Model Transgenik Mengungkap Peran Klotho dalam Perkembangan Kanker Pankreas Dan Membuka Jalan Untuk Terapi Baru Berbasis Klotho

Silahkan klik{0}}untuk informasi lebih lanjut

Ringkasan Sederhana:Kami bertujuan untuk mempelajari peran klotho protein anti-penuaan dan isoform yang disekresikannya, Inggris, pada kanker pankreas. Tiga model in vivo, termasuk model tikus genetik baru dan analisis bioinformatika, menunjukkan klotho sebagai penekan tumor pada adenokarsinoma duktus pankreas dan mengungkap pola hipermetilasi DNA klotho yang unik pada tumor pankreas. Hasil ini memiliki nilai prognostik yang signifikan, dan selanjutnya menunjukkan bahwa ia dapat berfungsi sebagai agen terapi untuk adenokarsinoma duktus pankreas.

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Abstrak: Klotho merupakan protein transmembran anti aging, yang dapat ditumpahkan dan dapat berfungsi sebagai hormon. Data yang terkumpul menunjukkan bahwa klotho adalah penekan tumor dalam beragam keganasan, dan menunjuk subdomain KL1 sebagai wilayah aktif protein untuk aktivitas ini. Kami bertujuan untuk mempelajari peran klotho sebagai penekan tumor pada adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC). Analisis bioinformatika dari kumpulan data The Cancer Genome Atlas (TCGA) mengungkapkan korelasi antara kelangsungan hidup pasien PDAC, tingkat ekspresi klotho, dan metilasi DNA, dan menunjukkan pola hipermetilasi unik klotho pada tumor pankreas. Efek in vivo klotho dan KL1 diperiksa menggunakan tiga model tikus. Menggunakan model genetik baru, menggabungkan knockdown klotho pankreas dengan mutasi di Kras, kurangnya klotho berkontribusi pada generasi PDAC dan penurunan kelangsungan hidup tikus. Dalam model xenograft, pemberian partikel virus yang membawa langit, isoform klotho yang disambung yang mengandung domain KL1, menghambat tumor pankreas.beli cistancheTerakhir, pengobatan dengan langit larut memperpanjang kelangsungan hidup Pdx1-Cre; KrasG12D/plus ; Tikus Trp53R172H/ plus (KPC), model yang diketahui merekapitulasi PDAC manusia.bioflavonoid,Kesimpulannya, penelitian ini memberikan bukti bahwa klotho adalah penekan tumor di PDAC. Lebih lanjut, data ini menunjukkan bahwa tingkat ekspresi klotho dan metilasi DNA dapat memiliki nilai prognostik pada pasien PDAC, dan bahwa pemberian sKL eksogen dapat berfungsi sebagai strategi terapi baru untuk mengobati PDAC.

Kata kunci:kloto; KL1; sKL; penekan tumor; kanker pankreas; PDAC

1. Perkenalan

Kanker pankreas adalah salah satu kanker yang paling agresif, dengan tingkat kelangsungan hidup 5-tahun sebesar 9 persen . Insiden dan kematian meningkat, dengan 60.430 kasus baru dan 48.220 kematian diperkirakan pada tahun 2021 di AS saja[1]. Adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) mewakili 85-90 persen dari semua neoplasma pankreas ganas. Model saat ini menunjukkan perkembangannya dari neoplasia intraepitel pankreas jinak (PanlN)1-3 menjadi karsinoma invasif, bersama dengan akuisisi mutasi genetik. Aktivasi Kras dianggap sebagai langkah pertama menuju keganasan [2], dan pada model tikus, mengarah pada pengembangan PanIN selama 9 bulan [3]. Meskipun PDAC nyata pada tikus ini jarang terjadi, dalam model KPC, menggabungkan mutasi Kras dengan hilangnya penekan tumor p53 [4], PDAC biasanya berkembang pada usia 3-6 bulan [5].

Cistanche dapat anti-penuaan

Klotho (di sini digunakan sebagai klotho) adalah protein transmembran tipe I yang terlibat dalam regulasi penuaan [6]. Pada tikus, defisiensi klotho menyebabkan sindrom yang menyerupai penuaan yang dipercepat, sementara ekspresi berlebih klotho memperpanjang rentang hidup [7,8]. Daerah ekstraseluler klotho terdiri dari dua domain homolog, KL1 dan KL2, yang dapat dipisahkan dari membran dan bertindak sebagai hormon sirkulasi [9-11]. Isoform klotho kedua yang disambung secara berbeda disekresikan (Inggris). Langit identik dengan KL1, ditambah 15 asam amino tambahan di C-terminus. Aktivitas yang berbeda dari klotho telah dijelaskan, termasuk aktivasi pensinyalan faktor pertumbuhan fibroblas (FGF)23 [12,13], regulasi saluran kation potensial reseptor transien subfamili V anggota (TRPV)5 saluran kalsium [14,15], dan penghambatan saluran kalsium jalur insulin dan insulin-like growth factor (IGF)-1 [8,16,17].

Klotho diekspresikan terutama di ginjal dan otak, tetapi juga di berbagai jaringan, termasuk pankreas eksokrin dan endokrin [7,17-20]. Aktivitas fisiologisnya di pankreas belum ditentukan; Namun, ada bukti keterlibatannya dalam regulasi homeostasis glukosa. Klotho menginduksi produksi insulin dan sekresi in vitro dan in vivo, melemahkan sensitivitas insulin pada tikus, dan habis di pulau pankreas pasien diabetes mellitus tipe 2 (T2DM) [8,19-22]. Klotho adalah penekan tumor yang poten pada banyak keganasan, termasuk kanker gastrointestinal [16,17,23-30]. Ini dibungkam secara epigenetik pada kanker, dan baik klotho maupun Karl mengurangi pertumbuhan sel kanker secara in vitro dan in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. Pada kanker pankreas, downregulation klotho berkorelasi dengan kelangsungan hidup pasien. Secara in vitro, klotho mengurangi pertumbuhan sel kanker pankreas dan menghambat jalur IGF-I dan bFGF[17,34].

Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk menguraikan peran klotho sebagai penekan tumor di PDAC dengan memanfaatkan tiga model in vivo. Menggunakan model genetik baru, kami menunjukkan bahwa knockdown klotho pankreas berkontribusi pada pengembangan PDAC dan mengurangi kelangsungan hidup tikus mutan Kras. Dalam model kedua, kami menunjukkan bahwa pemberian partikel virus yang membawa sKL menghambat tumor pankreas dalam model xenograft. Terakhir, pengobatan dengan langit rekombinan terlarut memperpanjang kelangsungan hidup tikus KPC. Hasil ini menunjukkan peran koto sebagai pemain penting dalam pengembangan PDAC dan menyarankan klotho sebagai strategi terapi untuk mengobati pasien PDAC.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Analisis TCGA Menggunakan UCSC Xena Browser

Ekspresi gen RNAseg (IlluminaHiSeq) dan set data metilasi DNA (Methylation450k) untuk kelompok The Cancer Genome Atlas (TCGA)Pancreatic Cancer (PAAD) dipelajari menggunakan University of California Santa Cruz (UCSC) Xena Browser (http://xena.ucscedu/, diakses pada 19 Juli 2020)[35].tangkiMenggunakan Browser Xena, kelangsungan hidup keseluruhan dan interval bebas perkembangan pasien kanker pankreas dianalisis menurut ekspresi klotho atau metilasi DNA KLOTHO, dan plot Kaplan-Meier dibuat. Data individu yang digandakan dihapus dengan memfilter hanya untuk tumor primer. Data ekspresi gen, yang diberikan dalam satuan log2(x plus 1), dibagi menjadi dua kelompok menurut median; Data metilasi DNA dibagi menjadi dua kelompok menurut kuartil bawah dan atas.

Untuk metilasi DNA KLOTHO spesifik lokasi, sampel dengan ekspresi klotho tingkat rendah atau tinggi, masing-masing ditentukan oleh kuartil bawah atau atas, dianalisis lebih lanjut. Nilai 36] untuk setiap situs metilasi dihitung, dan korelasi dengan ekspresi klotho dalam sampel yang sesuai diperiksa melalui koefisien korelasi Pearson (r).

2.2. Bahan Kimia, Antibodi, dan Konstruksi

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini termasuk klotho varian sambatan manusia yang dapat larut, terdiri dari asam amino34-549(domain ski; nomor akses BAA24941.1), dengan 15-urutan unik asam amino di C-terminus({ {6}};PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, AS); glukosa Floris, Misgav, Israel）, insulin manusia Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsvrd, Den-mark), dan luciferin (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Antibodi yang digunakan dalam penelitian ini termasuk kontrol isotipe IgG2a tikus (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan anti- -aktin (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) . Antibodi anti-klotho yang ditujukan terhadap domain KL1 (KM2076) adalah hadiah dari Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Jepang.

2.3.Produksi dan Pemurnian Vektor AAV

Vektor AAV9, vektor kosong nol, dan langit (mengandung isoform varian sambatan klotho yang disekresikan, nomor aksesi BAA24941.1) diproduksi dan dimurnikan di fasilitas tingkat keamanan hayati 2 dari United Mixta UAB-VHIR dan Unit Produksi Vektor (VPU) Secara Singkat , vektor dihasilkan menggunakan sistem transfeksi rangkap tiga dalam sel HEK293. Setelah 48 jam, vektor AAV dipanen, diperlakukan dengan benzonase, dimurnikan dalam gradien iodixanol, dan dititrasi menggunakan PicoGreen [37]. Ekspresi transgen didorong oleh promotor CMV, seperti yang dijelaskan sebelumnya [37].

2.4. Pemeliharaan Hewan

Pemeliharaan dan eksperimen tikus dilakukan di Pusat Medis Sourasky (Tel Aviv, Israel), dan sesuai dengan peraturan dan standar Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Pusat Medis Sourasky.

Strain tikus yang digunakan untuk model transgenik semuanya menggunakan latar belakang campuran C57BL/6 dan JVB/NJ. Tikus Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus , dan LSL-Trp53R172H/ plus t adalah hadiah dari Dr. Ziv Gil (Technion-Israel Institute of Technology di Rambam, Haifa, Israel).

2.5. Model Mouse Knockdowm KLOTHO Khusus Pankreas

Untuk menargetkan knockdown KLOTHO ke pankreata tikus, tikus yang membawa alel KLOTHO floxed (KLlox) dihasilkan, seperti yang dijelaskan sebelumnya [38].cistanche AustraliaTikus Keflex/flox disilangkan dengan tikus Pdx1-Cre, mengekspresikan Cre recombinase yang dikendalikan oleh promotor Pdxl, sehingga memperoleh Pdx1-Cre; KL-/-tikus. Knockdown KLOTHO pankreas dikonfirmasi dengan imunohistokimia dan tingkat mRNA, seperti yang dijelaskan selanjutnya.

Untuk menghasilkan tikus yang menyimpan knockdown KLOTHO yang dikendalikan promotor Pdxl dan ekspresi Kras mutan, tikus LSL-KrasG12D/ plus [3], yang membawa urutan Lox-Stop-Lox diikuti oleh alel Kras mutan, disilangkan dengan tikus KLflox/flox. Tikus-tikus ini selanjutnya dikawin silangkan dengan tikus Pdx1-Cre, menghasilkan Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus mouse. LSL-KrasG12D/ plus juga disilangkan dengan tikus Pdx1-Cre secara terpisah, dan tikus Pdx1-Cre ini; Tikus KrasG12D/plus digunakan sebagai kontrol. Tikus diperiksa setiap hari untuk tanda-tanda penderitaan, termasuk sulit bernapas, perubahan berat badan besar, dan tumor besar (lebih dari 1 cm), dan mereka yang memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh komite etik dikorbankan. Tikus dipantau untuk bertahan hidup, dengan kematian ditentukan baik secara spontan atau dengan tanda-tanda yang memerlukan pengorbanan. Karena cepatnya pencernaan jaringan pankreas oleh cairan pankreas, kami hanya bisa memeriksa pankreas tikus yang telah dikorbankan. Jaringan dipanen dan disimpan dalam formaldehida selama 24 jam, yang kemudian diganti dengan etanol 70 persen.

2.6. Studi Xenograft Tumor Tikus

Tikus telanjang athymic betina (latar belakang BALB/c), usia {{0}} minggu, dibeli dari Envigo RMS (Yerusalem, Israel). Tikus ditempatkan dan dipelihara dalam lemari aliran laminar di bawah kondisi bebas patogen tertentu. Pada hari pertama percobaan, sel-sel MIA PaCa-2 yang mengekspresikan m-Cherry/luciferase secara stabil diinokulasikan secara subkutan ke dalam panggulnya n=21, sel 1 × 10 derajat dalam 100 L 5 persen media DMEM FCS）. Sepuluh hari setelah inokulasi tumor, dosis tinggi (5× 1011 GC/mL, n=7) atau dosis rendah (5× 1010GC/mL,n=6) manusia AAV-dia disuntikkan secara intramuskular (im).AAV-null berfungsi sebagai kontrol (5×1010 GC/mL, n=8). Tumor diukur dengan caliper digital tiga kali seminggu, dan volume dihitung dengan rumus perhitungan volume ellipsoid (0,5 × panjang × lebar2). Pada hari ke-20 percobaan, tumor dievaluasi secara in vivo dengan memantau aktivitas luciferase sel MIA PaCa-2 dengan injeksi 150 ug/mL luciferin intra-peritoneal, dan intensitas luciferase diukur dengan Biospase.

Pada hari yang sama, percobaan berakhir dan tikus di-eutanasia. Tumor diangkat, ditimbang, dan diukur dengan jangka sorong digital. Darah dikumpulkan sebelum euthanasia, dan kadar klotho manusia diukur dalam serum menggunakan ELISA (IBL, Minneapolis, MN, USA). Lima puluh mikroliter serum per sampel (dalam rangkap dua) digunakan untuk ELISA, dan pengujian dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik. Korelasi antara berat tumor dan kadar klotho dalam darah manusia diperiksa melalui koefisien korelasi Pearson.

2.7. Model Mouse KPC

Generasi mencit KPC dilakukan dengan kawin silang mencit LSL-Trp53R172H/ plus [5] yang membawa sekuen Lox-Stop-Lox, diikuti oleh alel p53 mutan titik yang berfungsi sebagai mutasi nol, dengan mencit LSL-KrasG12D/ plus t. Ini selanjutnya disilangkan dengan tikus Pdx1-Cre, menghasilkan Pdx1-Cre; KrasG12D/plus ; Trp53R172H/ plus tikus. Tikus dicocokkan menurut jenis kelamin, usia, dan berat badan, dan secara acak ditugaskan untuk menerima pengobatan dengan suntikan intraperitoneal (ip) kulit manusia yang larut (15 mg/kg, dua kali seminggu) atau kontrol kendaraan (n =6 untuk kelompok perlakuan langit; n =7 untuk kelompok kontrol). Perawatan berlanjut hingga 30 minggu. Tikus diperiksa setiap hari untuk tanda-tanda penderitaan, termasuk sulit bernapas, perubahan berat badan besar, dan tumor besar (lebih dari 1 cm), dan mereka yang memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh komite etik dikorbankan. Tikus dipantau untuk bertahan hidup, dengan kematian ditentukan baik secara spontan atau dengan tanda-tanda yang memerlukan pengorbanan.

2.8. Genotipe

Ekor tikus diambil pada umur 3 minggu untuk genotipe. DNA diekstraksi dengan inkubasi ekor dalam larutan lisis basa, yang terdiri dari 250 M NaOH dan 2 M disodium EDTA (pH 12.0), selama 30-60 menit pada 95 derajat , diikuti dengan netralisasi dengan 0.4 mM Tris HCL(pH 5.0). DNA kemudian menjalani amplifikasi PCR untuk genotipe yang berbeda, menggunakan REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Primer berada pada konsentrasi akhir 1000 nM. Siklus PCR dan primer dirinci dalam Tabel S1. Produk dielektroforesis pada 1,5 persen gel agarosa dan diwarnai dengan etidium bromida.

2.9. Analisis Imunohistokimia (IHC)

Jaringan difiksasi dalam 4 persen paraformaldehyde, dan jaringan yang tertanam dipotong secara serial. Bagian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E) dan diperiksa secara mikroskopis oleh ahli patologi yang berpengalaman, atau diwarnai dengan IHC, seperti yang dijelaskan. Untuk klotho IHC, bagian yang difiksasi formalin dan parafin, setebal 4 um, di-dewax dalam xilena dan direhidrasi. Pengambilan antigen dilakukan dengan menggunakan penangas air panas (95 derajat ) selama 20 menit dalam buffer sitrat pH6.0. Setelah pendinginan selama 30 menit, slide dibilas dalam buffer TBS-triton (TBS-T).manfaat cistancheSelanjutnya, dan blok peroksidase endogen dilakukan selama 10 menit dalam 3 persen H, O/metanol. Setelah dibilas di TBS-T, bagian diblokir selama 30 menit menggunakan 5 persen BSA di TBS-T dan kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi primer klotho pada 4 derajat. Deteksi dilakukan dengan ZytoChem Plus(HRP)One-Step Polymer anti-Mouse/Kelinci/Tikus (ZUC053; Zytomed Systems, Berlin, Jerman). Tikus IgG2a berfungsi sebagai kontrol isotipe.

2.10.Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Pancreata dari Pdxl-Cre yang dikorbankan; Tikus kontrol KL-/- dan KLflox/flox dipotong, dibekukan dalam nitrogen cair, dan disimpan pada suhu -80. Setelah homogenisasi pancreata, RNA total disiapkan menggunakan kit isolasi RNA (Sigma), dan ditranskripsi terbalik menggunakan JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA). cDNA diamplifikasi untuk klotho dan -aktin (sebagai kontrol pemuatan) menggunakan REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix(Sigma). PCR dioptimalkan pada 94 derajat selama 5 menit, diikuti oleh siklus 30 detik pada 94 derajat, 90 detik pada 52,5 derajat, dan 20 detik pada 72 derajat (45 siklus untuk klotho, 25 siklus untuk -aktin), dan 10 menit pada 72 derajat untuk ekstensi, menggunakan primer klotho 12,5 pmol (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'dan R,5'-TTCTTIGGCTCAACCCCGTC-3') dan primer 5 pmol -aktin (F,5' -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'dan R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). Produk dielektroforesis pada gel agarosa 1,5 persen yang diwarnai dengan etidium bromida. Kuantifikasi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.

2.11.Analisis Statistik

Hasil disajikan sebagai mean ± SD atau SEM, seperti yang disebutkan. Variabel kontinu dibandingkan dengan menggunakan uji-t kecuali disebutkan lain. Semua uji signifikansi adalah dua sisi, dan nilai p Kurang dari atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Korelasi dinilai menggunakan koefisien korelasi Pearson (r). Analisis kelangsungan hidup dilakukan dengan menggunakan uji log-rank.

3. Hasil

3.1.Tingkat Ekspresi Klotho dan Metilasi DNA pada Tumor Pankreas Berhubungan dengan Kelangsungan Hidup Penderita Kanker

Kelompok Cancer Genome Browser (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) diperiksa menggunakan Browser Xena University of California Santa Cruz (UCSC)[35]. Analisis ekspresi gen mengungkapkan pengurangan kelangsungan hidup keseluruhan (OS) dan interval bebas perkembangan (PFI) untuk pasien kanker pankreas dengan tumor pengekspresi klotho rendah, dibandingkan dengan tinggi (n=89 untuk setiap kelompok; Gambar 1A, B). Pemeriksaan data metilasi menunjukkan tren yang kompatibel dari OS dan PFI terhambat pada pasien yang memiliki tumor dengan tingkat metilasi DNA KLOTHO tinggi, dibandingkan dengan rendah (n=45 dan n=46; Gambar 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3)pada kanker pankreas manusia (Gambar 2C-E).

3.2. Generasi Tikus Knockdown KLOTHO Pankreas

Tikus knockout KLOTHO non-kondisional mati pada usia sekitar 8-9 minggu [7], oleh karena itu, mereka tidak dapat berfungsi sebagai model untuk perkembangan kanker. Oleh karena itu, kami menargetkan knockdown KLOTHO pada tikus pancreata. Untuk tujuan ini, tikus Pdx1-Cre disilangkan dengan tikus yang membawa alel KLOTHO floxed, KLlox/lox [38], sehingga memperoleh Pdx1-Cre; Tikus KL-/- (Gambar 3A, B). Tingkat RNA dan protein memvalidasi knock-down klotho pankreas (Gambar 3C-E). Pdx1-Kre; KL-77tikus menunjukkan sedikit peningkatan berat badan dari waktu ke waktu, dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3F), tetapi tidak ada perbedaan dalam glukosa serum atau insulin dan toleransi glukosa (Gambar S1).

Gambar 3. Generasi mencit knockdown KLOTHO pankreas. (A) Diagram skematik alel KLflox: Situs LoxP mengapit ekson 2 KLOTHO, mengarah ke target knockdown di pankreas Pdx1-Cre; KL-/-tikus. Panel atas menunjukkan alel floxed, panel bawah menunjukkan hasil yang diharapkan dari rekombinasi Cre. (B) Gel representatif yang menunjukkan produk PCR genotipe KLOTHO tikus: KL plus / plus (WT;370 bp), KLl/ plus (470 dan 370 bp), dan KLflox/flox (470 bp). (C,D) RNA pankreas diekstraksi dari Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) dan tikus kontrol(n=4). Level mRNA Klotho ditentukan dengan RT-PCR semi-kuantitatif dan dikuantifikasi. Gel representatif ditunjukkan (bercak asli yang tidak dipotong tersedia pada Gambar S2). (E) Pewarnaan klotho imunohistokimia representatif dari pankreata yang dipotong dari Pdx1-Cre; KL-/- dan tikus kontrol. Pembesaran: X20. Tanpa. (F)Berat tikus pada kedua kelompok (n=5per kelompok). Dianalisis menggunakan ANOVA.p pengukuran berulang=0.01. Data disajikan sebagai mean ± SEM. Kontrol, tikus KLflox/flox. Tikus yang menyimpan knockdown KLOTHO pankreas dan ekspresi Kras mutan dihasilkan dengan kawin silang Pdx1-Cre dengan tikus LSL-KrasG12D/ plus [3] (Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus tikus), dan selanjutnya mengawinkan silang mereka dengan tikus Tikus KLflox/lokus (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus tikus). Analisis dilakukan dengan menggunakan tikus jantan. Tikus betina dikeluarkan, karena tingginya tingkat lesi dubur di kedua Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus dan Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/plus tikus, yang konsisten dengan laporan sebelumnya dari papiloma mukokutan pada tikus tersebut [3].

3.3.Hilangnya Klotho Pankreas Berkontribusi pada Berkurangnya Kelangsungan Hidup pada Tikus

Tidak ada perbedaan dalam kelangsungan hidup Pdx1-Cre; tikus KL-/-, dibandingkan dengan kontrol). Kami melanjutkan untuk mempelajari efek kombinasi knockdown KLOTHO pankreas dan mutasi Kras pada kelangsungan hidup dengan memantau tikus selama 65 minggu. Kematian terjadi baik secara spontan atau dengan euthanasia ketika tanda-tanda penderitaan berat, atau beban tumor yang memerlukan pengorbanan, dimulai. Kelangsungan Hidup Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ plus mencit (n =21) ​​mengalami penurunan dibandingkan dengan kontrol Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus mouse (n=18;p= 0.02; Gambar 4A). Jadi, pada usia 22 minggu, 100 persen (18/18) Pdx1-Cre; tikus KrasGi2D/ plus masih hidup, dibandingkan dengan 71 persen (15/21) Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus tikus. Tidak ada perubahan signifikan dalam berat yang dicatat antara kelompok (Gambar 4B).

Gambar 4. Knockdown KLOTHO pankreas berkontribusi pada pengurangan kelangsungan hidup dan menginduksi PDAC in vivo. (A) Kurva Kaplan-Meier dari Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) dibandingkan dengan kontrol Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)mice.p=0.02.( B)Berat tikus pada kedua kelompok (n=19 per kelompok). (CE) Pankreas dikeluarkan dari Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (n=7, usia rata-rata 36 minggu)dan kontrol Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8, usia rata-rata 49 minggu) tikus saat dikorbankan. (C) Perbandingan antara penilaian patologis pankreas bernoda H&E dari kedua kelompok. (D) Pewarnaan H&E representatif dari pancreata yang dipanen dari 24-tikus berumur seminggu.Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (kanan): hilangnya polaritas seluler, atypia nukleus yang signifikan, dan pembentukan kelompok sel ke dalam lumen duktus, bersama dengan fibrosis dan keratin yang banyak. Kontrol Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (kiri): tidak ada lesi. Pembesaran: ×10.(E) Lesi PanIN representatif dari kedua kelompok.Pembesaran: ×10.

3.4. Klotho Gandeng Pengembangan PDAC Di Vioo

Berdasarkan penelitian sebelumnya yang menunjukkan perkembangan PDAC pada tikus yang menyimpan mutasi Kras dan hilangnya aktivitas penekan tumor [4], kami memeriksa Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus pankreata tikus untuk lesi. Karena cepatnya pencernaan jaringan pankreas oleh cairan pankreas, kami hanya bisa menggunakan pankreas tikus yang telah dikorbankan. Contoh Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​dan kontrol Pdx1-Cre; Tikus KrasGi2D/ plus (n =8) menjalani evaluasi patologis (usia rata-rata kematian: 36 dan 49 minggu, masing-masing). PDAC diidentifikasi dalam dua Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus mouse, tetapi tidak dalam Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus tikus, sementara PanN2 tercatat di dua Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus mouse dan dalam empat Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus tikus (Gambar 4C). Gambar representatif ditampilkan (Gambar 4D-E).

3.5. Pengobatan dengan sKL Menghambat Tumor Pankreas dan Memperpanjang Kelangsungan Hidup Di Vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >{}.729; Gambar 5F-G).

Model kedua yang digunakan untuk tujuan ini adalah model KPC. Tikus dicocokkan menurut jenis kelamin, usia, dan berat badan, dan diobati dengan injeksi sKL manusia yang larut atau kontrol kendaraan hingga 30 minggu. Kematian terjadi baik secara spontan atau dengan euthanasia ketika tanda-tanda penderitaan berat, atau beban tumor yang memerlukan pengorbanan, dimulai. Kelangsungan hidup tikus yang diobati dengan sKL meningkat, dibandingkan dengan kontrol (p=0.005; Gambar 5H).

Gambar 5. pengobatan sKL menurunkan pertumbuhan tumor lokal dan memperpanjang kelangsungan hidup in vivo. (AG) Tikus telanjang BALB/c athymic diinokulasi dengan sel MIA PaCa-2 yang mengekspresikan m-Cherry/luciferase secara stabil (1× 10 derajat sel per tikus). Sepuluh hari kemudian, tikus disuntik dengan AAV-sKL dosis tinggi (5×1011 GC/mL,n=7), AAV-sKL dosis rendah (5×1010 GC/mL, n{{13} }), atau kontrol AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8).(A) Volume tumor diukur secara in vivo dengan jangka sorong digital. (B) Gambar representatif dari bioimaging aktivitas luciferase dari tumor lokal. (C) Aktivitas luciferase tumor diukur dengan hitungan per menit. (D) Gambar representatif dari tumor yang diambil pada hari pengorbanan. (E) Berat tumor yang dipanen. (F) Kadar klotho darah manusia. *p<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Diskusi

Penelitian ini menetapkan peran klotho sebagai penekan tumor di PDAC. Analisis bioinformatika mengungkapkan korelasi antara kelangsungan hidup pasien PDAC, dan tingkat ekspresi klotho dan metilasi DNA, dan menunjukkan pola hipermetilasi unik KLOTHO pada tumor pankreas. Menggunakan model tikus baru, kami menunjukkan bahwa knockdown klotho pankreas bekerja sama dengan mutasi Kras untuk mengurangi kelangsungan hidup dan menghasilkan PDACin Vivo. Selain itu, L menghambat pertumbuhan tumor yang berasal dari sel pankreas dalam model xenograft dan memperpanjang kelangsungan hidup tikus KPC.

Klotho secara epigenetik dibungkam melalui hipermetilasi promotor dalam beragam keganasan [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Ini juga telah dilaporkan dalam kohort kecil di PDAC, serta dalam korelasi antara kelangsungan hidup pasien PDAC dan tingkat ekspresi klotho dan metilasi DNA [17,34]. Sesuai, evaluasi OS kami, serta PFI menggunakan data yang terdiri dari 178 sampel PDAC, menunjukkan hubungan positif dengan ekspresi klotho dan hubungan negatif yang sesuai dengan metilasi DNA KLOTHO. Data ini lebih lanjut menunjukkan bahwa ekspresi klotho dapat diatur oleh metilasi DNA dan memperkuat gagasan bahwa parameter ini dapat berfungsi untuk menilai prognosis pasien PDAC.

Studi sebelumnya tentang metilasi DNA KLOTHO di PDAC [17,34] didasarkan pada subset terbatas dari pasien dan percobaan in vitro dan tidak menganalisis pola metilasi situs tertentu dalam seluruh gen KLOTHO. Analisis saat ini, berdasarkan kumpulan data ekstensif yang disebutkan di atas, mengungkapkan bahwa tiga situs spesifik, dua di antaranya terletak di dalam CpGisland di ekson terakhir KLOTHO, bertindak sebagai pengatur negatif ekspresi klotho melalui hipermetilasi. Kami sebelumnya menemukan bahwa salah satu situs ini, cg23282559, juga mengalami hipermetilasi pada kanker kolorektal [25]. Masih belum ditentukan apakah situs-situs ini juga berperan dalam regulasi klotho pada keganasan lain.

Klotho diketahui diekspresikan di pankreas; namun, perannya dalam perkembangan dan fungsi pankreas normal masih belum diketahui. Sementara tikus yang kekurangan klotho menunjukkan penurunan produksi insulin, bersama dengan peningkatan dramatis dalam sensitivitas insulin [22], ekspresi berlebihan klotho pada tikus menghasilkan peningkatan insulin darah puasa, disertai dengan resistensi insulin [8]. Anehnya, model tikus yang dipresentasikan dalam penelitian ini, yang menyimpan knockdown klotho pankreas, tidak menunjukkan fenotipe diabetes yang jelas atau sensitivitas yang berubah terhadap insulin. Selanjutnya, tidak ada efek pada morfologi pankreas, pembentukan tumor, atau kelangsungan hidup. Hasil ini menunjukkan bahwa hilangnya klotho pankreas dapat dikompensasi oleh efek perifer klotho sistemik atau dengan mekanisme lain. Selain itu, perkembangan diabetes adalah proses yang kompleks, yang tidak hanya bergantung pada pankreas, tetapi juga pada hati, otot, dan jaringan lemak. Seperti pada model kami, klotho mengalami knockdown terutama di pankreas, ini mungkin menjelaskan kurangnya diabetes pada model tikus ini.

Konsisten dengan hasil klinis yang disajikan, Pdx1-Cre; KL-/-; Tikus KrasG12D/ plus memiliki masa hidup yang lebih pendek dibandingkan dengan kontrol Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus tikus (48 vs.60 minggu, masing-masing). Meskipun kami tidak dapat memeriksa semua pankreas tikus secara patologis, tingkat PDAC nyata yang lebih tinggi terlihat pada Pdx1-Cre; KL-7-; tikus KrasG12D/ plus, dibandingkan dengan kontrol Pdx1-Cre; KrasG2D/ plus mouse. Hasil ini menunjukkan pentingnya klotho dalam perkembangan keganasan pankreas dan kelangsungan hidup in vivo. Fenotipe Pdx1-Cre; KL-/-:KrasGl2D/ plus tikus kurang menonjol, dibandingkan dengan model yang menggabungkan hilangnya penekan tumor lain dengan mutasi Kras. Sebagai contoh, tikus KPC memiliki kelangsungan hidup rata-rata hanya 5 bulan [5]. Hal ini dimungkinkan karena kompensasi sebagian dari hilangnya klotho lokal oleh klotho yang beredar. Atau, ekspresi sisa klotho di pankreas mungkin telah mempengaruhi fenotipe. Mencapai pembungkaman klotho yang ditargetkan secara lengkap dalam studi masa depan akan memungkinkan pemahaman yang lebih baik tentang perannya dalam jaringan yang berbeda, serta penyeimbang antara efek lokal dan sistemik klotho.

Kami mempresentasikan dua model yang menunjukkan potensi terapeutik klotho. Dalam model tikus xenograft, suntikan kanker pankreas dari vektor kulit virus sangat efektif, tidak hanya dalam menghambat pertumbuhan tumor tetapi juga dalam mengurangi ukuran tumor. Pengobatan dimulai ketika tumor sudah terlihat dan terbentuk, menyerupai waktu inisiasi pengobatan pada kebanyakan pasien. Hasilnya menunjukkan bahwa dia dapat digunakan untuk terapi gen, sehingga melewati hambatan utama untuk stabilitas dan pengiriman obat berbasis protein dan peptida yang manjur. Selain itu, korelasi negatif antara berat tumor dan kadar klotho darah manusia dicatat. Penelitian lebih lanjut tentang tingkat darah klotho sehubungan dengan efeknya dapat membantu dalam memprediksi siapa yang akan mendapat manfaat dari pengobatan dengan klotho atau SQL, serta menjaga tingkat dalam jendela terapi.

Pengembangan terapi berbasis klotho adalah tujuan yang dicari oleh banyak kelompok penelitian, serta perusahaan farmasi. Berkenaan dengan pengobatan kanker, ada beberapa jalan yang dieksplorasi. Seseorang dapat meningkatkan kadar klotho endogen dengan memanfaatkan mekanisme epigenetik yang terbukti mempengaruhi ekspresi klotho. Telah dilaporkan bahwa promotor klotho sangat termetilasi pada banyak kanker, dan juga merupakan fungsi dari usia. Dengan demikian, senyawa yang menghambat DNA methyl transferases dapat menjadi target terapi untuk meningkatkan ekspresi klotho. Di sisi lain, seseorang dapat meningkatkan kadarnya dengan menambahkan klotho secara eksogen, misalnya dengan menggunakan terapi gen atau pengiriman protein klotho rekombinan. Di sini, kami melaporkan pengenalan wilayah aktif klotho (L) menggunakan sistem ekspresi AAV, yang menghasilkan efek terapeutik dalam model kanker pankreas.

Selanjutnya, kami menunjukkan bahwa pengobatan dengan langit larut memperpanjang kelangsungan hidup tikus KPC, model yang dikenal untuk merekapitulasi PDAC manusia. Ini menunjukkan efek langit pada inang yang kompeten-kebal dan lingkungan tumor asli, yang selanjutnya mendukung kemungkinan penggunaan SSL dalam pengaturan klinis.

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, penelitian ini mengidentifikasi klotho sebagai penekan tumor yang poten di PDAC. Rejimen pengobatan saat ini untuk PDAC tidak cukup, dan pemberian sKL eksogen dapat berfungsi sebagai strategi baru untuk pengobatan PDAC.

Artikel ini diambil dari Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers