TUNEL Assay: Alat Yang Ampuh Untuk Evaluasi Cedera Ginjal

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrak:Uji terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) adalah uji yang sudah lama digunakan untuk mendeteksi fragmentasi DNA terkait kematian sel (3'-OH DNA termini) oleh endonuklease. Karena enzim ini sangat aktif di ginjal, TUNEL banyak digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur fragmentasi DNA dan kematian sel pada kultur.ginjal sel dan ginjal hewan dan manusia yang dihasilkan daricedera toksik atau hipoksia. Karakterisasi awal TUNEL sebagai uji apoptosis telah menyebabkan banyak salah tafsir tentang mekanismesel ginjal cedera.Namun demikian, TUNEL menjadi semakin populer untukcedera ginjalpenilaian karena dapat digunakan secara universal dalam sel kultur dan jaringan dan untuk semua mekanisme kematian sel. Selain itu, sensitif, akurat, kuantitatif, mudah dikaitkan dengan sel atau kompartemen jaringan tertentu, dan dapat dikombinasikan dengan imunohistokimia untuk memungkinkan identifikasi jenis sel yang andal atau kemungkinan mekanisme kematian sel. Secara tradisional, analisis TUNEL terbatas pada ada atau tidak adanya sinyal TUNEL. Namun, informasi tambahan tentang mekanisme kematian sel dapat diperoleh dari analisis pola TUNEL.

pengobatan gangguan ginjal gairah seksual dengan bubuk suplemen cistanche

pengantar DNA adalah satu-satunya molekul dalam sel yang dapat diperbaiki, tetapi tidak dapat sepenuhnya disintesis ulang setelah kerusakan. Penghancuran DNA adalah salah satu tahap akhir dari proses kematian sel multi-langkah, yang berpotensi reversibel sampai titik fragmentasi DNA terminal. Oleh karena itu, yang terakhir adalah atribut umum dan penanda mekanistik kematian sel ireversibel [1,2]. Fragmentasi DNA terkait kematian sel biasanya "divisualisasikan" oleh uji terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL), uji tangga DNA, atau uji komet [3]. Elektroforesis medan-pulsa [4] dan uji sintesis prima oligonukleotida acak (ROPS) [5] adalah dua uji sekunder lain yang jarang digunakan. Penggunaan uji komet terbatas pada in vitro (sel berbudaya) saja, dan kuantifikasinya padat karya [6]. Melakukan uji komet dalam inti sel yang terisolasi dimungkinkan, tetapi hal ini terkait dengan faktor pengganggu tambahan selama isolasi inti. Yang kedua, uji DNA ladder, bukanlah metode kuantitatif, dan harapan awal bahwa pola tangga vs smear akan membedakan antara apoptosis dan nekrosis, masing-masing, dihilangkan karena pendekatan ini terbukti tidak dapat diandalkan [7]. Dari tiga metode utama, TUNEL adalah yang paling sensitif, paling tidak memakan waktu, dan paling dapat diterapkan secara universal. Ini dapat digunakan dalam sel dan jaringan yang dikultur dan untuk semua mekanisme kematian sel. Ini akurat, kuantitatif, mudah dikaitkan dengan sel atau kompartemen jaringan tertentu, dan dapat dikombinasikan dengan imunohistokimia untuk memungkinkan identifikasi yang andal dari jenis sel atau mekanisme cedera sel yang terkait dengan sinyal positif TUNEL [2].

Pemecahan DNA yang diukur oleh TUNEL diproduksi terutama oleh endonuklease apoptosis. Endonuklease yang paling aktif di ginjal adalah deoksiribonuklease 1 (DNase I) dan endonuklease G (EndoG) [8-10]. DNase I merupakan endonuklease apoptosis yang paling aktif dan melimpah pada mamalia [11]. Ginjal, kelenjar ludah, pankreas, dan usus adalah organ yang diketahui memproduksi DNase I dalam jumlah tinggi. Sel-sel epitel di kelenjar ludah, pankreas, dan usus mensekresi DNase I sebagai enzim pencernaan di saluran pencernaan. Beberapa DNase seluler I melawan DNA "asing" yang menyerang sel inang [12]. DNase I non-sekresi menghadirkan bahaya tersembunyi bagi DNA sel inang, tetapi biasanya DNase tidak bekerja pada DNA sel inang sampai cedera atau kematian sel. Di ginjal, DNase I disekresikan oleh sel epitel tubulus, mungkin untuk menghancurkan virus dan bakteri dalam urin. Fungsi ini kemungkinan terjadi bersamaan dengan proteinase, khususnya meprin, yang merupakan proteinase utama dalam urin [13]. Meskipun bersifat protektif terhadap infeksi, keberadaan DNase yang sangat aktif di ginjal membuat organ ini rentan terhadap cedera, dimana aktivitas DNase diketahui bersifat sitotoksik terhadap sel inang. DNase meningkatkan kematian sel yang disebabkan oleh rangsangan toksik atau hipoksia dan menghancurkan semua sel DNA ginjal inang yang dilepaskan sebagai akibat dari kematian sel.

Ginjaladalah organ penyaringan yang mengeluarkan senyawa beracun dari tubuh. Aktivitas DNase I yang tinggi di ginjal membuat sel-sel ginjal sangat sensitif terhadap cedera dari senyawa toksik dan produk metabolismenya. Hal ini menjadikan TUNEL metode yang paling tepat dan dapat diterapkan untuk mengukur cedera pada ginjal. Dalam ulasan ini, kami akan fokus pada TUNEL sebagai uji yang banyak digunakan, informatif, dan tepat untuk pengukuran kematian sel dan cedera jaringan di ginjal. Kami akan membahas aspek-aspek TUNEL yang berlaku untuk penyakit dan cedera ginjal dan mengidentifikasi kualitas, teknik, dan fitur TUNEL yang kurang dimanfaatkan untuk mempromosikan penggunaan yang produktif dan tepat dari pengujian yang kuat ini dalam penelitian, diagnostik, dan terapi penyakit ginjal. Kami juga akan membahas berbagai pola gambar TUNEL yang dapat dikaitkan dengan mekanisme kematian sel. Poin yang diangkat dalam ulasan ini secara luas berlaku untuk penggunaan TUNEL di organ selain ginjal.

Kata kunci:TUNEL; kematian sel; ginjal; DNA; endonuklease; cedera jaringan

Prinsip TUNELUji TUNEL dikembangkan pada tahun 1992 oleh Gorczyca et al. [14] dan Gavrieli dkk. [15], masing-masing menggunakan pelabelan fluorokrom dan avidin-peroksidase. Pada saat itu, ada kebutuhan mendesak akan metode baru untuk menilai apoptosis, dan TUNEL berhasil mengisi celah ini. Awalnya dipasarkan sebagai uji untuk pemutusan untai DNA selama atau terkait dengan apoptosis [14,16], dengan tidak adanya pengujian yang lebih baik, TUNEL dengan cepat menjadi uji standar untuk apoptosis [17,18]. Namun, segera diakui oleh para peneliti bahwa TUNEL tanpa pandang bulu mengukur setiap fragmentasi DNA, tidak hanya yang terkait dengan apoptosis [19-21]. Namun demikian, kebutuhan akan uji apoptosis begitu besar sehingga laporan langka dari TUNEL yang tidak spesifik untuk apoptosis umumnya diabaikan. Hal ini menyebabkan sejumlah besar laporan positif palsu tentang apoptosis di ginjal dan organ lain, sampai pada tingkat di mana hingga 20 persen dari total sel dilaporkan mengalami apoptosis bahkan tanpa cedera [22-25] ketika perubahan sebagai sekecil 0,01 persen bisa menjadi bukti signifikan secara statistik dari cedera jaringan.

Uji TUNEL telah mengalami kebangkitan dalam beberapa tahun terakhir sejak akhir ledakan studi apoptosis beberapa tahun yang lalu. Pencarian artikel jurnal PubMed kami yang melibatkan istilah "ginjal" dan "TUNEL" menghasilkan lebih dari 1500 hasil dari tahun 1992 hingga 2020. Pada tahun 2019, 170 artikel diterbitkan, jumlah tertinggi dalam satu tahun selama 28 tahun terakhir (Gambar S1) dan yang merupakan mayoritas artikel yang disurvei untuk ulasan ini. Sejumlah penelitian menggunakan TUNEL-positif sebagai ukuran universal kematian sel terkait fragmentasi DNA pada jenis kematian sel lain selain dari apoptosis. Sebagai contoh, ferroptosis, suatu bentuk kematian sel non-apoptosis terprogram yang baru ditemukan yang dipicu oleh kerusakan oksidatif yang terjadi selama reperfusi iskemia ginjal (IR) pada tikus, dapat dideteksi oleh TUNEL [26]. Pyroptosis, yang merupakan bentuk inflamasi dari kematian sel terprogram yang berbeda dari apoptosis dan nekrosis, terbukti berhubungan dengan sinyal positif TUNEL [27,28]. TUNEL-positif diamati selama nekroptosis yang berkontribusi pada penipisan progresif sel tubulus ginjal pada tikus yang menjalani nephrectomy subtotal [29]. Di ginjal dan jaringan lain, sinyal TUNEL positif telah ditemukan pada nekrosis [30,31], autophagy disregulasi [32-35], anoikis [36,37], bencana mitosis [35,38], autolisis [39], Pautolisis [39], proptosis [40], dan aponeurosis [30], menunjukkan TUNEL menjadi uji yang benar-benar universal untuk kematian sel ireversibel.

Uji TUNEL didasarkan pada pelabelan ujung 3'OH oleh enzim DNA spesifik ujung 3'OH, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) (Gambar). Penggunaan DNA polimerase atau fragmen DNA polimerase Klenow sebagai pengganti TdT dapat membantu menentukan jenis ujung 3'OH (sobek, celah, atau oligo yang menjorok) karena polimerase DNA memerlukan cetakan (untai DNA yang berlawanan) dan dengan demikian tidak akan berlabel ujung DNA yang menggantung atau menonjol. Penting untuk diingat bahwa produksi ujung DNA 3ZOH tidak unik untuk endonuklease apoptosis (pendegradasi DNA). Ujung DNA 3'OH adalah sinyal "komunikator" utama, denominator umum dari sebagian besar enzim DNA. Mereka diproduksi dan digunakan oleh hampir semua enzim DNA pada eukariota, termasuk endonuklease perbaikan DNA (apurinic/apyrimidinic, AP), eksonuklease, DNA polimerase, DNA ligase, DNA transferase, dan topoisomerase. Selain itu, konjugat 3'Id 3z-gula, atau 3z-protein dapat diubah menjadi 3'OH termini masing-masing oleh fosfatase, glikosilase, dan proteinase. Inilah sebabnya mengapa pemahaman yang tepat tentang apa yang sedang diukur diperlukan untuk keberhasilan penerapan TUNEL dan interpretasi hasilnya.

Dibandingkan dengan dua metode utama lainnya untuk pengukuran fragmentasi DNA, tangga DNA dan uji komet, TUNEL memiliki keuntungan karena didasarkan pada identifikasi termini DNA daripada fragmen (Gambar 2). Secara teoritis, TUNEL akan lebih sensitif dan linier untuk identifikasi fragmentasi DNA awal (rendah) daripada tangga DNA atau komet, yang keduanya memiliki periode lag akumulasi fragmen kecil dengan mobilitas tinggi. Bagaimanapun, studi yang menggabungkan TUNEL dengan komet )41,42] atau tangga DNA [43,44] memiliki beberapa keuntungan dalam menangkap fragmentasi DNA awal dengan sensitivitas maksimal.

Aplikasi TUNELTUNEL digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur cedera ginjal dalam studi toksikologi klinis dan dasar dalam beragam aplikasi, termasuk perawatan medis [45], lingkungan [46], pertanian [41] dan industri [47] eksposur, dan hewan [48] ] dan ilmu pangan [49]. TUNEL berlaku untuk semua jenis sel, organ, dan spesies yang memiliki DNA dan DNA, yang mencakup hampir semua spesies. TUNEL telah digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur cedera ginjal pada beragam hewan, termasuk ikan zebra [50], ikan beras Jepang [51], ayam [48], gerbil [52], tikus [41], tikus [45], rabb-nya [53], babi mini [54], dan manusia [55]. Keuntungan penting dari TUNEL adalah dapat digunakan dalam sel kultur tetap serta jaringan tetap. Ini memberikan konsistensi metodologis untuk perbandingan antara hasil in vitro dan in vivo dalam studi di mana mekanisme dapat diselidiki dalam sel ginjal yang dikultur, sementara implikasi in vivo dinilai pada ginjal hewan. Apa pun di antara seluruh sel dan jaringan dapat digunakan juga, termasuk spheroid sel yang dikultur [56] dan irisan ginjal ex vivo [57,58].

Intensitas TUNEL dalam hal kekuatan sinyal atau jumlah sel TUNEL-positif dapat bervariasi antar spesies tergantung pada aktivitas DNase. Dalam pengalaman kami, ginjal tikus memiliki DNase I yang lebih aktif daripada ginjal tikus, dan kekuatan sinyal TUNEL-positif berkorelasi dengan ini. Ketika ginjal dibandingkan dengan organ lain, sinyal TUNEL-positifnya sangat kuat dan mirip dengan organ lain dengan aktivitas DNase I yang tinggi, seperti usus dan kelenjar ludah. Di ujung lain spektrum, kekuatan sinyal TUNEL-positif terendah diamati di otak dan sel tumor/kanker, di mana ekspresi DNase I kemungkinan besar dinonaktifkan oleh penyambungan alternatif di wilayah pengkodean [59]. Sinyal TUNEL-positif diamati pada semua jenis sel di ginjal. Rata-rata, epitel tubulus lebih sering rusak daripada glomeruli, terutama pada cedera akut (Gambar 3A). Ini berkorelasi baik dengan aktivitas DNase I yang berlaku pada jenis sel ini. Dilihat dari perbedaan jenis kelamin dan usia yang diamati dalam percobaan kami, DNase I lebih banyak dan aktif pada jantan daripada betina dan hewan paruh baya dibandingkan dengan hewan tua atau neonatus. Namun, tidak ada perbedaan yang jelas dalam kepositifan TUNEL yang terlihat dalam kaitannya dengan jenis kelamin atau usia, mungkin karena faktor yang menonjol atau didominasi oleh faktor lain. Dalam beberapa model ginjal (seperti iskemia-reperfusi), DNase I diinduksi [9]; sementara di lain, itu tidak dan bahkan dapat ditekan (misalnya, dalam toksisitas cisplatin) [10]. Aktivasi endonuklease, jika ada, telah terbukti terjadi dalam 24 jam pertama setelah cedera ginjal [9,60,61]. Oleh karena itu, tidak mengherankan bahwa setidaknya setengah dari aplikasi TUNEL dalam penelitian ginjal dalam tinjauan ini digunakan untuk cedera ginjal akut (AKI) karena penilaian AKI sering dilakukan dalam waktu 24 hingga 72 jam setelah cedera ketika endonuklease paling aktif. . Daftar studi AKI panjang dan mencakup cedera toksik, septik, transplantasi, dan hipoksia. Dalam karya ini, kami mensurvei model, jenis paparan, perawatan, jadwal penilaian, dan jenis sel yang terpengaruh dalam penelitian ini. Studi yang disurvei mencakup mode akut dan campuran akut-kronis dari cedera ginjal dan penyakit ginjal kronis.

Apakah cedera ginjal dengan sinyal TUNEL-positif diamati di tubulus atau glomerulus tergantung pada jenis agen atau penyakit yang merusak. Misalnya, lupus nephritis pada manusia dan kerusakan nanopartikel nikel digambarkan memiliki sinyal positif TUNEL glomerulus [62,63]. Di sisi lain, iskemia-reperfusi dan nefropati diabetik yang diinduksi streptozotocin pada tikus menghasilkan sel TUNEL-positif hanya di tubulus [64,65]. Tubulus proksimal, lengkung Henle, tubulus distal, dan saluran kolektif sering TUNEL-positif dalam model reperfusi iskemia. Sel TUNEL-positif di glomeruli dan tubulus dijelaskan pada tikus yang terpapar obat-obatan seperti siklosporin A [66] dan doxorubicin [67] atau bahan produk konsumen seperti nanopartikel seng oksida [68] dan pada model tikus diabetes mellitus [ 69]. AKI yang diinduksi syok septik pada manusia juga dikaitkan dengan sel TUNEL-positif glomerulus dan tubulus [70]. obstruksi usus halus loop tertutup yang tercekik menyebabkan TUNEL-positif di ginjal dalam 3 jam [87].

AKI dapat terjadi setelah transplantasi dan cedera hipoksia. Penolakan allograft pada manusia umumnya terkait dengan peningkatan sel TUNEL-positif [88,89]. Setelah iskemia dingin, sel TUNEL-positif biasanya diamati dalam 2-24 jam selama reperfusi [90], atau lebih sempit, antara 14 dan 17 jam setelah iskemia [91], dan kadang-kadang kami masih diamati hingga 7 hari dalam penolakan transplantasi [92]. Demikian pula, dalam model iskemia-reperfusi, sel TUNEL-positif paling sering diamati 24 jam setelah reperfusi [44,93,94], atau dalam kisaran antara 4 [95,96] dan 72 jam [97]. Dalam studi transplantasi dan AKI iskemik, sel TUNEL-positif dilokalisasi ke sel epitel tubulus distal dan proksimal [44,93]. di tikusginjalsetelah cedera iskemia-reperfusi, sel TUNEL-positif digambarkan sebagai terkonsentrasi di persimpangan kortikomedullary, target yang biasa dari cedera iskemik [98].

Campuran cedera akut dan kronis, di mana paparan toksik, keadaan penyakit, dan/atau penilaian keduanya akut (yaitu, jam, hari) dan kronis (yaitu, minggu, bulan, tahun) dalam penelitian yang sama, diamati pada transplantasi manusia penolakan (biopsi 1 minggu hingga 3 tahun pasca transplantasi) [88], infeksi virus hepatitis E babi (7 dan 14 hari pasca-inokulasi) [52], stres akibat pneumoperitoneum CO2 pada hidronefrotikginjal(2 minggu hidronefrosis, 2 hari pasca-pneumoperitoneum) [53], glomerulonefritis proliferatif mesangial yang diinduksi oleh bisa ular (1 hingga 14 hari pasca injeksi) [99], obstruksi ureter unilateral (1 hingga 14 hari obstruksi) [100], paparan uranil asetat (1 hingga 28 hari paparan) [101], nefropati asam aristokolat (5 dan 30-hari paparan harian) [102], dan hiperoksia neonatal (diuji 1 hingga 60 hari pascakelahiran, terpapar hiperoksia pertama 14 hari) [103]. Empat belas hari setelah tumbukan adalah titik waktu penilaian yang sangat umum untuk jeniscedera ginjal[52,53,99,101,103]. Dalam sebagian besar kasus, sel TUNEL-positif terlokalisasi di tubulus dan saluran kolektif. Satu-satunya pengecualian adalah toksisitas racun ular, yang terutama merusak glomeruli [99].

Kronisginjalpenyakit (CKD), didefinisikan sebagai adanyaginjalkerusakan atau penurunan laju filtrasi glomerulus (GFR) pada manusia selama lebih dari 3 bulan, juga merupakan subjek umum untuk penilaian TUNEL, yang dapat menentukan apakah CKD dikaitkan dengan penyakit progresif.kerusakan ginjal.CKD yang paling umum dipelajari di mana TUNEL diterapkan adalah nefropati diabetik. Cedera diidentifikasi oleh TUNEL-positif terjadi di tubulus dan podosit [69] pada pasien diabetes dengan onset diabetes sebelum pengujian TUNEL mulai dari 7 sampai 30 tahun [104.105] dan 2 sampai 16 minggu setelah pengobatan streptozotocin pada hewan pengerat [106.107]. Histopatologi TUNEL-positif serupa dilaporkan pada imunoglobulin A nefropati [22]. Pada nefritis lupus dan glomerulonefritis membranoproliferatif, TUNEL-positif terlihat terutama di glomeruli [62.108.109]. Di sisi lain, studi keamanan obat dari cisplatin [110], chloroquine [45], doxorubicin [67], finasteride [23], tacrolimus [111], dan levetiracetam [24] mengamati sebagian besar kerusakan tubular. Demikian juga, cedera akut lanjutan yang diidentifikasi oleh sel tubulus TUNEL-positif dijelaskan dalam studi nefropati asam urat [112], defisiensi metionin [48], paparan racun lingkungan microcystin-LR [50], dan kadmium [113], dan pada hubungan dengan kalsium-oksalat yang diinduksiginjalbatu [114] dan nanopartikel pengapuran [115]. Sementara identifikasi kerusakan ginjal progresif selama CKD dengan menggunakan uji TUNEL adalah alat diagnostik yang berguna, menggabungkan uji TUNEL dengan imunohistokimia (IHC) mungkin akan lebih informatif dalam menentukan mekanisme cedera.

Teknik Kuantifikasi dan Kolokalisasi TUNEL

Metode kuantifikasi TUNEL bervariasi. Di sebagian besar laporan, sel/inti TUNEL-positif dikuantifikasi sebagai persen dari total sel/inti [83.116.117]. Ini tampaknya hal yang benar untuk dilakukan, meskipun jumlah sel TUNEL-positif kemungkinan tidak sesuai dengan jumlah sel mati. Beberapa sel mungkin belum mencapai tingkat fragmentasi DNA yang dapat diidentifikasi, sementara yang lain sudah dapat dieliminasi oleh makrofag. Kuantifikasi jumlah sel TUNEL-positif per unit persegi (mm2) juga digunakan [118], tetapi metode ini tampaknya kurang tepat karena tergantung pada lokasi dan jenis sel isi daerah tersebut. Bagian kortikal sebagian besar mengandung glomeruli, tubulus, pembuluh darah, dan sinar medula, sedangkan bagian meduler terutama mengandung lengkung Henle, saluran pengumpul, dan pembuluh darah. Kuantifikasi "per Fifield" tentu saja tergantung pada bidang apa [72.119], dan kuantifikasi "per bagian", bahkan lebih, tidak terdefinisi [61.120]. Pengukuran yang kurang teridentifikasi, seperti "skor histologis" [121], "indeks apoptosis" [113], "tingkat apoptosis" [92], "persentase apoptosis" [122], atau persentase kontrol yang tidak diobati [123.124], tampaknya bahkan kurang tepat, dan membuat interpretasi sulit dan tidak sebanding dengan sebagian besar studi.

Kematian sel di sel tetangga dimulai secara tidak merata karena tergantung pada vaskularisasi, siklus sel, dan variabel lainnya. Hal ini sering mengakibatkan pewarnaan sel TUNEL yang tidak merata di jaringan [45,96,125]. Anehnya, intensitas umum sinyal TUNEL-positif tidak digunakan untuk pengukuran TUNEL, meskipun secara langsung tergantung pada tingkat fragmentasi DNA. Ini mungkin karena sel dianggap mati terlepas dari intensitas sinyal TUNEL, karena sel tidak dapat "lebih mati" jika pewarnaan TUNEL lebih intens. Meskipun sulit untuk membandingkan penelitian yang menggunakan berbagai metode untuk mengukur hasil TUNEL, jumlah sel TUNEL-positif pada hewan kontrol biasanya di bawah 2 persen [75,99,100,116.126]. Cedera akut dikaitkan dengan ~5-40x peningkatan TUNEL-positif [79.126.127]. Selama cedera kronis, peningkatan sel TUNEL-positif sedikit lebih rendah, ~2–20-kali lipat, [29,43,65] dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati.

Uji TUNEL awal berdasarkan pewarnaan diaminobenzidine (DAB) dirancang untuk mikroskop cahaya [14,15]. Metode tradisional ini masih digunakan dalam dua pertiga dari studi yang disurvei dalam tinjauan ini dan di sebagian besar studi biopsi manusia. Kuantifikasi dilakukan dengan penghitungan sel manual dan, meskipun tepat, memakan waktu. Seringkali, kuantifikasi tidak digunakan sama sekali, dan hasilnya disajikan menggunakan gambar sampel yang dirawat dan diwarnai sebagai bukti sederhana bahwa kematian sel terjadi. Otomatisasi dapat mempercepat proses kuantifikasi [128,129]. Namun, DAB tidak dapat digabungkan dengan pewarnaan lain dalam sampel yang sama, dan dengan demikian TUNEL berbasis DAB hanya dapat memberikan jumlah sel mati, tanpa identifikasi jenis sel (kecuali pengenalan visual) atau mekanisme kematian sel.

Sementara penelitian pada manusia sangat bergantung pada TUNEL berbasis DAB menggunakan mikroskop cahaya, sekitar setengah dari penelitian pada hewan menggunakan mikroskop fluoresen FL (Gambar 3). Fluorescent TUNEL secara visual menarik, mudah ditafsirkan, dan memiliki beberapa keunggulan utama. Selain kuantifikasi yang tepat dengan identifikasi inti TUNEL-positif atau intensitas rata-rata warna, sinyal TUNEL fluoresen FL dapat dilokalisasi dengan warna lain untuk histokimia (misalnya, DAPI) (Gambar 3A) atau IHC (Gambar 3B). Dalam yang terakhir, penggunaan penanda protein dapat membantu mengidentifikasi sinyal positif TUNEL yang terkait dengan yang berbedaginjalkompartemen atau memberikan informasi tentang jenis kematian sel. Kami tidak dapat menemukan contoh TUNEL yang dikombinasikan dengan pewarnaan antibodi IHC ganda. Sementara kombinasi seperti itu akan sangat informatif, misalnya, untuk identifikasi mekanisme kematian sel pada jenis sel tertentu, kesulitan teknis yang terkait dengan pewarnaan tersebut mungkin lebih besar daripada manfaatnya.

Identifikasiginjaljenis sel tentu bukan masalah bagi yang berpengalamanginjalahli patologi [104]. Karena itu, penggunaan penanda tambahan untuk identifikasi tipe sel, misalnya, menggunakan CD31 untuk identifikasi sel endotel [130], jarang terjadi. Namun, penggunaan penanda protein IHC untuk karakterisasi cedera jaringan sering digunakan. Sebagian besar penelitian menggunakan TUNEL-positif sebagai satu-satunya bukti apoptosis. Dalam penelitian lain, pengakuan bahwa TUNEL-positif tidak spesifik untuk apoptosis telah menyebabkan banyak morfologi (misalnya, pewarnaan hematoxylin dan eosin atau asam-Schiff periodik), penanda biokimia, dan IHC untuk digabungkan dengan pewarnaan TUNEL untuk mengkonfirmasi apoptosis. Penanda yang paling umum digunakan untuk caspase-dependent apoptosis adalah cleaved (aktif) caspase-3 dengan menggunakan antibodi yang tidak mengenali caspase ukuran penuh-3 [131.132]. Baik uji TUNEL dan caspase yang dibelah-3 menunjukkan pewarnaan tubuler, bukan glomerulus, pada reperfusi iskemia tikus [64]. Studi caspase lainnya menggunakan caspase-1 [27], -9 [53], -11 [28], dan -12 [75]. Penanda apoptosis lainnya termasuk limfoma sel B 2 (Bcl2) keluarga protein Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49], dan Bad [43]; reseptor apoptosis Fas [52] dan ligan reseptor apoptosis FasL [66]; forkhead box (FOX) faktor transkripsi protein Fox01 [133] dan Fox03 [27]; dan sitokrom c [53]. Peradangan diidentifikasi oleh IHC dari tumor necrosis factor-alpha (TNF) [134]; faktor pertumbuhan tumor TGF [66] dan TGF- 1 [135]; serin/treonin kinase 1 (SGK1) [135]; flavoprotein transfer elektron, subunit beta (ETF ) [136]; Janus kinase-2 (JAK2) [137]; transduser sinyal dan aktivator transkripsi 3 (STAT3) [137]; faktor nuklir penambah rantai ringan kappa sel B teraktivasi (NF-κB) [137] dan protein penghambatnya IκB [137]. Untukginjalpenilaian cedera, molekul cedera ginjal-1 (KIM-1) [24], saluran aquaporin-1 (AQP-1) [45], faktor yang diinduksi hipoksia {{7} }faktor transkripsi alfa (HIF-1 ) [103], pengangkut asam amino tipe Asc-1 (Asc-1) [121], target mamalia rapamycin (mTOR) [131] kinase , dan transglutaminase II [89] digunakan. Cedera ginjal oksidatif dipelajari menggunakan penanda seperti 8-hydroxyguanosine (8OHdG) [102], neutrofil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) [102], NAD-dependent deacetylase sirtuin-1 (SIRT1) [138] , dan heme oksigenase 1 (H2O-1) [90]. Kinase dipelajari secara intensif, termasuk jalur c-Jun N-terminal kinase (JNK) [101], fosfoinositida 3-kinase/protein kinase B/faktor nuklir eritroid 2-faktor terkait 2 faktor transkripsi (PI3K/ Akt/Nrf2) jalur [46], pannexin-1 (PANX1) plasma membran gap junction protein [26], dan mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) [26]. Studi tentang endonuklease apoptosis melibatkan caspase-activated DNase (CAD) [139], DNase I [108], dan EndoG [139], dan penanda kerusakan DNA termasuk tumor protein p53 (p53) [99] dan dynamin-related protein 1 (PARP1). ) [66]. Beberapa penelitian juga menemukan penilaian apoptosis yang dimediasi stres retikulum endoplasma dan cedera jaringan berguna [75].

Mengingat sejumlah besar studi mekanistik yang disurvei dan keuntungan menggabungkan TUNEL dengan penanda IHC untuk identifikasi mekanisme kematian sel, orang akan mengharapkan banyak studi menggunakan kolokalisasi di antara keduanya. Analisis dapat dilakukan dengan kolokalisasi piksel demi piksel antara sel TUNEL-positif dan penanda IHC, intensitas rata-rata penanda IHC di area positif TUNEL, atau intensitas sinyal positif TUNEL di area positif penanda IHC. Sayangnya, keunggulan TUNEL ini hanya digunakan dalam beberapa penelitian. Sel TUNEL-positif dilokalisasi dengan caspase yang dibelah-3 diginjaltubulus selama toksisitas asetaminofen pada tikus [74]. Kolokalisasi IHC dengan sinyal TUNEL-positif memungkinkan identifikasi kematian sel sel mesangial selama nefritis Habu [99]. Dalam mikroskop cahaya, kolokalisasi dengan penanda mekanistik toksisitas dilakukan di bagian serial, seperti yang dilaporkan oleh Ott et al. [89].

Masalah dan Keterbatasan TUNEL

Beberapa potensi masalah dapat terjadi dan harus diantisipasi saat bekerja dengan TUNEL. Salah satunya adalah bahwa 30OH DNA termini terjadi tidak hanya selama kematian sel sebagai akibat dari aksi endonuklease tetapi juga sebagai metabolit antara yang normal di hampir semua reaksi enzimatik dengan DNA. Fungsi sel utama yang menghasilkan 30OH termini adalah sintesis DNA, di mana banyak fragmen Okazaki secara teoritis dapat menghasilkan sinyal TUNEL positif palsu, terutama dalam modifikasi pengujian yang sangat sensitif. Selamacedera ginjal,Perbaikan DNA juga dapat berkontribusi pada sinyal positif TUNEL palsu sebagai akibat dari aksi endonuklease AP. Cedera ginjal oksidatif besar-besaran yang disebabkan oleh cedera kimia (hidrogen peroksida, bleomisin) atau fisik (iradiasi gamma) dapat menambah jumlah ujung 30OH, meningkatkan pembacaan TUNEL positif palsu selain dari fragmentasi DNA yang dimediasi endonuklease.

Lebih sering dan lebih mungkin, kondisi eksperimental reaksi TdT yang tidak diatur dengan benar (waktu, suhu, aktivitas enzimatik, atau kofaktor) dapat menghasilkan latar belakang sinyal positif TUNEL yang ditingkatkan secara artifisial. Meskipun masih belum ditentukan apa yang dianggap sebagai dasar normal untuk sampel jaringan ginjal yang tidak diobati, tampaknya masuk akal bahwa sekitar 1 persen dari total sel akan menjadi jumlah yang masuk akal. Tentu saja, latar belakang 10 persen atau lebih tinggi adalah bukti yang jelas dari kondisi pengujian yang tidak dikarakterisasi dan tidak dimurnikan atau penyimpangan dari kondisi penyimpanan sampel yang sesuai.

Masalah lain yang diharapkan adalah aktivitas DNase I yang rendah pada beberapa jenis sel (misalnya, endotelium),ginjalkompartemen (misalnya, glomeruli), atau jaringan patologis (misalnya, tumor). Sel-sel ini diharapkan menunjukkan kepositifan TUNEL yang rendah, bukan karena mereka tahan terhadap cedera, tetapi karena tidak ada aktivitas endonuklease yang cukup untuk menghasilkan sinyal yang dapat diukur di TUNEL. Dalam pengalaman kami, bahkan perubahan antara {{0}},01 persen dan 0,1 persen sel positif TUNEL dapat signifikan secara statistik dan digunakan sebagai bukti kuat cedera ginjal (jaringan lain).

Akhirnya, masalah dengan kuantifikasi pewarnaan TUNEL muncul ketika jumlah fragmentasi DNA terlalu tinggi, misalnya, pada tahap akhir kematian sel atau cedera intensitas tinggi, di mana DNA yang tersisa tidak dapat diimbangi dengan DAPI karena pembongkaran DNA. heliks ganda (Gambar 3D). Dalam kasus ini, sinyal TUNEL-positif "menggantung di udara", dan tampaknya tidak terkait dengan nukleus. Menjadi tanggung jawab ahli patologi untuk menafsirkan ini sebagai sel TUNEL-positif daripada artefak. Dengan TUNEL berlabel fluoresen, ada bahaya mengidentifikasi autofluoresensi latar belakang dalam jaringan sebagai TUNEL-positif [140]. Dalam kasus ini, direkomendasikan untuk beralih ke TUNEL spektrum merah [51,54].

Pola TUNEL sebagai Sumber Informasi Tambahan

Beberapa pola TUNEL dapat dibedakan dengan jelas dan digunakan untuk menentukan mekanisme potensial dan derajat cedera (Tabel 1, Gambar 3). Biasanya, jenis pola TUNEL nuklei saja dihasilkan oleh cedera ringan, sementara cedera yang lebih kuat (yaitu, paparan yang meningkat) menghasilkan pewarnaan dan disintegrasi yang lebih kuat dari nuklei atau sel. Pola TUNEL yang benar-benar apoptosis adalah fragmentasi nukleus sebagai akibat dari pembentukan badan-badan apoptosis (Gambar 3E). Fragmen kecil dari inti TUNEL-positif, yang kemungkinan merupakan badan apoptosis, terlihat pada reperfusi iskemia tikus pada 24-72 jam [97]. Badan apoptosis juga terlihat dengan pelabelan TUNEL dari inti di epitel tubulus ginjal dan interstitium 14 hari setelah cedera reperfusi iskemia pada tikus [141]. Peningkatan dosis minyak lavender mengurangi pola TUNEL nukleus saja dan mengubahnya menjadi TUNEL seperti nekrosis dengan kebocoran sitoplasma [94]. Yang terakhir adalah hasil dari penghancuran selubung nukleus karena aksi proteinase dan lipase dalam nekrosis. TUNEL sitoplasma (Gambar 3F) terlihat sebagai sitoplasma TUNEL-positif diamati dalam mikroskop cahaya dalam model rhabdomyolysis di tubulus tikus [142] dan dalam podosit yang dikultur dengan adanya glukosa tinggi dan nefropati diabetik pada tikus [135]. TUNEL sitoplasma juga dijelaskan pada iskemia-reperfusi ginjal pada tikus yang menggunakan FL fluorescent TUNEL [98] dan pada reperfusi iskemia pada tikus yang menggunakan mikroskop cahaya [143]. Kerusakan mendalam dan eksklusif yang diinduksi merkuri klorida dengan pewarnaan TUNEL sitoplasma yang kuat menunjukkan kerusakan membran nuklir [60]. Jika cedera berlanjut atau dosis zat perusak meningkat, TUNEL sitoplasma dapat diubah menjadi gambar "berantakan" dari TUNEL yang tersebar (Gambar 3G) yang dikaitkan dengan tahap akhir penghancuran sel karena nekrosis dan tumpahan sitoplasma dan puing-puing seluler. Misalnya, baik TUNEL sitoplasma dan tersebar diamati pada tikus yang diobati dengan cisplatin [71,72] dan tikus [144], dan pada cedera podosit pada tikus diabetes yang diinduksi streptozotocin [145]. TUNEL nekrotik yang tersebar juga diamati selama nefrotoksisitas yang diinduksi uranil asetat pada tikus [101]. Terakhir, variabel sinyal TUNEL lain yang perlu diperhatikan adalah intensitas sinyal TUNEL-positif, yang dapat menyimpang dari sel ke sel tergantung pada jumlah kerusakan (derajat cedera) yang dialami setiap sel, seperti yang didokumentasikan oleh beberapa penelitian [45,96,125] ]. Untuk model di mana intensitas sinyal TUNEL yang bervariasi diamati, kuantifikasi dengan jumlah objek TUNEL-positif dan intensitas rata-rata pewarnaan direkomendasikan.

Kesimpulan

Karena tingginya aktivitas endonuklease apoptosis di ginjal, terutama DNase I dan EndoG, penggunaan TUNEL untukpenelitian dan diagnosis ginjalsangat informatif. Ini mungkin menjadi lebih berguna jika TUNEL diterapkan di luar penggunaan awalnya sebagai metode untuk mengidentifikasi apoptosis. Menerapkan TUNEL secara eksklusif untuk studi apoptosis adalah contoh yang baik tentang bagaimana sains dapat secara tidak sengaja disesatkan oleh metode yang digunakan secara tidak tepat. Meskipun penggunaannya sebagian besar sebagai uji cedera akut, TUNEL dapat berhasil diterapkan untuk menilai AKI dan CKD. Namun, pada CKD, derajat kepositifan TUNEL diharapkan lebih rendah daripada cedera akut. Karena aktivitas endonuklease (terutama, DNase I) jauh lebih tinggi di epitel tubulus daripada di kompartemen ginjal lainnya, cedera pada tubulus ginjal biasanya terlihat lebih menonjol. Namun, cedera glomerulus atau vaskular juga dapat dipelajari menggunakan TUNEL jika cedera benar-benar terjadi di kompartemen ini. Kolokalisasi FL fluorescent TUNEL dengan penanda IHC memungkinkan identifikasi dan asosiasi tipe sel dan mekanisme kematian sel dengan sinyal TUNEL. Kuantifikasi TUNEL dapat menyumbangkan informasi berharga tentang tingkat kematian sel, dan penerapan perangkat lunak analisis gambar dapat sangat berguna dalam hal ini. Mempertimbangkan berbagai pola TUNEL, gambar yang representatif sangat disarankan untuk dibuat dan didemonstrasikan

Sinyal TUNEL yang dianggap positif. Akhirnya, pola TUNEL harus digunakan sebagai sumber informasi tambahan, seperti mekanisme kematian sel dan tingkat toksisitas. Misalnya, membedakan antara badan apoptosis TUNEL-positif, keberadaan sinyal TUNEL sitoplasma, atau pola TUNEL yang tersebar dapat membantu mengidentifikasi sel-sel TUNEL-positif apoptosis vs. nekrotik untuk interpretasi hasil penelitian dan diagnostik yang lebih tepat.

pengobatan gangguan ginjal gairah seksual