel
Perangkat lunak UNIFI (1.8.2) digunakan untuk pemrosesan data. Fungsi Biner Bandingkan digunakan untuk identifikasi metabolit yang efektif. Metabolit yang dievaluasi tidak ada dalam sampel kontrol yang setara atau ada pada intensitas ion rendah. Ambang intensitas relatif ditetapkan pada 3 atau 5, dan metabolit yang memenuhi kriteria yang digarisbawahi dapat dievaluasi. Metabolit yang umum dan dapat diprediksi kemudian ditentukan oleh EIC. Untuk mencari metabolit dua fase, fungsi NLF diterapkan. Misalnya, dalam perangkat lunak UNIFI, parameter dapat ditetapkan pada 176,0321 untuk mencari kemungkinan konjugat asam glukuronat. Pasca pemrosesan, kerugian netral dapat diatur dalam metode atau diidentifikasi. MassFragment digunakan untuk menentukan atau mengkarakterisasi struktur metabolit yang terdeteksi, fungsi interpretasi spektral UNIFI adalah fungsi utama yang digunakan untuk menganalisis fragmentasi sekunder komponen induk. Fungsi ini dapat digunakan untuk verifikasi cepat jalur fragmentasi secara wajar.
Untuk info lebih lanjut: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
