Faktor Fungsional Anti Penuaan Dan Mekanisme Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Hasil

3.1 Potensi bahan aktif dan target Cistanche deserticola

Dengan meninjau literatur dan menggabungkan dengan penelitian sebelumnya dari kelompok penelitian ini, 12 komponen kimia termasuk glikosida feniletanol, iridoid dan lignan dipilih sebagai senyawa target untuk penelitian farmakologi jaringan. Informasi spesifiknya ditunjukkan pada Tabel 3. Setelah menghapus duplikat dari database, diperoleh total 86 target untuk 12 bahan aktif potensial.

Cistanche berkualitas tinggi untuk anti penuaan

3.2 Target terkait penuaan

7753 dan 295 target terkait penuaan dikumpulkan masing-masing di database GeneCards dan OMIM.

3. 3 Sasaran umum obat dan penyakit serta pembangunan jaringan PPI

Persimpangan target obat dan target penyakit menghasilkan 75 target persimpangan, yang diimpor ke platform analisis jaringan STRING, node yang tidak terhubung dalam jaringan disembunyikan, dan jaringan PPI dibangun. Lihat materi publikasi yang disempurnakan. Ada total 45 node dan 59 koneksi di jaringan PPI. Delapan target inti disaring melalui analisis topologi, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.

3.4 Analisis pengayaan GO dan analisis pengayaan KEGG

Melalui database OmicsBean, target inti menjadi sasaran pengayaan fungsional GO dan analisis jalur KEGG. Analisis GO mencakup tiga aspek: komponen seluler, fungsi molekuler, dan proses biologis. 10 item teratas dengan nilai P terkecil ditampilkan dalam materi publikasi yang disempurnakan. Hasilnya menunjukkan bahwa proses biologis terutama melibatkan pengaturan metabolisme oksigen reaktif, regulasi positif respon imun, lokalisasi protein ke organel, pencernaan polisakarida, dll; komponen seluler terutama meliputi sistem endomembran, wilayah ekstraseluler, membran plasma, dan sel yang terikat membran.

Organ, badan sekretori ekstraseluler, aparatus Golgi, dll; fungsi molekuler terutama terkait dengan aktivitas glukosidase, aktivitas pengaturan oksida nitrat sintase, pengikatan karbohidrat, aktivitas -fruktosa furanosidase, dll. Sebanyak 27 jalur terkait penuaan diperoleh melalui penyaringan pengayaan KEGG, dan 20 jalur teratas ditarik ke dalam jalur diagram gelembung (lihat materi publikasi yang disempurnakan). Cistanche deserticola menunda penuaan.

Tabel 3 Bahan aktif Cistanche deserticola

Tabel 4: Target inti Cistanche deserticola untuk menunda penuaan

Ini terutama melibatkan jalur kanker, sistem neurosekretori dan jalur transduksi sinyal. Jalur kanker terutama mencakup kanker prostat, kanker payudara dan jalur lainnya; sistem neuroendokrin melibatkan jalur pensinyalan estrogen, jalur pensinyalan GnRH, dan jalur pensinyalan insulin (jalur pensinyalan insulin) dan seterusnya; jalur pensinyalan meliputi jalur pensinyalan fosfatidilinositol 3-kinase-protein kinase B (PI3K Akt) dan jalur pensinyalan fosfolipase D (jalur pensinyalan fosfolipase D).

3.5 Pembangunan jaringan jalur bahan-komponen-sasaran-bahan obat

Bahan aktif, target, dan jalur Cistanche deserticola yang menunda penuaan dipetakan ke dalam jaringan jalur target bahan bahan obat melalui perangkat lunak Cytoscape 3.8.0. Ada total 114 node dan 218 baris dalam jaringan ini (lihat materi publikasi yang disempurnakan).

3.6 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap masa hidup nematoda

Hasil uji toksisitas ditunjukkan pada Gambar 1. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, Cistanche deserticola 25 dan 50 ug·mL–1

Ini dapat memperpanjang umur nematoda. 100 ug·mL–1 tidak memiliki efek yang jelas. 200 dan 500 ug·mL–1

Ia memiliki toksisitas tertentu terhadap nematoda dan memperpendek umurnya. Berdasarkan hasil uji toksisitas, pilih

Cistanche deserticola diberikan pada konsentrasi massa 25, 50, 75, dan 100 ug·mL–1 untuk menentukan umur nematoda N2. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 5. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

Masa hidup nematoda dalam kelompok tersebut diperpanjang secara signifikan, sehingga percobaan selanjutnya dilakukan pada 25, 50, dan 75 ug·mL–1.

Gambar 1 Kurva kelangsungan hidup nematoda setelah pemberian konsentrasi massa Cistanche deserticola yang berbeda

• Legenda:

• Merah: Grup Kontrol
• Biru: Grup Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Hijau: Grup Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Ungu: Grup Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Oranye: Grup Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Coklat: Grup Cistanche 500 µg·mL⁻¹

• Sumbu:

• Sumbu Y: Tingkat Kelangsungan Hidup (%)

• Sumbu X: Waktu (t/d)

  
  

3.7 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap kemampuan stres nematoda

Di bawah kondisi stres oksidatif yang diinduksi H2O2-, dibandingkan dengan kelompok kontrol, umur nematoda pada kelompok perlakuan Cistanche deserticola diperpanjang (Gambar 2A). Umur rata-rata nematoda pada kelompok kontrol adalah (1,44±0.07) jam, dan Cistanche deserticola 75 ug·mL– Rata-rata umur nematoda pada kelompok 1 adalah (2,02 ±0.05) jam, dan masa hidup diperpanjang secara signifikan (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabel 5 Pengaruh konsentrasi massa Cistanche deserticola yang berbeda terhadap masa hidup nematoda (xˉ±s, n=100)

Catatan:Dibandingkan dengan kelompok kontrol, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap akumulasi lipofuscin dan kemampuan menekuk tubuh nematoda

Lipofuscin secara bertahap terakumulasi seiring bertambahnya usia. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat fluoresensi biru nematoda pada kelompok Cistanche deserticola 25, 50, dan 75 ug·mL–1 menurun masing-masing sebesar 15.09%, 28.7%, dan 39.86% pada hari ke 7 (Gambar 3A~B); Pada hari ke 11, kadar fluoresensi biru menurun masing-masing sebesar 8,55%, 22,36%, dan 36,84% yang menunjukkan bahwa Cistanche deserticola menghambat akumulasi lipofuscin.

Pengaruh Cistanche deserticola terhadap kemampuan pembengkokan tubuh nematoda ditunjukkan pada Gambar 3C. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, jumlah waktu pembengkokan tubuh nematoda pada kelompok Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 meningkat masing-masing sebesar 25% dan 36% dalam waktu 30 detik pada hari ke-3 dan ke-7. 17%, menunjukkan bahwa Cistanche deserticola dapat mendorong pembengkokan tubuh nematoda.

3.9 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap kemampuan menelan dan kemampuan reproduksi nematoda

Pada hari ke 3 dan 7, dibandingkan dengan kelompok kontrol, tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik dalam laju pemompaan faring (jumlah pompa faring dalam 60 detik) dari nematoda pada kelompok pemberian Cistanche deserticola (Gambar 4A), yang menunjukkan bahwa Cistanche deserticola tidak mengubah laju pemompaan nematoda N2 di faring. Asupan makanan, efek umur panjang yang dimediasi Cistanche deserticola tidak bergantung pada pembatasan makanan. Tidak ada perubahan signifikan dalam jumlah telur (Gambar 4B) dan jumlah keturunan (Gambar 4C) nematoda yang diberi obat dibandingkan dengan kelompok kontrol, menunjukkan bahwa Cistanche deserticola tidak mempengaruhi kemampuan reproduksi nematoda.

3.10 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap ROS, kandungan MDA dan aktivitas enzim antioksidan

Toksisitas stres akut menyebabkan peningkatan kadar ROS. Seperti terlihat pada Gambar 5A dan 5B, dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat akumulasi ROS nematoda pada kelompok Cistanche deserticola berkurang secara signifikan pada hari ke 7 pemberian (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Legenda:

• Merah: Grup Kontrol
• Biru: Grup Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Hijau: Grup Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Ungu: Grup Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Oranye: Grup Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Coklat: Grup Cistanche 500 µg·mL⁻¹

3.11 Pengaruh Cistanche deserticola pada ekspresi mRNA gen terkait penuaan

Jalur pensinyalan insulin (IIS) di antara 20 jalur teratas yang dianalisis oleh KEGG berkaitan erat dengan penuaan C. elegans, dan penelitian mekanismenya relatif matang [10], sehingga memverifikasi ekspresi gen terkait penuaan pada jalur pensinyalan insulin. Peptida mirip insulin (ILP) yang dilepaskan di C. elegans berikatan dengan reseptor DAF-2 dan mengaktifkan produk akhir glikasi lanjutan-1 (AGE-1), yang selanjutnya mengaktifkan protein kinase B{{ 7}}/2 (Akt-1/2). , memfosforilasi faktor transkripsi DAF-16, menghasilkan aktivitas DAF-16 dan

Migrasinya ke nukleus terhambat [11]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat ekspresi DAF-2, AGE-1, dan Akt-1 mRNA pada nematoda di Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 kelompok berkurang secara signifikan (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). Telah ditunjukkan bahwa efek perpanjangan hidup yang dimediasi oleh Cistanche deserticola bergantung pada jalur pensinyalan IIS. Gen sir-2.1 berperan penting dalam aktivitas fisiologis seperti penuaan nematoda, stres, dan apoptosis. Peningkatan regulasi ekspresi gen sir-2.1 akan memperpanjang umur nematoda [12], namun tidak ada efek setelah pemberian obat. Mengubah level ekspresi SIR-2 secara signifikan. 1 mRNA (Gambar 6). HSF-1 dan SKN-1 memainkan peran penting dalam mengatur stres oksidatif dan penuaan pada C. elegans [11]. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok kontrol, Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

Tingkat ekspresi HSF-1, HSP-16. 1,HSP-16. 2 dan SKN-1 mRNA pada kelompok C. elegans meningkat secara signifikan (Gambar 6). Faktor transkripsi DAF-16/forkhead box protein (FOXO) dan SKN-1/faktor transkripsi inti E2-faktor terkait 2 (Nrf2) diaktifkan dan dapat mengatur banyak gen yang mengkode terkait antioksidan protein [13]. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat ekspresi SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2, dan MTL-1 mRNA nematoda di kelompok kontrol Kelompok Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 meningkat secara signifikan, menunjukkan bahwa Cistanche deserticola dapat meningkatkan kapasitas antioksidan. memperpanjang hidupmu. Pembatasan pola makan dapat meningkatkan fungsi mitokondria dan memperpanjang umur dengan membatasi asupan makanan [14]. Tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik dalam ekspresi EAT-2 mRNA pada nematoda di masing-masing kelompok, yang menunjukkan bahwa efek perpanjangan hidup yang dimediasi oleh Cistanche deserticola tidak terjadi melalui jalur pembatasan pola makan (Gambar 6).

Gambar 4 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap kemampuan menelan dan kemampuan reproduksi nematoda (xˉ±s, n=5)

Legenda:

• 对照组: Grup kontrol
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Grup Cistanche 25 ug/mL
• kapasitas 50 ug·mL-1组: Grup Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Grup Cistanche 75 ug/mL

Grafik B:

• 30 detik: Jarak renang horizontal dalam 30 detik / waktu
• 第3日: Hari ke-3
• 第7日: Hari ke 7

Grafik C:

• 相关水平的百分率: Persentase level yang sesuai
• 第7日: Hari ke 7
• 第11日: Hari ke-11

Grafik A:

• 60 s内爬壁次数: Jumlah panjat tembok dalam 60 detik
• 第{{0}}日: Hari 0
• 第3日: Hari ke-3
• 第7日: Hari ke 7

Grafik B:

• 广泛测试得分: Skor tes lapangan terbuka
• 第1日: Hari ke-1
• 第2日: Hari ke-2
• 第3日: Hari ke-3
• 第4日: Hari ke-4
• 第5日: Hari ke-5

Grafik C:

• 千元迷宫次数: Kesalahan labirin Y
• 第1日: Hari ke-1
• 第2日: Hari ke-2
• 第3日: Hari ke-3
• 第4日: Hari ke-4
• 第5日: Hari ke-5

3. 12 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap umur nematoda dengan gen mutan terkait

Dibandingkan dengan kelompok kontrol, kurva umur nematoda mutan gen daf{{0}}, skn-1, dan hsf-1 pada kelompok Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 menunjukkan hasil yang sama. tidak bergeser secara signifikan ke kanan setelah perawatan (Gambar 7A~C). Umur rata-rata makan nematoda mutan gen -2 meningkat sebesar 16,45% (P <0,001, Gambar 7D).

Hasilnya menunjukkan bahwa efek perpanjangan hidup yang dimediasi oleh Cistanche deserticola berhubungan dengan gen daf-16, hsf-1 dan skn-1, tetapi tidak dengan gen eat-2 .

3. 13 Pengaruh Cistanche deserticola pada translokasi nuklir protein DAF-16 dan SKN-1

Gambar representatif ekspresi protein DAF-16 dalam sitoplasma, ruang antar sel, dan nukleus ditunjukkan pada Gambar 8A. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, rasio lokalisasi inti protein DAF-16 pada nematoda meningkat secara signifikan dan rasio lokalisasi sitoplasma berkurang secara signifikan setelah pemberian Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Gambar 5 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap ROS, kandungan MDA dan aktivitas enzim antioksidan pada nematoda (xˉ±s, n=100)

Legenda:

• 对照组: Grup kontrol
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Grup Cistanche 25 ug/mL
• kapasitas 50 ug·mL-1组: Grup Cistanche 50 ug/mL
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Grup Cistanche 75 ug/mL

Grafik B:

• 30 detik: Jarak renang horizontal dalam 30 detik / waktu
• 第3日: Hari ke-3
• 第7日: Hari ke 7

Grafik C:

• 相关水平的百分率: Persentase level yang sesuai
• 第7日: Hari ke 7
• 第11日: Hari ke-11

Grafik A:

• 60 s内爬壁次数: Jumlah panjat tembok dalam 60 detik
• 第{{0}}日: Hari 0
• 第3日: Hari ke-3
• 第7日: Hari ke 7

Grafik B:

• 广泛测试得分: Skor tes lapangan terbuka
• 第1日: Hari ke-1
• 第2日: Hari ke-2
• 第3日: Hari ke-3
• 第4日: Hari ke-4
• 第5日: Hari ke-5

Grafik C:

• 千元迷宫次数: Kesalahan labirin Y
• 第1日: Hari ke-1
• 第2日: Hari ke-2
• 第3日: Hari ke-3
• 第4日: Hari ke-4

• 第5日: Hari ke-5

  
  

3. 14 Pengaruh Cistanche deserticola terhadap ekspresi protein SOD-3, GST-4 dan HSP-16.2 pada nematoda

Tingkat ekspresi protein SOD-3, GST-4, dan HSP-16.2 divisualisasikan dan diukur masing-masing menggunakan nematoda transgenik CF1553, CL2166, dan TJ375 (Gambar 9). Dibandingkan dengan kelompok kontrol, tingkat ekspresi protein SOD-3 dan GST-4 pada nematoda di setiap kelompok konsentrasi massa Cistanche deserticola meningkat secara signifikan (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).