Aktivitas Xantin Oksidoreduktase pada Plasma Miskin dan Kaya Trombosit Sebagai Indikator Stres Oksidatif pada Pasien Diperlukan Terapi Penggantian Ginjal

Latar Belakang Abstrak: Xantin oksidoreduktase(XOR) adalah enzim hidroksilase yang terlibat dalam metabolisme purin. Aktivitas XOR dapat bervariasi: protein homodimer dapat diubah menjadi dua isoform berbeda XD (antioksidan) dan XO (prooksidan). Stres oksidatif dan peradangan yang menyertainyapenyakit ginjal kronis(CKD), dialisis, dan transplantasi ginjal, mengakibatkan aktivasi trombosit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penerapan terapi pengganti ginjal terhadap xantin oksidoreduktase dan aktivitas isoformnya.

Bahan dan Metode: Kelompok penelitian terdiri dari 117 pasien, dibagi menjadi 4 kelompok: pasien hemodialisis - 30, pasien dialisis peritoneal - 30, pasien transplantasi ginjal - 27, dan pengobatan konservatif {{5} } pasien. Kelompok kontrol terdiri dari 30 sukarelawan sehat. Hasil: Perbedaan signifikan ditemukan pada aktivitas XOR pada plasma miskin trombosit (PPP) dalam kelompok yang diteliti (p=00,001). Terdapat hubungan antara jenis terapi pengganti ginjal terhadap semua isoform oksidoreduktase pada PPP (hal<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thepenyebab penyakit ginjal kronikjuga tercermin dalam perbedaan aktivitas XD dan XO di PPP.

Kesimpulan: Jenis terapi pengganti ginjal yang digunakan pada pasien CKD, usia pasien, lama dialisis, penyebab CKD, dan stadium perkembangannya berpengaruh signifikan terhadap aktivitas XOR dan isoformnya.

Kata kunci: Xanthine oksidoreduktase, Trombosit, Terapi penggantian ginjal,Penyakit ginjal kronis, Enzim antioksidan

BERAPA LAMA YANG DIPERLUKAN UNTUK CISTANCHE BEKERJA?

Latar belakang

Xanthine oxidoreductase (XOR) adalah enzim hidroksilase yang terlibat dalam metabolisme purin. Ini mengkatalisis oksidasi hipoxantin menjadi xantin dan xantin menjadi asam urat (UA). Aktivitas XOR dapat bervariasi: protein homodimer dapat diubah menjadi dua isoform yang berbeda. Xanthine dehydrogenase (XD) diekspresikan terutama pada jaringan sehat, dan xanthine oxidase (XO) dihasilkan oleh modifikasi XD pasca-translasi, residu oksidasi sistein serta proteolisis terbatas, memainkan peran dominan dalam sel dan jaringan selama cedera [1-3 ]. Aktivitas isoform tersebut saling bertentangan [4]. XOR bertindak dengan adanya NAD+ sebagai dehidrogenase, dan dengan molekul oksigen sebagai oksidase. Kemampuan XOR untuk dengan cepat mengkonversi dari antioksidan menjadi oksidan, dalam berbagai jenis kerusakan jaringan, merupakan elemen penting untuk respon imun bawaan yang cepat, bermanfaat dalam, misalnya, infeksi bakteri atau jamur [5].

Reaksi antara xanthine dehydrogenase (XDO) dan oksigen dapat bereaksi dengan NAD+ dan O2 tetapi memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap NAD+ [6]. Isoform perantara ini belum diisolasi, namun penentuan aktivitasnya memudahkan pelacakan transformasi XD menjadi XO [7].

Aktivitas XOR serum pada berbagai penyakit telah banyak diteliti. Alasan ketertarikan terhadap enzim ini adalah dualisme aksinya: kemampuan menghasilkan antioksidan, dan di sisi lain, penciptaan spesies oksigen reaktif. Peningkatan aktivitas XOR terjadi pada kondisi patologis seperti virus hepatitis, mononukleosis menular, penyakit autoimun, pneumonia, skizofrenia, dan diabetes tipe II. Peningkatan aktivitas XOR juga diamati pada serum pasien setelah transplantasi ginjal atau hati [8]. Telah terbukti bahwa gen yang mengkode XOR mungkin bertanggung jawab untuk pematangan ginjal, dan adipogenesis di ginjal, dan dapat mencegah transformasi sel epitel menjadi jaringan mesenkim [9]. Namun, berdasarkan pengetahuan terbaik kami, tidak ada laporan yang dipublikasikan yang menyelidiki aktivitas XOR pada plasma miskin trombosit (PPP) dan plasma kaya trombosit (PRP) pada pasien yang menjalani terapi penggantian ginjal. Pentingnya aktivitas XOR pada kelompok pasien ini berkaitan dengan peningkatan aktivasi trombosit yang disebabkan oleh stres oksidatif dan peradangan yang menyertai penyakit ginjal kronis (CKD), dialisis, dan transplantasi ginjal. Selain itu, selama dialisis dan transplantasi organ, jaringan dan pembuluh darah rusak, dan trombosit adalah sel pertama yang mencapai lokasi kerusakan jaringan, berpartisipasi aktif dalam tahap awal proses inflamasi dan penyembuhan [10].

PRP dan PPP merupakan fraksi plasma darah dengan konsentrasi trombosit yang berbeda. Kandungan trombosit PRP dan PPP masing-masing adalah trombosit/ml dan trombosit/ml. PPP dan PRP diperoleh dengan melakukan sentrifugasi berulang kali dan mencuci seluruh darah manusia pada kecepatan sentrifugal yang berbeda [11, 12].

PPP, sebagai produk sampingan sentrifugasi darah antikoagulan, memiliki konsentrasi trombosit yang lebih rendah dibandingkan darah normal. Komponen utama PPP adalah fibrinogen, fibronektin, dan trombin. Efek biologis PPP berpartisipasi dalam hemostasis dan koagulasi, bertindak sebagai vektor perlekatan sel, dan mendorong mitosis fibroblas dan sel epitel [13]. Meskipun PPP tidak terkonsentrasi pada trombosit seperti PRP, PPP telah terbukti juga dapat mempertahankan pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel. PPP meningkatkan fungsi sel terkait penyembuhan luka dan mempercepat migrasi sel dan proliferasi fibroblas [14, 15]. Plasma kaya trombosit memiliki konsentrasi trombosit yang lebih tinggi dibandingkan plasma normal (kira-kira 150–400× 103 sel/dL). Ini adalah salah satu definisi PRP yang paling umum dalam literatur [16]. Sampai saat ini, penelitian terbatas mengkarakterisasi XOR dan aktivitas isoformnya pada plasma kaya atau miskin trombosit pada pasien yang menderita penyakit ginjal kronis. Tan dkk. menunjukkan sel-sel dirusak oleh spesies oksigen reaktif (ROS) (dalam kasus terapi penggantian ginjal kronis) isoform XOR yang "bocor", menyebabkan peningkatan tingkat enzim dalam plasma [17]. Mekanisme ini menjelaskan lebih rendahnya aktivitas XOR dan isoformnya pada trombosit dibandingkan dengan PPP. Maka dari itu, aktivitas oksidoreduktase pada PPP dan PRP sangat menarik perhatian karena bisa membantu mengungkap proses seluler yang terjadi sehari-hari, Kak. Investigasi semacam itu juga secara tidak langsung dapat menyoroti tingkat keparahan stres oksidatif pada kelompok pasien ini.

Berry dkk. jelaskan juga bahwa xanthine oxidoreductase didistribusikan di hati, usus kecil, kelenjar susu, dan sel endotel. Metode lokalisasi subseluler telah menunjukkan adanya xantin oksidoreduktase baik di sitoplasma maupun pada membran sel. Mereka juga menunjukkan bahwa xantin oksidasereduktase plasma mungkin disebabkan oleh bayangan xantin oksidoreduktase dari membran sel atau bocor dari sitoplasma. Hal inilah yang menjadi salah satu alasan kami menguji aktivitas XOR pada PPP dan PRP untuk membedakan aktivitas enzim pada trombosit dan sel darah lain yang terkandung dalam plasma [18]. Berdasarkan aktivitas enzim antioksidan, kita juga dapat menentukan jenis terapi pengganti ginjal mana yang cenderung tidak membuat pasien terkena stres oksidatif. Karena sifat ganda XOR, pemahaman tentang hubungan antara jenis terapi pengganti ginjal dan aktivitas isoform XOR bisa sangat menarik dan membantu dalam pemilihan jenis terapi pengganti ginjal.

Bahan dan metode

Persetujuan dan persetujuan etis

Komisi Bioetika di Universitas Kedokteran Pomeranian di Szczecin menyetujui penelitian yang dilakukan (no KB−0012/36/11). Semua peserta, termasuk sukarelawan sehat dalam kelompok kontrol, diberitahu tentang tujuan dan ruang lingkup penelitian dan memberikan persetujuan mereka untuk menyumbangkan sampel dan mempublikasikan data yang dihasilkan.

Belajar kelompok

Ada 147 peserta: kelompok kontrol yang terdiri dari 30 sukarelawan sehat (NK), dan 117 pasien dengan penyakit ginjal kronis (CKD) yang menghadiri Klinik Nefrologi, Transplanetologi, dan Penyakit Dalam Universitas Kedokteran Pomeranian di Szczecin. Pasien dibagi menjadi 4 kelompok berdasarkan pengobatan yang diterimanya: 30 pasien sebelum dan sesudah hemodialisis (HD A dan HD B): 30 pasien mendapat peritoneal dialysis (PD); 27 pasien sebelum dan sesudah transplantasi ginjal (5–7 hari setelah operasi) (TE, TE A); 30 pasien menerima pengobatan konservatif (CT) (CKD stadium 2-5). Jenis kelamin, usia, durasi dialisis, penyebab dan stadium penyakit ginjal kronis, serta konsentrasi kreatinin pada kelompok uji dan kontrol diberikan pada Tabel 1 dan 2.

Sampel

Sampel darah (K2EDTA (8 ml), trisodium sitrat 3,8% (9:1; v/v), dan serum (8 ml)) diambil dari seluruh peserta penelitian. Darah pasien yang menjalani hemodialisis diambil dari fistula arteriovenosa; pungsi vena perifer digunakan untuk semua peserta lainnya. Sampel diambil dari pasien hemodialisis sebelum (HD A) dan sekitar 10 menit setelah pompa dihentikan (HD B). Darah pasien transplantasi dikumpulkan sebelum transplantasi (TE) dan 5-7 hari setelah operasi (TE A). Pasien yang direkrut untuk kelompok TE tidak termasuk dalam kelompok pasien hemodialisis atau dialisis peritoneal dalam penelitian ini. Mereka adalah pasien yang memenuhi syarat untuk transplantasi dari seluruh Polandia. Sebagian besar pasien dengan transplantasi ginjal telah menjalani analisis mode sebelumnya. K2EDTA dan sampel darah beku disentrifugasi pada 2600 rpm selama 10 menit pada suhu 20 derajat untuk mendapatkan plasma dan serum. Untuk mendapatkan plasma kaya trombosit (PRP) dan plasma miskin trombosit (PPP), darah yang dikumpulkan dengan sitrat disentrifugasi pada kondisi pada 1100 rpm selama 10 menit pada suhu 20 derajat. PRP yang dihasilkan dipindahkan ke tabung baru dan disentrifugasi pada 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 20 derajat: plasma miskin trombosit (PPP) dipindahkan ke tabung terpisah; pelet trombosit dibilas dua kali dan disuspensikan dalam buffer Tyroda (pH7.4). Plasma, serum, PPP, dan PRP dibekukan pada suhu −80 derajat sampai pengujian dilakukan. Pada pasien hemodialisis, darah dikumpulkan sebelum pemberian heparin dan setelah dialisis rata-rata berlangsung selama 4-5 jam (waktu paruh heparin - 4 jam) untuk menghilangkan kemungkinan pengaruh heparin terhadap aktivitas XOR.

Aktivitas xantin oksidoreduktase dalam plasma dan trombosit miskin trombosit

Penentuan dilakukan dengan spektrofotometer Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. Perubahan kepunahan dicatat pada 340nm (XD) dan 302nm (XDO, XO) selama 5 menit pada suhu 30 derajat. Aktivitas enzimatik diukur sebagai pembentukan asam urat dan NADH (meningkat pada A340 dan A302) dan dinyatakan dalam mU× mL−1 (miliunit per mililiter). Aktivitas enzimatik dihitung, dengan mempertimbangkan laju reaksi awal. Pembentukan asam urat diukur pada 302nm (isoform XDO dan XO) karena serapannya masih tinggi, sedangkan perubahan konsentrasi NAD+ tidak berkontribusi. Koefisien kepunahan untuk NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] digunakan untuk menghitung aktivitas isoform xantin oksidoreduktase NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Tabel 1 Karakteristik umum pasien hemodialisis (HD), dialisis peritoneal (PD) yang diobati secara konservatif (CKD), transplantasi ginjal (TE), dan kelompok kontrol (C) yang berpartisipasi dalam penelitian (rata-rata±SD)

P* - signifikansi statistik untuk perbedaan antara kelompok HD, PD dan CKD, uji eksak TE dan C Fisher untuk variabel kualitatif; untuk variabel kuantitatif - ANOVA satu arah dan; P** - signifikansi statistik untuk perbedaan antara kelompok HD, PD dan CKD dan uji TE Exact Fisher untuk variabel kualitatif untuk variabel kuantitatif ANOVA satu arah atau; DM - nefropati diabetik; HA - hipertensi; GIK - peradangan glomerulus ginjal; ADPKD - penyakit ginjal polikistik yang diturunkan secara autosomal dominan; NS - tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik.

Tabel 2 Karakteristik umum pasien hemodialisis (B - sebelum HD, A - setelah), dialisis peritoneal (PD) yang diobati secara konservatif (CKD) sebelum dan sesudah transplantasi ginjal (TE B dan TE A) dan kelompok kontrol (NK) yang mengikuti belajar (rata-rata±SD)

P* - signifikansi statistik untuk perbedaan antara kelompok HD A, HD B, PD dan CKD, TE dan C untuk variabel kuantitatif - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA satu arah atau uji-t Student P** - signifikansi statistik untuk perbedaan antara HD A , kelompok HD B, PD dan CKD dan TE untuk variabel kuantitatif ANOVA Kruskal Wallis atau analisis satu arah ANOVA Kt / V - indeks dialisis (fraksi volume V dimurnikan dengan pembersihan K pada waktu t) NS tidak ditemukan hubungan yang signifikan secara statistik

Analisis statistik Untuk menilai distribusi, digunakan uji KS (Kolmogorov-Smirnov), yang dalam kasus beberapa variabel (aktivitas isoform XD dan XDO dalam PRP) menunjukkan distribusi parameter yang tidak normal. Uji Exact Fisher dan Chi-square digunakan untuk menganalisis data kuantitatif. Dengan menggunakan uji-t Student dan analisis ANOVA untuk sistem univariat, perbedaan antara variabel terkait (berpasangan) dan tidak terkait (tidak berpasangan) dievaluasi dalam kasus variabel dengan distribusi normal. Dalam kasus variabel dengan distribusi tidak normal, analisis ANOVA Kruskal-Wallis dilakukan untuk mengevaluasi perbedaan antar parameter, serta uji nonparametrik Mann-Whitney U untuk data tidak berpasangan atau Wilcoxon untuk data berpasangan. Model regresi linier berganda digunakan untuk menentukan evaluasi multifaktor hubungan antara parameter yang diteliti. Analisis statistik hasil dilakukan dengan menggunakan Statistica 12 (StatSoft).