Sifat Anti Tirosinase Dari Berbagai Jenis Kunyit Dan Isolasi Senyawa Aktif Dari Curcuma Amada

Jesmin Akter1 ● Md. Zahorul Islam1,2 ● Md. Amzad Hossain1 ● Kensaku Takara1

1 Fakultas Pertanian, Universitas Ryukyus, Okinawa, Jepang

2 Departemen Farmakologi, Fakultas Ilmu Kedokteran Hewan, Universitas Pertanian Bangladesh, Mymensingh, Bangladesh

Untuk informasi lebih lanjut:{0}}

Abstrak

Kunyit secara tradisional digunakan sebagai kosmetik kulit dalam beberapa acara keagamaan dan budaya di anak benua India. Dalam penelitian ini, kami membandingkan sifat penghambatan tirosinase dari empat Curcuma spp., yaitu C. xanthorrhiza, C. aromatic, C. amada, dan C. zedoaria. Isolasi dan pemurnian inhibitor tirosinase yang dipandu bioassay menggunakan kolom silika gel dan kromatografi cair kinerja tinggi. Identifikasi struktur senyawa dilakukan dengan menggunakan 1 H NMR, 13C

NMR, dan kromatografi cair-spektrometri massa tandem. C. amada menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase tertinggi, dengan IC50 sebesar 53,4 ug/mL. Oleh karena itu, dipilih untuk isolasi dan pemurnian inhibitor tirosinase. Senyawa yang dimurnikan adalah zederon (1), furanodienon (2), 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil){ {13}}(4-hidroksifenil) heptana (3), 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksi fenil)-7-({{22 }}hidroksi-3-metoksifenil) heptana (4) dan 1,5- epoksi 3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil) -7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptana (5). Nilai IC50 untuk jamuranti-tirosinaseaktivitas senyawa 1, 2, 3, 4, dan 5 berturut-turut adalah 108,2, 89,2, 92,3, 21,7, dan 41,3 M. Senyawa ini juga menghambat aktivitas tirosinase intraseluler, sehingga mengurangi sintesis melanin pada sel melanoma B16F10. Senyawa 4 menunjukkan secara signifikan lebih kuatanti-tirosinaseaktivitas daripada arbutin (obat kontrol positif). Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati pada efek penghambatan tirosinase antara senyawa 5 dan arbutin. Temuan kami sangat menyarankan bahwa C. Amanda adalah sumber penghambat tirosinase alami yang menjanjikan untuk mencegah melanogenesis dan dapat digunakan sebagai kosmetik pemutih.

Kata kunci: Curcuma amada ● Senyawa aktif ● NMR ● Anti-tirosinase ● Antimelanogenik

Cjilat ke Cistanche untuk anti-tirosinase

pengantar

Melanin adalah pigmen hitam pada rambut dan kulit dan sangat penting untuk melindungi kulit dari radiasi UV. Pigmen diproduksi oleh sel melanosit, hadir di lapisan basal dermis melalui proses fisiologis yang disebut melanogenesis. Namun, produksi melanin yang tidak normal menyebabkan gangguan dermatologis seperti bintik-bintik, melasma, lentigines, bintik-bintik penuaan, ephelides, dan hiperpigmentasi pasca inflamasi [1]. Dalam industri makanan, hiperpigmentasi buah dan sayuran menyebabkan kerugian yang signifikan dari kualitas gizi dan nilai pasar [2]. Melanogenesis dapat dikendalikan dengan menghambat aktivitas tirosinase, enzim pembatas laju untuk sintesis melanin pada mamalia, tumbuhan, mikroorganisme, dan jamur [3]. Oleh karena itu, penghambatan aktivitas tirosinase mencegah hiperpigmentasi dan menyebabkan pemutihan kulit. Ini juga mengontrol kualitas sayuran dan buah-buahan dengan mengatur pencoklatan sayuran dan makanan yang tidak diinginkan. Kebanyakan agen pencerah kulit, seperti hydroquinone, asam azelaic, asam kojic, dan arbutin adalah inhibitor tirosinase yang kuat. Namun, mereka memiliki berbagai efek yang tidak diinginkan seperti sitotoksisitas, ochronosis, vitiligo, iritasi, pengelupasan kulit, dan kemerahan [4]. Selain itu, asam kojic dan -arbutin menunjukkan stabilitas formulasi yang buruk dan kemampuan penetrasi kulit, dan kemanjuran yang rendah secara in vivo [5]. Beberapa garam merkuri organik dan anorganik memiliki efek anti-melanogenik dan digunakan dalam bahan pemutih kulit. Namun, melalui penyerapan kulit, senyawa merkuri dapat menyebabkan efek toksik seperti perubahan warna kulit, kerusakan ginjal, reaksi alergi, dan jaringan parut. Oleh karena itu, penelitian tentang inhibitor tirosinase yang kurang toksik dan lebih efektif diperlukan. Kunyit (famili: Zingiberaceae; genus: Curcuma), tanaman obat tradisional yang tumbuh terutama di daerah tropis dan subtropis Asia dan Afrika, memiliki spektrum fungsi farmakologis yang luas. Ini telah digunakan secara tradisional dalam ritual pra-pernikahan selama ribuan tahun di anak benua India sebagai agen pencerah kulit. Kunyit dipercaya dapat memperbaiki warna kulit dengan mengurangi pertumbuhan rambut wajah, jerawat, dan penuaan kulit [7, 8]. Oleh karena itu, produk perawatan kulit yang dilengkapi dengan kunyit tersedia secara komersial di pasaran [9]. Lebih dari 70 spesies/varietas kunyit dengan sifat kimia dan farmakologis yang berbeda telah diidentifikasi. Namun, ada kekurangan informasi ilmiah tentang sifat anti-melanogenik dari berbagai spesies kunyit dan komponen aktif potensial yang ada dalam kunyit. Kurkuminoid adalah senyawa aktif utama yang bertanggung jawab atas sebagian besar aktivitas biologis kunyit. Kurkuminoid memiliki potensi dalam kosmetika sebagaiantioksidan, antiinflamasi,dan agen pencerah kulit [7, 8]. Namun, dalam penelitian sebelumnya, kami menemukan variasi yang signifikan dalam kandungan kurkuminoid dalam kunyit, dan beberapa spesies (C. amada, C. zedoaria) bahkan tidak mengandung kurkumin [10]. Kami juga melaporkan antijamur,antioksidan, dan aktivitas vasodilatasi dari berbagai spesies dan varietas kunyit [10-13]. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh spesies kunyit yang berbeda, yaitu C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada, dan C. zedoaria, terhadap enzim tirosinase dan untuk mengidentifikasi senyawa kimia spesifik yang bertanggung jawab atas enzim tirosinase.anti-tirosinaseaktivitas. Kami juga mengevaluasi aktivitas penghambatan tirosinase dan efek anti-melanogenik dari senyawa aktif murni pada sintesis melanin dalam sel melanoma B16F10.

hasil dan Diskusi

Di antara empat spesies kunyit yang berbeda, ekstrak MeOH C. amada menunjukkan efek penghambatan tirosinase jamur maksimum dengan nilai IC50 53,4 ± 2,7, diikuti oleh C. xanthorrhiza, C. aromatic, dan C. zedoaria (Gbr. 1a). Kurkumin adalah komponen aktif utama kunyit (Curcuma longa) dan memiliki berbagai aktivitas biologis, termasuk aktivitas anti-kanker, anti-inflamasi, anti-bakteri, anti-jamur, dan antioksidan. Ini menunjukkan aktivitas anti-tirosinase 75-kali lipat lebih kuat daripada arbutin dan asam kojic [14]. Namun, dalam penelitian sebelumnya, kami melaporkan bahwa ada variasi yang signifikan dalam kandungan kurkumin pada spesies kunyit yang berbeda [10].

Kurkumin hadir di C. xanthorrhiza dan C. aromatik tetapi tidak ada di C. zedoaria dan C. amada [10]. Temuan menarik dari penelitian ini adalah, tanpa kurkumin, C. amada menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase yang kuat. Hasil ini menunjukkan bahwa pasti ada beberapa senyawa aktif C. amada yang dikaitkan dengan efek anti-tirosinase yang kuat. Aktivitas anti-tirosinase C. xanthorrhiza dan C. aromatica mungkin karena kandungan kurkuminnya. Namun, kami tidak dapat mengesampingkan kemungkinan adanya senyawa lain. Ekstrak MeOH C. amada difraksinasi dengan air, n-heksana, dan EtOAc. Di antara ketiga fraksi ini, EtOAc menunjukkan efek penghambatan yang jauh lebih kuat daripada air dan n-heksana (Gbr. 1b). Oleh karena itu, bagian EtOAc diambil untuk fraksinasi lebih lanjut. Aktivitas anti-tirosinase dari enam fraksi [n-heksana:EtOAc; 100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5), dan 0:100 (F6)] diperoleh dari bagian EtOAc C. amada dibandingkan. Di antara enam fraksi ini, F6 dan F3 menunjukkan aktivitas anti-tirosinase yang secara signifikan lebih tinggi daripada yang lain (Gbr. 1c). Kemudian struktur kimia kelima senyawa dari fraksi F3 dan F6 diidentifikasi menurut spektrum 1 H NMR dan 13C NMR. Data puncak adalah sebagai berikut:

Senyawa 1:

kristal bentuk jarum tidak berwarna; UV maks: nm 234, 285. ESI-MS ( plus ) m/z: 247,3 [M plus H] plus , 229,4 [ M plus H-H2O] plus . 1 H-NMR (CD3OD): 7,22 (1H, s, H-12), 5,59 (1H, br d, J=12 Hz, H{{20}}) , 3,99 (1H, s, H-5), 3,85 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,69 (1H, d, J=16 Hz, H-9b), 2,57 (1H, dddd, J=13, 13, 12, 4 Hz, H-2a), 2,26 (1H, m, H{{46 }}a), 2,20 (1H, m, H{{50}}b), 2,09 (3H, s, H-13), 1,57 (3H, s, H-15), 1,32 (1H, ddd, J=13, 13, 4 Hz, H-3b), 1,28 (3H, s, H-14). 13C-NMR (CD3OD): 194.2(C-6) 160.2(C-8), 139.7(C12), 132.8 (C-1), 132.0(C-10 ), 124.3(C-11), 123.0(C-7), 67.8(C-5), 65.2(C-4), 42.5(C-9 ), 39.0(C-3), 25.4(C-2), 15.7 (C-15), 15.4(C-14), 10.7(C-13 ) (Data pelengkap). Dari perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [15, 16], zat itu diidentifikasi sebagai zederone (Gbr. 2). Ini adalah seskuiterpen, sebelumnya diisolasi dari C. amada dan C. zedoaria dan telah dilaporkan untuk efek analgesik, anti-inflamasi, anti-jamur dan sitotoksiknya [12, 17-20].

Senyawa 2:

minyak tidak berwarna; UV maks: nm 243, 280. ESIMS ( plus ) m/z: 231.0 [M plus H] plus , 223,3 [M plus H-H2O] plus . 1 H-NMR (CD3OD): 7,16 (1H, s, H-12), 5,83 (1H, s, H-5), 5,21 (1H, dd, J=12 Hz , 5 Hz, H-1), 3,73 (1H, d, J=16 Hz, H-9a), 3,63 (1H, d, J=16 Hz, H -9b), 2,45 (1H, ddd, J=15 Hz, 11 Hz, 4 Hz, H-3a), 2,31 (1H, m, H-2a ), 2.20 (1H, dddd, J=12 Hz, 12 Hz, 12 Hz, 4 Hz, H-2b), 2.06 (3H, s, H{{57} }), 1,92 (3H, s, H-14), 1,89 (1H, m, H-3b), 1,25 (3H, s, H-15). 13C-NMR (CD3OD): 191,8 (C-6), 158.6 (C-8), 147.6 (C-4), 140.0 (C-12), 136.1 ( C-10), 133.3 (C-5), 132.0 (C-1), 124.6 (C-11), 123.1 (C-7), 42.4 ( C-9), 41,4 (C-3), 27,3 (C-2), 19,3 (C-14), 15,9 (C-2), 9,9 ( C-13) (Data Tambahan). Dari perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [21], zat tersebut diidentifikasi sebagai furanodienone (Gbr. 2). Itu diisolasi dari Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. mantan kait. f [22], Curcuma zedoaria [19], Curcuma amada [12] dan Curcuma wenyujin [23]. Ini adalah furanosesquiterpenoid yang menunjukkan aktivitas anti-jamur [12], anti-inflamasi [19], anti-kanker [24], anti-bakteri dan anti-oksidan [22].

Senyawa 3:

minyak kekuningan; UV maks: nm 275. ESIMS ( plus ) m/z: 383,3 [M plus Na] plus , 361,3 [M plus H] plus , 343,2 [M plus H-H2O] plus . 1 H-NMR (CD3OD): 6,99 (2H, dd, J=9, 2 Hz, H-2´´, -6´´), 6,67 (2H, d, J=9 Hz, H-3´´, -5´´), 6,52 (2H, s, H-2´, -6´), 4,63 (1H , br b, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,89 (1H, m, H-5), 3,85 ( 3H, s, 5´-OCH3), 2,63 (2H, m, H-7), 1,82 (1H, m, H-2a), 1,78 (1H, m, H{{6{ {107}}}}a), 1,73 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{72} }b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 156,3 (C-4´´), 149.5 (C-5´), 146.4 (C-3´), 134,5 (C-4 ), 134,44 (C-1´), 134,41 (C-1´´), 130.4 (C-2´´, -6´´), 116,1 (C{ {104}}´´, -5´´), 108,0 (C-2´), 102,8 (C-6´), 75,2 (C-1), 72,6 ( C-5), 65,6 (C3), 56,6 (5´-OCH3), 41.1 (C-2), 39,5 (C-4), 39,2 (C-6) 31,8 (C-7) (Data Tambahan). Dari perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [25], zat tersebut diidentifikasi sebagai 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {145}} metoksifenil)-7-(4-hidroksifenil) heptana (Gbr. 2). Itu diisolasi dari rimpang Zingiber officinale, dan sifat antioksidannya dipelajari [25].

Senyawa 4:

sirup kental; UV maks: nm 281. ESIMS ( plus ) m/z: 385,3 [M plus Na] plus , 363,3 [M plus H] plus , 345,2 [M plus H-H2O] plus . 1 H-NMR (CD3OD): 6,75 (1H, d, J=2 Hz, H-2´), 6,68 (1H, d, J=8 Hz, H{{21 }}´), 6,64 (1H, J=8 Hz, H-5´´), 6,61 (1H, J=2 Hz, H-2´´), 6,60 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,49 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´´), 3,80 (3H, s, 3´-OCH3), 3,73 (2H, m, H-3, -5), 2.64-2.47 (4H, m, H{{59 }}a, -1b, -7a, -7b), 1.71-1.65 (4H, m, H-2a, {{ 68}}b, -6a, -6b), 1,61 (2H, m, H-4a, -4b). 13C-NMR (CD3OD): 148,8 (C-3´), 146.1 (C-3´´), 145.4 (C-4´), 144.2 (C-4 ), 135,24 (C-1´ atau C-1´´), 135,22 (C-1´ atau C-1´´), 121,8 (C{{101 }}´), 120.6 (C-6´´), 116,5 (C-2´´), 116.3 (C-5´´), 116.1 (C-5´ ), 113,2 (C-2´), 70,94 (C-3 atau C-5), 70,92 (C-3 atau C-5), 56,4 (3 -OCH3), 44.9 (C-4), 40.8 (C-2, -6), 32,3 (C-1), 32.1 (C-7) (Data pelengkap). Dari perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [26, 27], zat tersebut diidentifikasi sebagai minyak 3,5-dihidroksi-1-(3,4-dihidroksifenil){{150 }} (4-hidroksi-3-metoksifenil) heptana (Gbr. 2). Itu diisolasi dari rimpang Tacca chantrieri [26] dan Curcumalonga L. [27]. Mereka adalah diarilheptanoid yang menunjukkan aktivitas sitotoksik [26] dan anti-tumor [27].

Senyawa 5:

minyak tidak berwarna; UV max nm: 279. ESI-MS ( plus ) m/z: 413,3 [M plus Na] plus , 391,3 [M plus H] plus , 373,3 [M plus HH2O] plus . 1 H-NMR (CD3OD): 6,76 (1H, s, H-2´´), 6,67 (1H, d, J=8 Hz, H{{20}} ), 6,21 (1H, dd, J=8, 2 Hz, H-6´), 6,53 (2H, s, H-2´, -6´´ ), 4,63 (1H, br d, J=12 Hz, H-1), 4,21 (1H, m, H-3), 3,83 (3H, s, 5´-OCH3) , 3,78 (3H, s, 3-OCH3), 2,65 (2H, m, H-7), 1,84 (1H, m, H-2a), 1,79 (1H, m, H-6a), 1,74 (1H, m, H-2b), 1,69 (1H, m, H-4a), 1,68 (1H, m, H{{ 75}}b), 1,53 (1H, m, H-4b). 13C-NMR (CD3OD): 149,5 (C-5´), 148,8 (C-3´´), 146.4 (C-3´), 145.4 (C-4 ), 135,3 (C-1´), 135,2 (C-1´´), 134,4 (C-4´), 121,9 (C-6´´), 116.1 (C-5´´), 113,4 (C-2´´), 108,0 (C-2´), 102,7 (C-6´), 75,2 (C{ {121}}), 72,5 (C-5), 65,6 (C-3), 56,6 (5´-OCH3), 56,3 (3´´-OCH3), 41,2 (C{{140} }), 39,4 (C-4), 39,3 (C-6), 32.2 (C-7) (Data Tambahan). Dari perbandingan data ini dengan yang dilaporkan dalam literatur [20], zat tersebut diidentifikasi sebagai 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi{ {157}}metoksifenil)- 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil) heptana (Gbr. 2) dan tidak ada informasi tentang aktivitas biologisnya. Kami mengisolasi senyawa 3, 4, dan 5 untuk pertama kalinya dari C. amada. Semua senyawa menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap tirosinase jamur

Lima senyawa, yaitu zederon, furanodienon, 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-( 4-hidroksifenil) heptana, 3,5-dihidroksi-1-(3,4-hidroksifenil piring)-7-(4-hidroksi-3- metoksifenil) heptana dan 1,5-epoksi-3-hidroksi-1-(3,4-dihidroksi-5-metoksifenil)- 7-(4- hidroksi-3-metoksifenil) heptana, diisolasi dari fraksi F3 dan F6. Senyawa yang diisolasi menunjukkan aktivitas anti-tirosinase dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Di antara kelima senyawa tersebut, senyawa 4 menunjukkan aktivitas anti-tirosinase yang jauh lebih kuat daripada arbutin. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam efek anti-tirosinase antara senyawa 5 dan arbutin (Gbr. 3). Efek dari senyawa yang diisolasi pada viabilitas seluler dipelajari pada sel melanoma murine B16F10. Sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi senyawa 50, 100, 200, dan 400 M selama 48 jam. Senyawa yang diisolasi tidak menunjukkan efek sitotoksik hingga 200 M, namun, sekitar lima puluh persen kematian seluler diamati pada semua kasus pada konsentrasi 400 M (Gbr. 4). Dengan demikian, konsentrasi hingga 200 M digunakan untuk menilai antitirosinase intraseluler dan efek anti-melanogeniknya.

Untuk menentukan aktivitas anti-melanogenik dan anti-tirosinase dari senyawa yang diisolasi, efeknya pada kandungan melanin dan aktivitas tirosinase dievaluasi dalam sel melanoma B16F10. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, senyawa terisolasi kami yang bergantung pada dosis menghambat kandungan melanin intraseluler dan aktivitas tirosinase. Senyawa 4 secara signifikan lebih kuat daripada obat kontrol positif arbutin dalam efek penghambatan melanin dan tirosinase. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara senyawa 5 dan arbutin. Karena tirosinase seluler meningkatkan produksi melanin, pengurangan aktivitas tirosinase merupakan strategi yang efisien untuk pengembangan agen anti-melanogenik. Untuk ini, kami mengevaluasi sifat penghambatan aktivitas tirosinase intraseluler dan melanogenesis dalam sel melanoma B16F10. Mirip dengan temuan aktivitas penghambatan tirosinase jamur, senyawa yang diisolasi menghambat aktivitas tirosinase intraseluler dan melanogenesis dengan cara yang bergantung pada dosis. Efek anti-tirosinase dari senyawa yang diisolasi menghasilkan sifat anti-melanogeniknya. Urutan aktivitas anti-tirosinase dan anti-melanogenik senyawa ini adalah senyawa 4 > arbutin > 5 > 2 > 3 > 1. Nilai IC50 yang dihitung dari senyawa 4 jauh lebih rendah dibandingkan dengan arbutin. Efektivitas senyawa 4 adalah 1,9- sampai 5-kali lipat lebih tinggi daripada keempat senyawa lainnya. Senyawa 5 juga menunjukkan aktivitas anti-tirosinase yang kuat yang sebanding dengan arbutin. Hasil kami menunjukkan bahwa senyawa 4 dan 5 dapat digunakan sebagai inhibitor tirosinase alami yang potensial dan kosmetik pemutih kulit. Stres oksidatif telah diusulkan untuk terlibat dalam mekanisme yang mendasari kelebihan produksi melanin [28]. Oleh karena itu, peran antioksidan telah diselidiki dalam berbagai gangguan kulit, termasuk fotokarsinogenesis atau melanoma [9]. Kami dan orang lain sebelumnya melaporkan sifat anti-oksidan C. amada [13, 29] yang mungkin bertanggung jawab atas efek antimelanogenik dari senyawa yang diisolasi. Dalam penelitian ini, kami mendeteksi efek penghambatan senyawa terisolasi pada sintesis melanin intraseluler dan aktivitas tirosinase yang diinduksi oleh -MSH. Dengan demikian, senyawa terisolasi kami dapat digunakan sebagai agen dalam kosmetik fungsional untuk mengembangkan perawatan pemutih kulit yang efektif.

Kesimpulan

Kami sangat menyarankan bahwa C. amada dapat memainkan peran penting sebagai inhibitor tirosinase yang efektif. C. amada dan senyawa bioaktifnya dapat digunakan dalam industri kosmetik sebagai bahan pemutih alami, industri makanan sebagai bahan antibrowning, dan bidang medis untuk pengobatan hiperpigmentasi. Namun demikian, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menyelidiki efek anti-melanogenik dari senyawa yang diisolasi pada model hewan.

Bahan dan metode

Bahan kimia

Tirosinase dari jamur dan arbutin dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-Tirosin berasal dari industri kimia murni Wako Ltd. (Osaka, Jepang). Metanol (MeOH), etil asetat (EtOAc), dan n-heksana dibeli dari Nacalai Tesque (Kyoto, Jepang). Silika gel (63-200 m, Kanto Chemical Co. Tokyo, Jepang) dan MeOH-d4 (CD3OD, Merck KGaA, Jerman) dibeli.

Persiapan bahan tanaman Empat spesies kunyit yang berbeda yaitu C. xanthorrhiza, C. aromatica, C. amada, dan C. zedoaria dibudidayakan di lahan tanah kelabu (pasir kasar 3,6 persen , pasir halus 30,9 persen , lanau 24,3 persen , lempung 32,8 persen , pH 7,4, NO{{10}}N 0,07 persen , NH4-N 0,08 persen , P 4,6 ng/g, K 42,9 ng/g) pada Pusat Sains Lapangan Subtropis, Universitas Ryukyus, Okinawa, Jepang. Suhu rata-rata bulanan, kelembaban, dan curah hujan selama periode budidaya masing-masing adalah 17–29 derajat , 61–83 persen , dan 22–369 mm. Praktek agronomi umum termasuk pemupukan dan irigasi disediakan. Rimpang dipanen ketika semua pucuk spesies layu sepenuhnya. Rimpang dicuci, diiris, dan dikeringkan dalam oven udara panas pada suhu 50 derajat selama 72 jam.

Ekstraksi sampel

Ekstraksi dilakukan dengan melarutkan bubuk kunyit yang berbeda (300 g) ke dalam MeOH (3 L) pada suhu kamar (25 derajat ) dan tekanan atmosfer dan disimpan selama dua hari dengan pengadukan magnet terus menerus untuk mencegah oksidasi oleh udara dan terlindung dari sinar matahari. Senyawa yang larut dalam pelarut disaring menggunakan kertas saring (No. 2, Advantec, Tokyo Roshi Kaisha Ltd., Tokyo, Jepang). Pelarut segar (MeOH) ditambahkan ke bahan tanaman yang digunakan dan proses ini diulang tiga kali. Solusi disaring yang mengandung senyawa tanaman dikeringkan dengan rotary evaporator di bawah tekanan berkurang pada 40 derajat. Hasil semua ekstrak disimpan di lemari es pada 4 derajat untuk analisis eksperimental.

Uji penghambatan tirosinase

Aktivitas penghambatan tirosinase ditentukan menurut metode sebelumnya [30], mengukur konsentrasi krom DOPA yang dihasilkan oleh aksi enzim tirosinase pada substrat tirosin. Secara singkat, sampel uji dilarutkan dalam 80 persen MeOH untuk mendapatkan konsentrasi yang berbeda (25, 50, dan 100 g/mL). Pelat sumur 96-diatur dengan urutan sebagai berikut: 120 L buffer fosfat (20 mM, pH 6,8), 20 L sampel, dan 20 L tirosinase jamur (500 U/mL dalam 20 mM fosfat penyangga). Setelah inkubasi selama 15 menit pada suhu 25 derajat , reaksi dimulai dengan menambahkan 20 L larutan 0,85 mM L-tirosin dan kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 25 derajat . Aktivitas tirosinase ditentukan dengan mengukur absorbansi pada 470 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (spektrofotometer Biotek Powerwave XS2). Arbutin digunakan sebagai kontrol positif, sedangkan 80 persen MeOH digunakan sebagai kontrol negatif. Persentase penghambatan tirosinase dihitung sebagai berikut:

di mana C adalah absorbansi kontrol negatif, B adalah absorbansi blanko, dan S adalah absorbansi sampel uji.

Isolasi senyawa bioaktif dari ekstrak kasar Curcuma amada

Mempertimbangkan hasil dari empat ekstrak kunyit, C. amada menunjukkan aktivitas anti-tirosinase yang jauh lebih tinggi daripada yang lain. Oleh karena itu, pemurnian senyawa aktif dengan panduan bioassay dari ekstrak kasar C. amada dilakukan. Untuk mengidentifikasi senyawa anti-tirosinase, fraksinasi dari ekstrak kasar C. amada dilakukan seperti yang dijelaskan pada Gambar. 5. Ekstrak kasar diencerkan dengan air suling dan kemudian diekstraksi dengan n-heksana, diikuti oleh EtOAc. Volume yang sama dari masing-masing pelarut dan larutan ekstrak kasar kemudian dicampur dengan mengocok selama 3 menit dalam corong pemisah. Semua fraksi dipekatkan sampai kering dengan rotary evaporator pada 40 derajat . Aktivitas anti-tirosinase dari ketiga fraksi ini ditentukan menurut prosedur di atas. Karena fraksi EtOAc menunjukkan aktivitas anti-tirosinase tertinggi, ia dipilih untuk isolasi dan pemurnian senyawa bioaktif. Fraksi EtOAc aktif diuapkan sampai kering dan dilakukan kromatografi pada kolom silika gel (75 g) (30 × 3 cm). Elusi dilakukan menggunakan n-heksana dan EtOAc dengan peningkatan jumlah EtOAc [100:0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) , dan 0:100 (F6)]. Aktivitas anti-tirosinase dari enam fraksi ini dilakukan sesuai dengan prosedur di atas, dan sebagian besar aktivitas ditemukan di F3 dan F6. Fraksi F3 dan F6 dimurnikan dengan HPLC fase terbalik C18 (COSMOSIL 5C18-AR-II; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Jepang) dilengkapi dengan air dan asetonitril sebagai fase gerak dengan laju alir 2,5 mL min−1, terdeteksi pada 280 nm.

Tiga puncak dari F3 dielusi pada 9,55, 13,66, dan 16,47 menit, dan empat puncak dari F6 dielusi pada 11,56, 12,20, 12,75, dan 15.03 menit sebagai zat putih tidak berwarna, yang penghambatan aktivitas terdeteksi di lima fraksi puncak dielusi pada 9,55 dan 16,47 menit dari F3 dan 11,56, 12,75, dan 15.03 menit (Data Tambahan) dari F6 (Gbr. 5). Senyawa hasil isolasi (~10 mg) dilarutkan dalam MeOH-d4 dan kemudian dilakukan analisis spektral. Spektrum resonansi magnetik nuklir (NMR) direkam pada spektrometer NMR BRUKER (500 MHz untuk 1 H dan 125 MHz untuk 13C) pada suhu kamar. Pergeseran kimia (δ) dicatat sebagai bagian per juta (ppm) relatif terhadap tetrametilsilane (TMS) sebagai standar internal. Eksperimen spektrometri massa dilakukan pada Waters Mass Spectrometer menggunakan probe electrospray ionization (ESI MS) pada kondisi instrumental berikut: Kolom: COSMOSIL 5C18-AR-II, (2 × 150) mm. Pelarut A: Air (0,1 persen asam format), Pelarut B: asetonitril, laju alir: 4 mL/menit, volume injeksi: 100 L, waktu pengoperasian: 35 menit, program waktu untuk F3: 75 persen B (0 menit) → 75 persen B (20 menit) → 100 persen B (20,1 menit) → 100 persen B (27 menit) → 75 persen B (27,1 menit) → 75 persen B (35 menit). Program waktu untuk F6: 45 persen B (0 menit) → 45 persen B (14 menit) → 100 persen B (14,1 menit) → 100 persen B (20 menit) → 45 persen B (20,1 menit) → 45 persen B (25 menit). Mode pompa: Gradien biner. Detail oven: CTO-20AC, suhu 40 derajat . Mode ionisasi MS: ES (plus), tegangan kapiler: 4,0 kV, tegangan kerucut: 20 V, suhu sumber: 120 derajat, suhu desolvasi: 350 derajat, aliran gas kerucut: 100 L/jam, aliran gas desolvasi: 800 L /h (Data Tambahan).

Aktivitas anti-tirosinase dari senyawa yang diisolasi

Senyawa hasil isolasi dilarutkan dalam MeOH pada konsentrasi 5, 10, 30, 50, 100, dan 200 M untuk masing-masing senyawa. Aktivitas anti-tirosinase ditentukan dengan menggunakan prosedur yang dijelaskan sebelumnya.

Penghambatan intraseluler tirosinase dan melanogenesis oleh senyawa yang diisolasi

Budaya sel

Sel melanoma B16F10 dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (FBS) dan 1 persen penisilin (10,000 U/mL)/streptomisin (100 ug/mL) pada suhu 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5 persen CO2.

Viabilitas sel

Sel-sel B16F10 dilapisi dengan kepadatan 5 × 104 sel/sumur dalam pelat 96-sumur. Setelah 24 jam, sel terkena berbagai konsentrasi senyawa terisolasi dan diinkubasi selama 48 jam tambahan pada 37 derajat. Setelah inkubasi, viabilitas sel ditentukan dengan uji MTS. Dua puluh mikroliter larutan MTS ditambahkan dan diinkubasi selama 60 menit. Setelah inkubasi, absorbansi sel ditentukan pada 490 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (Benchmark Plus).

Aktivitas anti-tirosinase dan anti-melanogenik dari senyawa yang diisolasi

Penentuan kadar melanin seluler dan uji aktivitas tirosinase dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [31], dengan sedikit modifikasi. Sel melanoma B16F10 dilapisi dengan kepadatan 5 × 104 sel/sumur di piring sumur 96-. Setelah 24 jam, sel terkena berbagai konsentrasi senyawa terisolasi atau arbutin. Setelah 1 jam, 100 nM -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) ditambahkan, dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 derajat. Untuk studi aktivitas anti-tirosinase, sel-sel kemudian dicuci dengan buffer fosfat dingin dan dilisiskan dengan buffer fosfat (pH 6,8) yang mengandung 1 persen Triton-X (90 L/sumur). Pelat dibekukan pada suhu -80 derajat selama 30 menit. Setelah pencairan dan pencampuran, 10 L 1 persen L-DOPA ditambahkan ke setiap sumur. Setelah inkubasi pada 37 derajat selama 2 jam, absorbansi diukur pada 490 nm. Untuk pengujian kandungan melanin, sel dicuci dua kali dengan buffer fosfat dan kemudian dilarutkan dalam 100 L NaOH (1 N) yang mengandung 10 persen DMSO. Sampel diinkubasi pada suhu 80 derajat selama 1 jam dan dicampur untuk melarutkan melanin. Densitas optik dari homogenat campuran diukur pada 490 nm.

Analisis statistik

Hasil dinyatakan sebagai mean ± SEM. Perbedaan statistik antara dua cara dievaluasi dengan uji-t Student. Beberapa perbandingan dilakukan dengan menggunakan analisis varians satu arah diikuti dengan uji Bonferroni. Perbedaan dianggap signifikan pada P <>

Ini adalah produk anti-kelelahan kami! Klik gambar untuk informasi lebih lanjut!

Referensi

1. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem GH. Agen hipopigmentasi: tinjauan terbaru pada aspek biologis, kimia, dan klinis. Sel Pigmen Res. 2006;19:550–71.

2. Loizzo MR, Tundis R, Menichini F. Inhibitor tirosinase alami dan sintetis sebagai agen antibrowning: Pembaruan. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2012; 11:378–98.

3. Lin YS, Chen HJ, Huang JP, Lee PC, Tsai CR, Hsu TF, dkk. Kinetika aktivitas penghambatan tirosinase menggunakan ekstrak daun vinifera Viti. Biomed Res Int. 2017:5232680.

4. Manini P, Napolitano A, Westerhof W, Riley PA, d' Ischia M. Orto-kuinon reaktif yang dihasilkan oleh oksidasi yang dikatalisis tirosinase dari agen depigmentasi kulit monobenzone: reaksi self-coupling dan konjugasi tiol dan kemungkinan implikasi untuk melanosit toksisitas. Chem Res Toksikol. 2009;13:1398–405.

5. Couteau C, Coiffard L. Ikhtisar agen pemutih kulit: obat-obatan dan produk kosmetik. Kosmetik. 2016; 3:27.

6. Al-Saleh I, Shinwari N, El-Doush I, Billedo G, Al-Amodi M, Khogali F. Perbandingan kadar merkuri dalam berbagai jaringan tikus albino dan tikus berpigmen yang diobati dengan dua merek krim pencerah kulit merkuri yang berbeda. Biometals: Int J peran Met ion Biol, Biochem, Med. 2004;17:167–75.

7. Gopinath H, Karthikeyan K. Kunyit: bumbu, kosmetik dan obat. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2018;84:16–21.

8. Vaughn AR, Branum A, Sivamani RK. Efek kunyit (Curcuma longa) pada kesehatan kulit: tinjauan sistematis dari bukti klinis. Phytother Res. 2016;30:1243–64.

9. Baliga MS, Katiyar SK. Kemoprevensi fotokarsinogenesis oleh tumbuhan diet terpilih. Photochem Photobio Sci. 2006;5:243–53.

10. Akter J, Hossain MA, Sano A, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Aktivitas antijamur berbagai spesies dan galur kunyit (Curcuma spp.) terhadap Fusarium Solani Sensu Lato. Pharm Chem J. 2018;52:292–7.

11. Akter J, Islam MZ, Hossain MA, Kawabata S, Takara K, Nguyen H, dkk. Relaksasi endotelium-independen dan saluran kalsium dari arteri serebral babi oleh spesies dan strain kunyit yang berbeda. J Tradit Pelengkap Med. 2018;9:297–303.

12. Akter J, Takara K, Islam MZ, Hossain MA, Sano A, Hou DX. Isolasi dan penjelasan struktur senyawa antijamur dari Curcuma amada. Asia Pac J Trop Med. 2019;12:123–9.

13. Akter J, Hossain MA, Takara K, Islam MZ, Hou DX. Aktivitas antioksidan berbagai spesies dan varietas kunyit (Curcuma spp): Isolasi senyawa aktif. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharm. 2019;215:9–17.

14. Khunlad P, Tundulawessa Y, Supasiri T, Chutrtong W. Tyrosinase aktivitas penghambatan kurkuminoid dari bubuk kunyit (Curcuma longa Linn.). Ilmu J SWU. 2008;24:125–39.

15. Giang PM, Putra PT. Isolasi seskuiterpenoid dari rimpang Curcuma aromatic Salisb Vietnam. J Kimia. 2000;38:96–9.

16. Asem SD, Laitonjan SW. Investigasi hubungan struktur-nonlinier zederone dari rimpang Curcuma caeca Roxb. Ind J Chem. 2012;51:1738–42.

17. Faiz Hossain C, Al-Amin M, Rahman KM, Sarker A, Alam MM, Chowdhury MH, dkk. Prinsip analgesik dari Curcuma amada. J. Etnofarmaka. 2015;163:273–7.

18. Ahmed Hamdi OA, Syed Abdul Rahman SN, Awang K, Abdul Wahab N, Looi CY, Thomas NF, Abd Malek SN. Konstituen sitotoksik dari rimpang Curcuma zedoaria. Sci World J. 2014;2014:321943.

19. Makabe H, Maru N, Kuwabara A, Kamo T, Hirota M. Seskuiterpen antiinflamasi dari Curcuma zedoaria. Nat Prod Res. 2006;20:680–5.

20. Kikuzaki H, Nakatani N. Cyclic diarylheptanoids dari rimpang Zingiber officinale. Fitokimia. 1996;43:273–7.

21. Dekebo A, Dagne E, Sterner O. Furanosesquiterpenes dari Commiphora sphaerocarpa dan pezina terkait dari mur sejati. Fitoterapi. 2002;73:48–55.

22. Joshi SC, Mathela CS. Aktivitas antioksidan dan antibakteri dari minyak atsiri daun dan furanodienone dan curzerenone penyusunnya dari Lindera pulcherrima (Nees.) Benth. mantan kait. f. Farmakogni Res. 2012;4:80–4.

23. Yang FQ, Li SP, Zhao J, Lao SC, Wang YT. Optimalisasi kondisi GC-MS berdasarkan resolusi dan stabilitas analit untuk penentuan simultan sembilan seskuiterpenoid dalam tiga spesies rimpang temulawak. J Pharm Biomed Anal. 2007;43:73–82.

24. Li YW, Zhu GY, Shen XL, Chu JH, Yu ZL, Fong WF. Furanodienone menghambat proliferasi dan kelangsungan hidup sel dengan menekan pensinyalan ER pada sel MCF-7 kanker payudara manusia. Biokimia Sel J. 2011;112:217–24.

25. Tao QF, Xu Y, Lam RY, Schneider B, Dou H, Leung PS, dkk. Diarylheptanoids dan monoterpenoid dari rimpang Zingiber officinale: sifat antioksidan dan sitoprotektif. J Nat Prod. 2008;71:12–17.

26. Yokosuka A, Mimaki Y, Sakagami H, Sashida Y. Diarilheptanoid baru dan glukosida diarilheptanoid dari rimpang Tacca chantrieri dan aktivitas sitotoksiknya. J Nat Prod. 2002;65:283–9.

27. Jiang JL, Jin XL, Zhang H, Su X, Qiao B, Yuan YJ. Identifikasi kandungan antitumor pada kurkuminoid dari Curcuma longa L. berdasarkan hubungan komposisi-aktivitas. J Pharm Biomed Anal. 2012;70:664–70.

28. Marrot L, Meunier JR. Kerusakan foto DNA kulit dan konsekuensi biologisnya. J Am Acad Dermatol. 2008;58:139–48.

29. Policegoudra RS, Abiraj K, Channe Gowda D, Aradhya SM. Isolasi dan karakterisasi senyawa antioksidan dan antibakteri dari rimpang jahe mangga (Curcuma amada Roxb.). J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 2007;852:40–8.

30. Tadtong S, Viriyaroj A, Vorarat S, Nimkuntat S, Suksamrarn S. Antitirosinase dan aktivitas antibakteri ekstrak kulit manggis. J Kesehatan Res. 2009;23:99–102.

31. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein menghambat melanogenesis melalui aktivasi jalur pensinyalan ERK. Int J Mol Med. 2010;25:923–7.