Penghambatan Reseptor Hidrokarbon Aryl Mengembalikan Disfungsi Endotel yang Dimediasi Indoksil Sulfat pada Cincin Aorta Tikus

Abstrak:Itutoksin uremik indoksil sulfat(IS), ditinggikanpenyakit ginjal kronis(CKD), diketahui berkontribusi terhadap penyakit kardiovaskular progresif. IS mengaktifkan reseptor aril hidrokarbon (AhR) yang memediasi stres oksidatif dandisfungsi endotelmelalui aktivasi jalur CYP1A1. Penelitian ini menguji penghambatan AhR dengan antagonis, CH223191, pada penurunan fungsi endotel vaskular yang dimediasi IS dan gangguan keseimbangan redoks. Efek akut IS pada relaksasi yang bergantung pada endotel dinilai pada cincin aorta dari tikus Sprague Dawley yang terpapar pada kondisi berikut: (1) kontrol; (2) ADALAH (300µM); (3) IS + CH223191 (1µM); (4) IS + CH223191 (10µM). Setelah itu, jaringan dinilai untuk melihat perubahan ekspresi penanda redoks. IS mengurangi tingkat maksimum relaksasi yang bergantung pada endotelium (Rmax) sebesar 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) memulihkan ekspresi penanda ini kembali ke tingkat kontrol (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing disfungsi endoteldi pembuluh darah jantung danginjal. penghambatan AhRbisa memberikan terapi baru yang menarik untuk CVD dipengaturan CKD. 

Kata kunci:reseptor aril hidrokarbon; indoksil sulfat; disfungsi endotel; penyakit ginjal kronis; penyakit kardiovaskular; stres oksidatif

Kontribusi Utama: Indoksil sulfat (IS), toksin uremik terikat protein yang paling banyak dipelajari dan merupakan agonis kuat reseptor aril hidrokarbon (AhR), diketahui memainkan peran patologis dalamperkembangan CKDDanCedera terkait CKDdi jaringan lain, seperti pembuluh darah. Studi ini menunjukkan bahwa penghambatan AhR ex vivo dapat mencegah disfungsi endotel yang disebabkan oleh IS dan perubahan terkait dalam keseimbangan redoks, sehingga mewujudkan potensi baru.target terapi CKD

Layanan Pendukung Wecistanche-Ekspor cistanche terbesar di Cina:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Telp:+86 15292862950

Belanja Untuk Detail Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko

KLIK DI SINI UNTUK MENDAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK ALAMI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK INFEKSI GINJAL

1. Perkenalan

CKD mempengaruhi 10% populasi global, tidak hanya berdampak pada sistem kesehatan tetapi juga memberikan beban ekonomi dan produktivitas yang berat pada negara-negara di seluruh dunia [1,2]. Risiko penyakit kardiovaskular (CVD) meningkat pada pasien dengan penyakit ginjal kronis (CKD) [3]. Pada pasien ini, akumulasi racun uremik terikat protein (PBUTS) yang tidak dapat didialisis seperti indoxyl sulfate (IS) tidak hanya menunjukkan peningkatan mortalitas akibat penyakit kardiovaskular [4], namun juga memprediksi kejadian buruk kardiovaskular pada pasien dengan gagal jantung kronis [ 5]. CKD dan peningkatan kadar IS juga memperburuk komplikasi kardiovaskular seperti hipertrofi miokard, dislipidemia, peradangan kronis [6], serta disfungsi endotel, yang dibuktikan dengan dilatasi yang dimediasi aliran arteri brakialis (FMD) abnormal yang berkorelasi dengan kadar IS serum [7,8] . Penelitian lain telah mengamati bahwa penyempitan mikrovaskular pada pasien dengan CKD berhubungan dengan penurunan perkiraan laju filtrasi glomerulus [9]. Selain itu, penelitian pada hewan telah melaporkan bahwa IS, baik yang ditingkatkan pada model CKD atau diberikan secara eksogen, berkontribusi terhadap gangguan vasorelaksasi yang bergantung pada endotelium [10,11].

IS berasal dari metabolisme triptofan yang terakumulasi secara progresif dalam serum pasien CKD stadium 2-5; afinitas pengikatannya yang tinggi terhadap albumin menghambat pembersihannya bahkan setelah dialisis [4,12]. Penelitian sebelumnya telah mengidentifikasi IS sebagai agonis endogen pada reseptor aril hidrokarbon (AhR), sebuah faktor transkripsi yang bergantung pada ligan sitosol yang secara konstitutif diekspresikan dan terlibat dalam berbagai proses biologis seperti stres oksidatif, peradangan, remodeling vaskular, dan atherogenesis [13, 14]. Aktivasi AhR yang dimediasi IS menginduksi enzim, sitokrom P450 1A1 (CYP1A1) dalam sel endotel dan ini dikaitkan dengan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) [14,15]. Selain itu, peningkatan ekspresi CYP1A1 dalam darah pasien dengan CKD telah diamati [16]. Penghambatan aktivasi AhR yang dimediasi IS dengan antagonis selektif seperti 2-metil-2H-pirazol-3-asam karboksilat (2-metil-4-o-toly- lazo-phenyl)-amide (CH223191) [17] telah dilaporkan membalikkan peradangan yang diinduksi IS dan produksi ROS untuk mengontrol kadar sel endotel [14,15].

AhR diketahui berperan dalam menjaga keseimbangan redoks genom melalui aktivasi xenobiotik fase I dan elemen respons anti-oksidatif fase II (ARE). Aktivasi AhR memicu sistem detoksifikasi seluler, yang dibagi menjadi enzim fase I seperti CYP1A1 yang terlibat dalam produksi ROS. Generasi ROS yang berkelanjutan mengarah pada interaksinya dengan faktor transkripsi anti-oksidan, faktor nuklir eritroid 2-faktor terkait (Nrf2), selain itu, aktivasi AhR juga menstimulasi Nrf2 [18,19]. Nrf2 bersama dengan faktor transkripsi proto-onkogen c-Maf berikatan dengan ekspresi enzim anti-oksidatif fase II NAD(P)H yang menginduksi ARE: kuinon oksidoreduktase (NQO1) dan glutathione S-transferase (GSTA1/2). CYP1A1 dan NRF2 memainkan peran homeostatis dalam menjaga keseimbangan antara pro dan anti-oksidan [18,19].

Pilihan pengobatan yang membatasi efek merusak dari PBUT seperti IS terbatas. Adsorben oral AST-120, yang menghilangkan prekursor toksin uremik dari usus, seperti indole, mengurangi pembentukan dan tingkat sirkulasi IS dan PBUT turunan indole lainnya. AST-120 telah digunakan dalam uji klinis kecil dengan beberapa keberhasilan [20-22], yang telah disetujui di beberapa negara Asia. Namun, uji klinis besar fase III EPPIC-1 dan -2 (Evaluating Prevention of Progression in CKD) menunjukkan bahwa AST-120 tidak memenuhi titik akhir utamanya [23]. Hal ini menimbulkan perlunya strategi alternatif yang dapat mencegah mekanisme kerja IS. Secara in vitro, AhR telah terbukti menjadi target efektif yang penghambatannya dapat menghambat aksi hilir IS dan potensi metabolit triptofan lainnya [13,14] dan dapat memberikan utilitas terapeutik dalam mengurangi risiko CVD pada CKD dan mengurangi perkembangannya.

Sementara sebagian besar penelitian in vitro yang menilai penghambatan AhR menggunakan siRNA atau inhibitor molekul kecil seperti antagonis AhR murni CH223191 [17], tidak ada penelitian ex vivo yang dilakukan yang mengevaluasi efek antagonis ini pada relaksasi endotel untuk menentukan 'bukti prinsip'. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menilai efek penghambatan AhR pada jaringan aorta terisolasi untuk mencegah kerusakan fungsi vaskular yang bergantung pada endotel yang diinduksi IS dengan mengurangi stres oksidatif yang dimediasi IS dan ekspresi gen CYP1A1 yang terkait dengan aktivasi AhR, dan selanjutnya memeriksa efeknya. efek pada sistem anti-oksidan.

2. Hasil

2.1. Pengaruh Penghambatan Reseptor Hidrokarbon Aryl pada Relaksasi Ketergantungan Endotelium Gangguan IS

Cincin aorta dari tikus sehat dipaparkan IS (10–300 µM) untuk menentukan dosis IS optimal yang menyebabkan gangguan relaksasi endotel. IS pada 300 µM tetapi tidak 10 µM atau 100 µM secara signifikan mengurangi relaksasi yang bergantung pada endotelium (Rmax) terhadap asetilkolin (ACh) dibandingkan dengan kontrol sebesar 32% (p <0,05; Gambar 1A), dan konsentrasi ini adalah digunakan dalam percobaan selanjutnya. Dalam percobaan berikutnya dengan adanya inhibitor AhR, CH223191 (1 dan 10 µM), penurunan Rmax (42%) yang diinduksi IS dapat dicegah (p <0,001, Gambar 1B, Tabel 1). Pada cincin aorta yang hanya distimulasi IS, potensi ACh (-pEC50) berkurang dibandingkan dengan kontrol (p <0,01) dan dipulihkan dengan adanya CH223191 (p <0,05; Tabel 1). Untuk menentukan apakah inhibitor AhR saja menunjukkan efek intrinsik pada relaksasi yang bergantung pada endotel, cincin aorta diinkubasi dengan CH223191 saja, dan tidak menunjukkan efek pada nilai Rmax atau -pEC50 (Tabel 1, juga Gambar Tambahan S1).

Gambar 1. Pengaruh CH223191 pada reaktivitas vaskular. (A) Paparan cincin aorta terhadap IS (300 µM) mengurangi relaksasi yang bergantung pada endotelium yang dirangsang oleh ACh (p <0,05; N=6). (B) Preinkubasi dengan CH223191 (1 µM dan 10 µM) mencegah pengurangan relaksasi yang bergantung pada endotelium yang diinduksi IS (p <0,001; N=10). Titik data dinyatakan sebagai mean ± SEM

2.2. Pengaruh IS pada Sintase Nitrat Oksida Endotelium dan Endotel

Setelah respons relaksasi fungsional terhadap ACh selesai, bagian jaringan dari cincin aorta ini dianalisis dengan imunohistokimia untuk sel endotel dan ekspresi nitric oxide synthase (eNOS) endotel. Tidak ada perubahan pada sel endotel sebagaimana ditentukan dengan pewarnaan antigen sel endotel tikus{{0}} (RECA-1) pada empat kondisi yang diperiksa (Gambar 2A). Namun, bagian cincin aorta yang diwarnai untuk eNOS menunjukkan bahwa paparan IS secara signifikan mengurangi ekspresi eNOS sebesar 75% dari permukaan luminal endotel (p <0.01), sedangkan dengan adanya CH223191, pengurangan ini dapat dicegah dengan adanya 10 µM CH223191 (Gambar 2B – F; p <0,05).

Gambar 2. IS mengurangi ekspresi eNOS tanpa kehilangan sel endotel. (A) Pewarnaan penanda sel endotel RECA-1 pada cincin aorta yang diobati dengan IS tanpa adanya dan adanya CH223191. (B) Ekspresi NOS endotel yang berkurang dengan adanya IS dicegah dengan CH223191. Gambar representatif pewarnaan eNOS pada (C) jaringan kontrol, (D) yang diberi perlakuan IS, IS dengan adanya (E) 1 uM dan (F) 1{{10}} uM CH223191. Tanda panah menunjukkan pewarnaan positif. Data dinyatakan sebagai mean 土 SEM dari=10 eksperimen. ** p < 0,01 dibandingkan dengan jaringan kontrol, #fp < 0,05 dibandingkan dengan jaringan yang terpapar IS Pembesaran X400.

2.3. Pengaruh IS dan CH223191 terhadap Pro dan Anti Oksidatif

Aktivasi AhR yang diinduksi Ekspresi Gen IS diketahui meningkatkan CYP1A1. Kami menemukan IS (3{{10}}0 µM) secara signifikan meningkatkan ekspresi CYP1A1 di cincin aorta setelah 1 dan 4 jam masing-masing hampir sembilan dan tujuh kali lipat, dibandingkan dengan kondisi kontrol (p <0,05, Gambar 3). CH223191 pada 1 dan 10 µM mengurangi ekspresi gen CYP1A1 yang dimediasi IS setelah 1 jam stimulasi IS ke tingkat yang sama yang diamati pada cincin yang terpapar kontrol, sedangkan setelah 4 jam stimulasi IS, hanya 10 µM CH223191 yang mampu mengurangi kadar CYP1A1 secara signifikan (p <0,001 , Gambar 3). Saat memeriksa jalur anti-oksidatif, IS dengan tidak adanya dan adanya CH223191 gagal menginduksi perubahan ekspresi gen Nrf2, NQO1 dan GSTA1/2 (Lihat Gambar Tambahan S2)

2.4. Pengaruh IS dan CH223191 pada Penanda Stres Oksidatif dan Peradangan

Untuk mengkaji lebih lanjut perubahan keseimbangan redoks, jaringan dari percobaan fungsional dianalisis untuk menguji perubahan penanda stres oksidatif, yaitu nikotinamida adenin dinukleotida fosfat (NADPH) oksidase 4 (NOX4), ekspresi superoksida dan nitro-tirosin. Jaringan yang terpapar IS menunjukkan peningkatan ekspresi NOX4 sebesar 180% (Gambar 4; p < 0.001). Dengan adanya CH223191 (1 dan 10 µM), ekspresi NOX 4 berkurang secara signifikan dibandingkan dengan IS (Gambar 4; p < 0.001). Paparan IS meningkatkan tingkat ekspresi nitro-tirosin, penanda kerusakan sel dan pewarnaan peradangan sebesar 90% dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5; p <0,05), sedangkan dengan adanya CH223191 (10 µM), ekspresi nitro-tirosin berkurang kembali ke tingkat kontrol (Gambar 5; p <0,05). Ekspresi molekul spesies oksigen reaktif, superoksida, ditentukan dengan pewarnaan dihydroethidium (DHE). Paparan IS meningkatkan pewarnaan DHE sebesar 430% dibandingkan dengan kontrol (Gambar 6; p <0,001), sedangkan dengan adanya CH223191 pada kedua dosis, ekspresi superoksida dikurangi kembali ke tingkat kontrol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6; (p <0,001

Ekspresi gen penanda inflamasi juga diperiksa pada aorta yang distimulasi dengan tidak adanya dan adanya CH223191. IS menghasilkan peningkatan yang tidak signifikan masing-masing sebesar 111 dan 55% pada faktor nekrosis tumor a (TNFa) dan ekspresi gen molekul adhesi sel vaskular-1VCAM-1), pada 4 jam. Dengan adanya CH223191, tingkat ekspresi kedua gen berkurang secara signifikan, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7 (p <0.05).

Gambar 6. CH223191 mencegah ekspresi superoksida yang diinduksi IS. (A) Kuantitas pewarnaan DHE pada cincin aorta yang diberi perlakuan S tanpa adanya dan adanya CH223191. Gambar representatif dari ekspresi superoksida di (B) jaringan kontrol, (C) yang diberi perlakuan IS, IS dengan adanya (D) 1 uM dan (E) 1{{10}} M CH223191Data dinyatakan sebagai rata-rata SEM dari N=10 percobaan. *** p < 0,001 dibandingkan dengan jaringan kontrol#### p < 0,001 dibandingkan dengan jaringan yang terpapar IS. Pembesaran x200.

Gambar 7. Pengaruh penghambatan IS dan Ahk terhadap ekspresi gen inflamasi. Paparan cincin aorta terhadap ekspresi gen IS yang tidak meningkat secara signifikan (A) TNFa dan (B) VCAM-1 pada 4 jam. Dengan adanya CH223191, ekspresi TNFx dan VCAM-1 dicegah. Data dinyatakan sebagai mean 土 SEM dari=6 eksperimen. # p < 0.05 dibandingkan dengan jaringan yang terpapar IS.